油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム

サマリー

この原稿は、油中水型エマルジョンに基づく疎水性顔料と水溶性タンパク質を組み立てるための単純かつ高スループットの方法が記載されています。私たちは、Eで表したアブラナ属植物の組換え水溶性クロロフィル結合タンパク質（WSCPs）の4種類でネイティブクロロフィルの組み立て方法の有効性を実証します大腸菌 。

要約

クロロフィル（Chl類）およびバクテリオ（Bchl類）は光合成集光と電子輸送を行う主要な補因子です。これらの機能は、批判的に大規模と精巧なマルチサブユニット膜貫通タンパク質複合体内での特定の組織に依存します。これらの複合体は、太陽エネルギーの変換を促進する方法を分子レベルで理解するためには、蛋白質顔料、および顔料色素相互作用、励起ダイナミクスへの影響を理解することが不可欠です。このような理解を得る一つの方法は、単純な水溶性組換えタンパク質とChl類の複合体を構築し、研究することによってです。しかし、水溶性タンパク質に親油性Chl類及びBchl類を組み込むことは困難です。また、疎水性の顔料と水溶性タンパク質のアセンブリのために使用することができない一般的な方法は存在しません。ここでは、お尻を可能にする、油中水型エマルジョンに基づく単純かつ高スループットのシステムを示します疎水性のChl類と水溶性タンパク質のembly。新しい方法は、クロロフィルとアブラナ科植物 （WSCP）の水溶性クロロフィル結合タンパク質の組換え型を組み立てることによって検証されました。私たちは、クロロフィルの成功アセンブリをE.を表現WSCPの使用して粗溶解物を実証します新規な水溶性のクロロフィル結合タンパク質のための、およびクロロフィル-タンパク質相互作用及び組立プロセスの研究のための遺伝子スクリーニングシステムを開発するために使用することができる大腸菌細胞。

概要

このようなクロロフィル（Chl類）、バクテリオ（Bchl類）およびカロテノイドのような疎水性顔料は、電子輸送、及び光エネルギーの取り込みと転送を行う光合成反応中心と集光性タンパク質中の主要な補因子です。反応中心およびCH1結合集光複合体の大部分は膜貫通タンパク質です。非酸素発生型光合成緑色硫黄細菌^1,2のFenna-マシューズ-オルソン（FMO）タンパク質、および渦鞭毛藻類³のペリジニン-クロロフィルタンパク質（PCP）は、水溶性の集光タンパク質の例外的な例です。水溶性クロロフィル結合タンパク質（WSCPs） アブラナ科 、 タデ 、 アカザ科のとヒユ科の植物は^4、5は、別^のユニークな例であり、まだFMOとPCPとは対照的に、これらは、光の収穫にも主要な光合成反応のいずれかの中にも関与しています、およびそれらの正確なPHYsiological機能はまだ^5-8不明です。彼らの高クロロフィル結合親和性はChl類及びクロロフィル誘導体の^9,10の一過性の担体として示唆された機能につながっています。あるいは、WSCPが損傷を受けた細胞内でChl類を捕捉する役割を果たし、クロロフィルによって誘発される光酸化損傷^7,11-13から保護するという仮説が立てられました。最近では、それはプロテアーゼ阻害剤....

プロトコル

1.準備クロロフィル株価ソリューション

1. 重要なステップ：光損傷を最小限にするために、化学フードで、緑色光（520 nm）の下や暗所でのクロロフィルの準備のすべての手順を実行します。必ず、ストレージ用の顔料を凍結する前に、窒素またはアルゴンを追加します。全ての溶媒は分析グレードであることを確認してください。
2. チラコイド膜にのみクロロフィルaを含有する凍結乾燥スピルリナプラテンシス細胞または他のシアノバクテリア細胞の約5mgを秤量し、乳鉢と乳棒を使用してそれをつぶします。
3. 負荷は、ガラスカラム上に細胞を破砕し、カロテノイドを除去するために約50〜100mlの％アセトンので洗います。溶出グリーン/オレンジ部分を破棄します。
   注：オレンジ画分を100mlのアセトンで溶出されていない場合には、緑色の画分が溶出し始めるまでアセトンで細胞を洗浄し続けます。
4. 100％のメタノールを使用してExchangeアセトンとクロロフィルaを含む緑色画分を収集します。溶出したFRACTの体積イオン50-100 mlの間で変化してもよいです。初めに、溶出画分を溶出の終わりに薄緑色に変化する暗緑色を持っています。溶出画分の色は薄緑色に変わったら溶出を停止します。
5. 抽出物が完全に乾燥するまでロータリーエバポレーターを用いてメタノールを蒸発させます。この溶液に熱を加えないでください。エバポレーターの水浴温度が30℃を超えないよ....

結果

組換えWSCPアポタンパク質は、前のセクションで説明したプロトコルに従って、W / Oエマルション中のクロロフィルAを用いて組み立てました。プロトコルは純粋WSCPs、または溶解物大腸菌細胞WSCPを過剰発現する（ 図1）のいずれかを含有する水相を用いて実施されました。プロトコルは速く、簡単で、組織ホモジナイザーを除き、特別な装置を必要としません。

クロロフィルの吸光度およびCDスペクトルは、4組換えWSCPの変異体、すなわちRshWSCP、CaWSCP、BoWSCPとLvWSCPの複合体は^、これらは、それぞれのネイティブ複合体^10,18の以前に報告されたスペクトルとバンドの形状や位置が類似している。図2に示します。 ^19。これらの結果は、W / Oエマルション系で再構成WSCP /ク.......

ディスカッション

私たちの目標は、疎水性の顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質の組み立てのための新しい一般的なシステムを開発することでした。ここでは、W / Oエマルションに基づいて、新たな再構成システムは、組換えE.で表現芽キャベツ、カリフラワー、わさびとバージニアpepperweedからWSCPアポタンパク質のアセンブリのために働くことが証明の一般的なアプローチであることが示されています大腸菌 。ここでの結果は、クロロフィルの10倍モル過剰のWSCPの1ミリグラムの再構成から提示されています。しかし、再構成は、別のクロロフィル/タンパク質のモル比についてWSCPのより低い濃度を使用することも可能です。私たちは、W / Oエマルションに組み立てることができたタンパク質の最小量は、タンパク質の比に顔料が5ごとに異なる​​可能性がありながら、100μgのだった：1と20：1まで。また、水相の体積を50μlまで下げることができます。本研究ではクロロフィルAとWSCPのアセンブリが提示されています。しかし、組み立てることも可能です他の疎水性Chl類、Bchl類及びその誘導体とWSCP。現在、我々はそのよう.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
鉱物油	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges	Bio Rad	10011164	ネイティブシーケンスによる WSCP 精製用アフィニティークロマトグラフィー。
His Trap HF column	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	を用いたWSCP精製用アフィニティークロマトグラフィー
	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	クロロフィル精製用クロマトグラフィー担体

His-tag DEAE Sepharose Fast Flow