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方法論記事

の生理反応を測定します

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DOI:

10.3791/53392

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2016年4月29日

 ,  , 
1Temasek Life Sciences Laboratory, 2Department of Biological Science, National University of Singapore, 3Bioimaging and Biocomputing Facility, Temasek Life Sciences Laboratory, 4Histology and Light Microscopy Core, Gladstone Institutes, 5Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa

この記事について

サマリー

ショウジョウバエの前脚と吻には、味覚感覚ニューロンの豊富なレパートリーが含まれています。ここでは、カルシウムイメージングを使用して、味覚フェロモンの外因性の適用による生きたハエの前脚と吻の感覚ニューロンからの生理学的応答を測定する方法を紹介します。

要約

哺乳類とは異なり、このようなショウジョウバエなどの昆虫は、複数の味覚器官を持っています。脚、吻、翼とショウジョウバエの産卵管上の化学感覚ニューロンは、味覚受容体1,2、イオンチャンネル3-6、揮発性および不揮発性の感覚手がかりの検出に関与するイオンチャネル型受容体7を発現します 。これらのニューロンは、直接、食品、有害物質やフェロモンのような味物質に接触し、したがって、このような給紙、産卵や交配などの多くの複雑な動作に影響を与えます。電極記録とカルシウムイメージングは​​、広くこれらの味物質によって誘発される神経細胞の応答を定量するために、昆虫に使用されてきました。しかし、電気は特殊な装置を必要とし、単一の味感覚子からの測定値を得ることは、細胞型、サイズ、および位置に応じて技術的に困難であることができます。また、 ショウジョウバエにおける単一ニューロン分解能は味の感覚器の侯ので、達成することが困難な場合が化学感覚ニューロンの複数のタイプがSE。ここに記載のライブカルシウムイメージング法は、ライブハエにおける単一味覚ニューロンの応答を測定することができます。この方法は、水性溶媒中で低い溶解度を有する脂質フェロモンおよび他のリガンドタイプのニューロンの応答を画像化するために特に適しています。

概要

動物は生存と繁殖のための本質的な意思決定を媒介するために、嗅覚や味覚情報に依存しています。検出され、神経系によってどのように処理されるか化学感覚手がかり理解することは、感覚受容体（複数可）および対応する化学リガンドの同定を必要とする。 ショウジョウバエは、揮発性および非揮発性化合物の驚異的な多様性を検出し、生理を研究する中で優れたモデルですchemosensationのメカニズム。嗅覚器官が揮発性分子を認識しながら、味覚器官は低揮発性化合物を検出するために特化されます。ここでは、直接、低揮発性、親油性リガンドにキイロショウジョウバエの味覚器官からの神経細胞応答を測定するための方法を提示します。

ハエの味覚器官は前足、口吻、および翼を含みます。 sに応答する感覚器として知られている毛様構造は、味覚器官の表面に分布していますugars、ビター、塩、水およびフェロモン8。感覚子は味の剛毛と味ペグ9に形態学的に分類されています。ロング（L型）に分類されている唇弁上の約31味覚毛、ショート（Sタイプ）と中間（i型）形態があります。糖に生理的に応答する'L'と's'の感覚器家4感覚ニューロン（S細胞）、低塩（L1細胞）、高塩と苦味化合物（L2細胞）と水（Wセル）10 、11。高塩12に他の応答しながら'i'を、低塩と砂糖の両方に応答するそのうちの一つ感覚子家2感覚ニューロンを、。男性の約41味覚感覚器と前足の各々の上に分布し、女性で26感覚器があります。男性と女性の両方のために、脚の中央部に21感覚器、および後肢13で約22感覚器があります。足の味覚感覚器で囲まれた味覚ニューロンはまた、cはL1、L2、WとSタイプにlassified。

単一ニューロンからの電気的活動を測定するための1つの標準的な方法は、イオンの流れを記録するために、細胞外または細胞内の電極を使用します。電極の測定は、神経機能は、 ショウジョウバエの種、蛾、および神経標識のために大規模な遺伝子ツールを欠いているミツバチなどの非モデル生物で研究することを可能にします。しかし、電気生理学的方法は、日常的に、このアプローチを適用し、 ショウジョウバエの味覚感覚器4,13,14の活性を測定するために使用されてきたが、いくつかの技術的な課題を提示します。まず、味の剛毛は形態および空間的な位置に基づいて特定する必要があります。識別されると、電気生理学的測定は、感覚器の小型化、による位置に制限のアクセシビリティ、および毛の味に化学的刺激の制御されたボリュームを適用することの難しさによって妨げことができます。また、感覚器を刺激は、複数の信号を生成することができますニューロンのタイプ15。第二、電気信号​​の検出は、機械的振動や電子機器からのノイズに起因するバックグラウンドノイズによって混乱することができます。誤っ14を使用する場合第三に、先鋭化電極の使用は、フライの準備を損傷する可能性があります。最後に、電気生理学リグを組み立てると、刺激送達、信号記録、及びデータ分析のための特殊な電子部品を必要とし、高価であることができます。

D.でショウジョウバエ 、遺伝的にコードされたツールの利用可能性は、ニューロンの小集団の応答を検討することを可能にする画像化技術の開発が容易になりました。このようなアプローチの1つは、CaLexAレポーター16を使用することです。この方法では、のLexA-VP16転写因子及びカルシウム感受性タンパク質NFATをコードする遺伝子配列が一緒に融合されます。プロテインホスファターゼカルシニューリンのカルシウム活性化は、NFATの脱リン酸化を触媒し、順番に、facilita核へのインポートをTES。核内部に、LexAのドメインは、このように機能的に活性化されたニューロンの持続的な同定を可能にする、緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターの発現を導くLexAop-DNA結合モチーフに特異的に結合します。アプローチは、付臭剤16へのライブハエの暴露後の触角葉における特定の嗅覚糸球体の応答を測定するために成功裏に使用されてきました。最近、IR52c味覚受容体ニューロンの生理学的反応はCaLexA 7を使ってライブハエから測定しました。しかしながら、この研究のために、それは、GFPの転写を増強するために最大6週間齢のハエに必要でした。抗GFP抗体で免疫染色するCaLexA信号をブーストするために使用することができるが、この方法は、このように生細胞イメージングの可能性を排除し、組織の固定を必要とするであろう。

遺伝的にコードされたカルシウム指標タンパク質GCaMPも広範囲の数の神経細胞応答を研究するために使用されてきました種17。タンパク質GCaMPは、神経刺激の前に、低強度で蛍光を発します。刺激の適用は、Ca 2+の流入で、その結果、神経細胞に活動電位をトリガします。 Ca 2+に結合したGCaMPは、それが明るい強度（ 図1）と蛍光を引き起こし、コンフォメーション変化を受けます。最近開発された単一ニューロンカルシウムイメージング法は、前足特定Gr61aの味覚ニューロン18のリガンドとしてグルコースを同定しました。本研究では、Gr61aの味覚ニューロンにおいてGCaMPを発現するトランスジェニックショウジョウバエから解剖前足は、撮像前にアガロースの層で覆われていました。しかしながら、解剖組織の使用は、測定時間と検出感度を制限し、GCaMP発現の最終的荒廃を引き起こすことができます。また、アガロースは、高い蛍光のバックグラウンドレベルとその光散乱特性に対する感度を制限することができます。

TOこれらの欠点のいくつかを解決、我々は前脚と口吻無傷の動物の味覚ニューロンからの生理的反応を記録するGCaMP媒介カルシウムイメージングの使用を記載しています。我々は（3 R、11 Z、19 Z）-3-アセトキシ-11,19-octacosadien -1-オール（CH503）20、 ショウジョウバエの脂質フェロモンに遺伝的にコードされGCaMP5G 19を表現Gr68aとppk23ニューロンの生理学的応答を示します21。ニューロンの応答は、フェロモン刺激時GCaMP5G信号の蛍光の増加を定量することによって測定されます。このプロトコルでは、ニューロンは、個々の細胞内の神経活動のパターンを区別するのに十分である120秒の総持続時間のために結像されます。

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プロトコル

1.試料の調製

  1. UAS-GCaMP5G 19ハエ（; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40 1118ワット ）にGal4の 3,22ドライバーラインを通過。クロスは、25℃で成長させます。
    注：生成は、蛍光シグナル強度を高めるために助けることができるのGal4またはUAS-GCaMP導入遺伝子の複数のコピーに飛びます。 Gr68a-Gal4ドライバーの制御下で発現された場合UAS-GCaMP導入遺伝子（UAS-GCaMP3）の以前のバージョンは、非常に微弱な蛍光強度を示しました。
    1. 収集し、分離セックス新たeclosed大人のハエによって、25℃で引き上げます。
      注：GCaMP5Gの蛍光のベースラインレベルは14から28日の間熟成させハエにおける最適です。性別によってハエを分離することにより、神経応答に影響を与える可能性があり、社会的相互作用の可能性を排除します。
  2. CO 2の穏やかな流れの下でハエを麻酔。
  3. Fを添付最初の0.17ミリメートルのカバースリップの中央にマニキュアの小滴を配置することにより、カバーガラスにLY。静かに明確なマニキュアの降下にその側にフライを配置し、全体の低下はハエで覆われていることを確認してください。
  4. 8X倍率で使用される解剖実体顕微鏡、下の手順1.5と1.6を実行します。
  5. ハエの前肢を拡張するために湿った絵筆を使用してください。第1,5足根のセグメント（ 図2A）の上にテープの2つの薄いストリップを配置することによって所定の位置に前足を固定します。これは、イメージング（ 図2B）のための足根セグメントT2-T4を公開します。
  6. 口先上の画像ニューロンに、唇弁（ 図2C、D）を露出する吻の演壇の上にテープの薄いストリップを配置します。
  7. カバーガラスの表面上を流れるの解決策を防ぐために、PAPペンでフライの周りに疎水性の障壁を描画します。取り付けの30分以内に測定を行います。

刺激の調製溶液

  1. 親油性リガンドを希釈PBST溶液中（例えば、本研究で使用CH503、など）：137のNaCl、2.7ミリモルのKCl、10mMののNa 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4、0.1％トリトンX-100（v / v ）; pHは7.4。
    1. PBSTを用いて、リガンドの1mg / mlの原液を作成します。 PBSTを用いて、原液のすべての後続の希釈液を調製します。
      注：目的のリガンドの溶解性に応じて、異なる溶媒リガンドを溶解するために必要とされ得ます。種々の溶媒中でCH503の溶解度は、 表1に記載されている。他の溶媒と異なり、PBSTで蛍光の増加を生じませんでした。

味覚ニューロンおよび画像取得の3刺激

  1. 10μlのピペッターを使用して、瞼のセグメント上にPBST10μlのを配置します。
    注：このステップは、足を湿らし、漂流から足根セグメントを防ぎます。
  2. suコマンドのカメラを持つ光学系を使用してください高時間分解能に優れた蛍光シグナルを達成するためにfficient速度と感度。
    注：この研究のために我々は（ 材料リストを参照してください）スピニングディスク共焦点顕微鏡とsCMOSカメラを使用していました。
  3. 撮像されるべき特定の瞼板セグメントとニューロンを選択してください。 3刺激前の共焦点Z-スタックを取得します。
    1. 理想的には、まだ全体の細胞容積をキャプチャしながら、最大の時間分解能を可能にするのに十分に高速で取得設定を使用します。例取得設定は次のとおりです。200ミリ秒露出、2秒ごとに撮影し、×2 2と6×0.5μmの2光学切片をビニング。
      注：固定化された脚はGCaMP信号の識別可能な漂白で、30秒間隔で、最大10分間正常に撮像されています。長時間録画のために、脚はカバースリップ上の所定の位置に非常に強固に保持されていることを確認してください。
    2. 最高の信号対雑音全体IMA中に最小限の光退色で達成するためのレーザパワーを最適化します政権を銀杏。ここで説明する実験のために、脚と口吻にGr68aとppk23味覚ニューロンの両方を撮像するための30％の送信時に491 nmのダイオードレーザー（100ミリワット）を使用します。まだ十分な空間分解能を達成しながら、より短い露光時間を可能にするために2×2ビニングを使用してください。
      注：レーザパワー設定値が1.2〜4.5の倍の増加の範囲の蛍光変化の検出を可能にするように最適化しました。
  4. ピペット瞼のセグメントへの刺激溶液10μl。対照実験のために、PBSTの別の10μlを添加します。すぐに117刺激後の画像を取得します。
    注：取得された刺激後画像の数は、蛍光の最大変化が達成された時間（約2分）に基づいています。
    1. 重要なステップ：これは前脚が所定の位置から移動しますので、準備にソリューションをピペット一方で、ピペットチップでフライに触れることはありません。
      注：別の方法として、使用正確に結像される瞼のセグメントに近い刺激を含むガラスキャピラリーを配置するマイクロマニピュレーター。製造元の指示に従って、細胞内マイクロインジェクションディスペンサーを使用して、刺激の制御されたボリュームを提供します。

4.画像処理と解析：応答の定量

  1. フィジー（用いた共焦点Z-スタックの一連開きhttp://fiji.sc/Fiji ）23またはImageJの（ http://imagej.nih.gov/ij/ ）24画像解析および処理ソフトウェアを。
  2. 120の時点のそれぞれについて、すべての6つのZスライスの和強度投影を行います。
    1. 「イメージ」の下の「スタック」オプションを選択します。さらに、「Z投影」オプションを選択し、開始スライスとストップスライスとして「4」と「1」を入力します。投射型の場合は、Rを選択20;和スライスすべての時間枠」をプルダウンメニューから、とは選択します ""。
  3. 細胞体または神経突起の周りに境界線を描くようにフリーハンド選択ツールを使用して、関心領域（ROI）を定義します。 「分析」ラベルをクリックし、「ツール」の「ROIマネージャー」オプションを選択します。
  4. 「分析」メニューとの統合密度、面積、平均値、最大グレー値とラベルのボックスをチェックの下、「測定値の設定」オプションを選択することにより、ROIの蛍光を定量化します。そして、ROIマネージャのメニューの下の「詳細」オプションを選択し、さらに「マルチ測定」オプションを選択します。
    注：これは、選択した各パラメータの値を持つポップアップボックスを生成します。
  5. ピクセルのいずれも（16ビットカメラ用に例えば 、65535）飽和状態に達していないことを確認するために、最大グレー値を確認してください。
    注：トンに示す実験について彼の論文は、応答はΔF/ Fの最大増加が観察された場所に応じて、細胞体または神経細胞の突起のいずれかから測定しました。
  6. 時刻tでの蛍光の最大相対変化（ΔF/ F）を計算し 、次のとおりです。
    figure-protocol-1
    1. 各F（セル）の値からバックグラウンド蛍光を引きます。バックグラウンド蛍光を定量化するために、検出可能なニューロンを欠い前足（または吻）の領域から同等のサイズと形状のROIの統合密度を測定。
    2. 刺激後の蛍光を定量化するために、F（セル）T、時点における細胞体またはプロセスのROIの集積密度を測定し、「T」刺激後。
    3. 予備刺激蛍光、F（細胞）、T = 0を定量化するために、同様に細胞体または工程の前刺激画像を解析ポスト刺激信号。 F（セル） トン = 0を決定するために3つの画像の平均統合密度を使用してください。

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結果

GCaMPのカルシウム指示薬を遺伝子Gr68a-GAL4またはppk23-Gal4のドライバを使用して発現させました。前脚の神経細胞および非神経支持細胞の異なる集団は、各ドライバ（ 図3A-C）によって標識されています。親油性フェロモンCH503へのリガンド特異的応答はGr68a-GAL4とGCaMP（ 図3D）を発現ppk23-Gal4の細胞で観察されました。 GCaMP5G信号（ΔF/ F）の蛍光強度の相対変化とCH503のより高い濃度（ 図3E）と増加しました。興味深いことに、CH503の5 ngの用量は、神経応答を抑制することができます。

Gr68aとppk23ニューロンは異なる応答パターンを示しました。 ppk23ニューロンは相性、振動応答（ 図3G）を示したのに対し、Gr68aニューロンは、ニューロンの応答（ 図3F）

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ディスカッション

ここでは2つの異なる感覚器官にショウジョウバエ末梢ニューロンのライブカルシウムイメージングを実行する方法について説明します。 Ca 2+が CH503は、用量依存的かつ定量的であったフェロモンリガンドによって誘導されるGr68a-ニューロンにおけるGCaMP蛍光応答を-evoked。このような相性や強壮剤応答など、さまざまな神経応答パターンを識別することも可能でした。

一過性応答を示すニューロンの連続刺激に対して迅速な適応を可能にすると考えられています。反応のこのタイプは、臭気検出25とリズム運動活動パターン26の発生と関連しています。対照的に、多くの感覚系に記載されている神経の振動は、単一のシナプス部位に複数の入力を同期させるようにし、刺激27に関する特定の機能を伝達すると考えられています。 ppk23ニューロンに関連した振動の分子的基礎はまだ私達のKNに、報告されていませんowledge。振動応答を示す興奮性細胞の他のタイプでは、振動の周波数は、カルシウム誘発性カルシウム放...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益は存在しないと宣言する。

謝辞

この研究は、シンガポール国立研究財団(JYYにNRF-RF2010-06を助成)の支援を受けました。

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材料

53
この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Gr68A-Gal4H. Amrein (テキサス A&M Health Science Center、テキサス州、米国)およびJ.カールソン(イェール大学、コネチカット州、米国)
ppk23-Gal4K.スコット(カリフォルニア大学、バークレー、カリフォルニア州、米国)
UAS-GCaMP5 42037ブルーミントンショウジョウバエ ストック
センター0.17mmカバースリップ(ゴールドシールカバースリップ)電子顕微鏡サービス63790-10
マニキュア、「ハード・アズ・ネイルズ・クリア」 サリー・ハンセン
PAPペンシグマ・アルドリッチ 
ペイントブラシ先端細ブラシ
テープ スコッチブランド
トリトン X-100シグマ・アルドリッチ 13021
エタノール、ラボグレードメルク10094
ヘキサン、HPLC グレードSigma-Aldrich H303SK-4
DMSOシグマ・アルドリッチ 
プロトコールセクション
、Mori et al.、2010
C11578-22U
顕微鏡 (Ti-Eclipse)ニコンNi-E
スピニングディスクスキャンヘッド 横河CSU-X1-A1
Aquistion Software (MetaMorph Premier)Molecular Devices40002
Fiji softwareopen sourcehttp://fiji.sc/Fiji
Z377821472301CH0Synthesisに記載されているPBSTレシピsCMOSカメラ(ORCA Flash4.0)浜松 電機

参考文献

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