ショウジョウバエの前脚と吻には、味覚感覚ニューロンの豊富なレパートリーが含まれています。ここでは、カルシウムイメージングを使用して、味覚フェロモンの外因性の適用による生きたハエの前脚と吻の感覚ニューロンからの生理学的応答を測定する方法を紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
哺乳類とは異なり、このようなショウジョウバエなどの昆虫は、複数の味覚器官を持っています。脚、吻、翼とショウジョウバエの産卵管上の化学感覚ニューロンは、味覚受容体1,2、イオンチャンネル3-6、揮発性および不揮発性の感覚手がかりの検出に関与するイオンチャネル型受容体7を発現します 。これらのニューロンは、直接、食品、有害物質やフェロモンのような味物質に接触し、したがって、このような給紙、産卵や交配などの多くの複雑な動作に影響を与えます。電極記録とカルシウムイメージングは、広くこれらの味物質によって誘発される神経細胞の応答を定量するために、昆虫に使用されてきました。しかし、電気は特殊な装置を必要とし、単一の味感覚子からの測定値を得ることは、細胞型、サイズ、および位置に応じて技術的に困難であることができます。また、 ショウジョウバエにおける単一ニューロン分解能は味の感覚器の侯ので、達成することが困難な場合が化学感覚ニューロンの複数のタイプがSE。ここに記載のライブカルシウムイメージング法は、ライブハエにおける単一味覚ニューロンの応答を測定することができます。この方法は、水性溶媒中で低い溶解度を有する脂質フェロモンおよび他のリガンドタイプのニューロンの応答を画像化するために特に適しています。
概要
動物は生存と繁殖のための本質的な意思決定を媒介するために、嗅覚や味覚情報に依存しています。検出され、神経系によってどのように処理されるか化学感覚手がかり理解することは、感覚受容体（複数可）および対応する化学リガンドの同定を必要とする。 ショウジョウバエは、揮発性および非揮発性化合物の驚異的な多様性を検出し、生理を研究する中で優れたモデルですchemosensationのメカニズム。嗅覚器官が揮発性分子を認識しながら、味覚器官は低揮発性化合物を検出するために特化されます。ここでは、直接、低揮発性、親油性リガンドにキイロショウジョウバエの味覚器官からの神経細胞応答を測定するための方法を提示します。
ハエの味覚器官は前足、口吻、および翼を含みます。 sに応答する感覚器として知られている毛様構造は、味覚器官の表面に分布していますugars、ビター、塩、水およびフェロモン8。感覚子は味の剛毛と味ペグ9に形態学的に分類されています。ロング（L型）に分類されている唇弁上の約31味覚毛、ショート（Sタイプ）と中間（i型）形態があります。糖に生理的に応答する'L'と's'の感覚器家4感覚ニューロン（S細胞）、低塩（L1細胞）、高塩と苦味化合物（L2細胞）と水（Wセル）10 、11。高塩12に他の応答しながら'i'を、低塩と砂....
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プロトコル
1.試料の調製
- UAS-GCaMP5G 19ハエ（; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40 1118ワット ）にGal4の 3,22ドライバーラインを通過。クロスは、25℃で成長させます。
注：生成は、蛍光シグナル強度を高めるために助けることができるのGal4またはUAS-GCaMP導入遺伝子の複数のコピーに飛びます。 Gr68a-Gal4ドライバーの制御下で発現された場合UAS-GCaMP導入遺伝子（UAS-GCaMP3）の以前のバージョンは、非常に微弱な蛍光強度を示しました。- 収集し、分離セックス新たeclosed大人のハエによって、25℃で引き上げます。
注：GCaMP5Gの蛍光のベースラインレベルは14から28日の間熟成させハエにおける最適です。性別によってハエを分離することにより、神経応答に影響を与える可能性があり、社会的相互作用の可能性を排除します。
- 収集し、分離セックス新たeclosed大人のハエによって、25℃で引き上げます。
- CO 2の穏やかな流れの下でハエを麻酔。
- Fを添付最初の0.17ミリメートルのカバースリップの中央にマニキュアの小滴を配置することにより、カバーガラスにLY。静かに明確なマニキュアの降下にその側にフライ....
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結果
GCaMPのカルシウム指示薬を遺伝子Gr68a-GAL4またはppk23-Gal4のドライバを使用して発現させました。前脚の神経細胞および非神経支持細胞の異なる集団は、各ドライバ（ 図3A-C）によって標識されています。親油性フェロモンCH503へのリガンド特異的応答はGr68a-GAL4とGCaMP（ 図3D）を発現ppk23-Gal4の細胞で観察されました。 GCaMP5G信号（ΔF/ F）の蛍光強度の相対変化とCH503のより高い濃度（ 図3E）と増加しました。興味深いことに、CH503の5 ngの用量は、神経応答を抑制することができます。
Gr68aとppk23ニューロンは異なる応答パターンを示しました。 ppk23ニューロンは相性、振動応答（ 図3G）を示したのに対し、Gr68aニューロンは、ニューロンの応答（ 図3F）
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ディスカッション
ここでは2つの異なる感覚器官にショウジョウバエ末梢ニューロンのライブカルシウムイメージングを実行する方法について説明します。 Ca 2+が CH503は、用量依存的かつ定量的であったフェロモンリガンドによって誘導されるGr68a-ニューロンにおけるGCaMP蛍光応答を-evoked。このような相性や強壮剤応答など、さまざまな神経応答パターンを識別することも可能でした。
一過性応答を示すニューロンの連続刺激に対して迅速な適応を可能にすると考えられています。反応のこのタイプは、臭気検出25とリズム運動活動パターン26の発生と関連しています。対照的に、多くの感覚系に記載されている神経の振動は、単一のシナプス部位に複数の入力を同期させるようにし、刺激27に関する特定の機能を伝達すると考えられています。 ppk23ニューロンに関連した振動の分子的基礎はまだ私達のKNに、報告されていませんowledge。振動応答を示す興奮性細胞の他のタイプでは、振動の周波数は、カルシウム誘発性カルシウム放.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益は存在しないと宣言する。
謝辞
この研究は、シンガポール国立研究財団(JYYにNRF-RF2010-06を助成)の支援を受けました。
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材料
53
Z377821472301CH0Synthesisに記載されているPBSTレシピsCMOSカメラ(ORCA Flash4.0)浜松 電機
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Gr68A-Gal4 | H. Amrein (テキサス A&M Health Science Center、テキサス州、米国)およびJ.カールソン(イェール大学、コネチカット州、米国) | ||
| ppk23-Gal4 | K.スコット(カリフォルニア大学、バークレー、カリフォルニア州、米国) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | ブルーミントンショウジョウバエ ストック | |
| センター0.17mmカバースリップ(ゴールドシールカバースリップ) | 電子顕微鏡サービス | 63790-10 | |
| マニキュア、「ハード・アズ・ネイルズ・クリア」 | サリー・ハンセン | ||
| PAPペン | シグマ・アルドリッチ | ||
| ペイントブラシ | 先端細ブラシ | ||
| テープ | スコッチブランド | ||
| トリトン X-100 | シグマ・アルドリッチ | 13021 | |
| エタノール、ラボグレード | メルク | 10094 | |
| ヘキサン、HPLC グレード | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | シグマ・アルドリッチ | ||
| プロトコールセクション | |||
| 、Mori et al.、2010 | |||
| C11578-22U | |||
| 顕微鏡 (Ti-Eclipse) | ニコン | Ni-E | |
| スピニングディスクスキャンヘッド | 横河 | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
参考文献
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol.
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再版と許可
