可溶性タバコの煙抽出物によって損傷した後のマウス間葉系幹細胞の移動の変化を検出するために創傷スクラッチアッセイの最適化

サマリー

移動能力は、間葉系間質細胞(MSC)を含む多くの異なる細胞タイプの重要な機能です。しかし、被害後の回遊能力の変化を定量化することは困難です。このプロトコルは、損傷後のMSC遊走能力の変化を定量化するために厳密な統計を使用する、容易に適応可能な遊走アッセイを説明しています。

要約

細胞の移動は、組織の発達、修復、再生、癌の転移、炎症反応など、多くの生理学的および病理学的プロセスにとって不可欠です。組織修復の媒介における間葉系間質細胞の役割に対する現在の関心を考えると、これらの細胞の遊走能力を定量化し、損傷後に遊走能力がどのように変化するかを理解することに関心があります。カスタマイズが容易で、費用対効果が高い厳密な定量的遊走アッセイの最適化は、さまざまな刺激に応答した細胞遊走の変化に関する質問に答えるための鍵です。スクラッチアッセイ、トランスウェル遊走アッセイ(ボイデンチャンバー)、マイクロピラーアレイ、細胞排除ゾーンアッセイなど、細胞遊走を定量するための現在の方法には、再現性、カスタマイズ性、定量性、および費用対効果にさまざまな制限があります。スクラッチアッセイは、その顕著な使用にもかかわらず、細胞微小環境の損傷、細胞遊走の障害、隣接する老化細胞の影響、細胞増殖に関連する再現性の問題、および厳密な定量の欠如によって混乱しています。ここで説明する最適化されたスクラッチアッセイは、堅牢な結果、定量化可能な画像ベースの分析機能、費用対効果、および他のアプリケーションへの適応性を示しています。

概要

細胞移動は、組織開発、修理、再生、ならびにがんの転移や動脈硬化^1と病理学的過程として多くの生理学的プロセスに非常に協調的かつ不可欠です。細胞遊走の理解は、損傷を受けた組織を修復し、細胞移植技術と^{2グラフト}人工組織などの病理学的状態を治療するために使用される新規治療薬に特に関連します。厳密に、定量化適応可能で、かつコスト効率が重要であるアッセイを用いてこれらの細胞の遊走能を定量化する、組織修復^{3の媒介における}間葉系間質細胞（MSC）の役割現在の関心を考えます。重要なことは、このようなアッセイは、損傷後の細胞遊走能が比較的微妙な変化を検出するのに十分な感度でなければなりません。スクラッチアッセイ、トランスウェル遊走アッセイ（ボイデンCH含む細胞遊走を定量するための現在の方法は、琥珀）、マイクロピラーアレイ、および細胞排他ゾーンアッセイは再現性、カスタマイズ、定量化、および費用対効果^1,4,5の制限の範囲を有します。ここで説明する最適化されたスクラッチアッセイは堅牢な成果、定量化、および画像ベースの解析機能、費用対効果、および他のアプリケーションへの適応性を示しています。

スクラッチアッセイは、種々の実験条件⁵下で細胞の遊走および増殖を評価するために、複数の容量で使用されてきました。アッセイは、またはそれに近い合流を完了するためにそれらを成長、指定された細胞を播種し、滅菌針またはピペットチップ⁶と、得られた単層を傷つけ伴います。分析は、最も一般的に、ランダムに選択された位置^7-9における複数の時点にわたるスクラッチの幅を比較することによって行われます。その顕著な使用にもかかわらず、スクラッチアッセイは、再現性と定量化の問題によって混乱されます。変動でスクラッチの発生だけでなく、細胞の微小環境を変化させるだけでなく、プレート表面とその下の細胞外マトリックス^{5を損傷する}ことによって細胞遊走を阻害することができます。アッセイは、しばしば12時間に7にわたって実施されている、しかし、より遅い移行と長い分析時間を表示する細胞株について、増殖が交絡変数^7,10になります。最後に、スクラッチ・プロセスによって生成された老化細胞は、単層^1のギャップを埋めるために必要な細胞外シグナル伝達を妨害因子を放出することができます。スクラッチアッセイの最適化は、アッセイ時間の長さを最小にし、操作中の望ましくない細胞死を防止、表面特性を妨害しない一貫したギャップの生成を必要とします。ストッパーベースのアッセイは、細胞の除外ゾーンアッセイの最適化です。このアッセイは、細胞増殖を除外ウェルの中央に配置されたストッパを利用するが、細胞が中央排除区域の周囲にメッキされることを可能にします。移行を評価するために、ストッパーを除去し、得られた排他ゾーンは、移行が発生するための表面を提供します。しかし、このアッセイは^{、10のカスタマイズ}又は適合させることが困難であり、いくつかの用途のために、この技術はまた、法外な費用がかかることができます。

スクラッチアッセイおよびその誘導体、トランスウェル遊走アッセイ（またはボイデンチャンバーアッセイ）とは対照的に走化性剤^{8,11を含む}チャンバ内に、微孔性ろ過膜を介して、一方のチャンバから移動する細胞の数を定量化することによって、マイグレーションを評価します^{、 12。}多孔質膜を介した移行後、細胞は走化性薬剤に暴露された膜面に付着し、正確に定量化することは難しいことができますので、この技術は、MSCのような接着細胞のための有用性を制限しています。アッセイは、いくつかの三次元の移動パターンを検査することができるが、制限された細胞型はれる正確細胞移動の制限その有用性を定量化することができ^、10。スクラッチアッセイの別の方法としては、変形し、代理として配列中に移行する細胞の能力を用いて3次元空間を介して細胞運動性を測定したマイクロピラーアレイを使用しています。 Polydimethlysiloxane（PDMS）エラストマーは、精密金型の上に硬化させ、オゾンで処理し、フィブロネクチンは、均質で非分解性微小環境を生成します。 ^アレイ 4 ^{を入力する}細胞の能力を測定するために、必要に応じてマイクロピラーの間隔も変化させることができます。金型は、高アスペクト比の^アレイ 13の負のバージョンを作成するために、シリコンウエハの深い反応性イオンエッチングを使用して作成されます。アッセイは、そのカスタマイズによって強化されている間、移動細胞の直接可視化を介して三次元の移行、および分析をモデル化する能力は、マイクロピラーのアレイを作成する際の難しさは、経済的にその普及を妨げます。

このプロトコルで説明最適化されたスクラッチアッセイは、効率的な、COSを提供自由に利用可能なソフトウェアを用いて分析することができる一貫した傷を製造するためのT-有効な方法。代わりに、細胞移動の前後にスクラッチを介して行われる単純な幅の測定、ソフトウェアは、移行前と後の合計スクラッチ領域を決定することを可能にします。この進歩は、傷が幅測定が行われるべき場所を決定しようとしているの発行を制限し、傷の幅はそれの長さに沿って均一であるかどうか。また、細胞数、細胞の種類と合流し、細胞にダメージの程度の注意深い最適化がさらに分析を最適化するために議論されています。

プロトコル

注：この研究では、遠位の肺組織からの肺の間葉系幹細胞（LR-MSCを）を単離のいずれかの細胞表面マーカーの発現（CD45の^陰性 、CD31の^{NEG、SCA-1高} 、のEpCAM ^NEG）14,15に基づいて、使用していましたアウト・成長¹⁶植片、または酵素消化^17を使用 。接着LR-MSCは、高グルコース無グルタミン、15％FBS、1×抗生物質/抗真菌剤、および2mMグルタミン（以下、完全培地）を含むDMEM中で培養し、37℃、5％CO ₂でインキュベートしました。 LR-MSCは移動アッセイのために、比較的均一な増殖特性を有する細胞の集団を確保するために3~4回継代しました。

コンフルエント単層の準備1

1. 標準の100mm培養皿からMSCを取り外すには、37℃で予め温めておいた10mlのPBSで細胞を洗浄、PBSを吸引し、トリプシンの4ミリリットル（0.25％）を追加します。 37℃のインキュベーター中で3-5分間インキュベート。 Cを吸引5分がダウン細胞ペレットにするための円錐管にellsは、300gで完全なメディアや遠心分離機の同等のボリュームを追加します。
   注：トリプシンでのより長いインキュベーションは、細胞表面受容体を変化させ、潜在的に移行に影響を与えることができます。
2. 培地を吸引し、新鮮な完全培地中に再懸濁細胞。トリパンブルー排除を用いて死細胞を除くと60ミリメートルの細胞培養皿上の完全培地4mlの500,000間葉系幹細胞をプレート、細胞をカウントします。
   注：細胞の供給源に依存して、テストが必要な細胞の最適な数を決定する必要があるかもしれません。
3. プレートは、最適な細胞の付着および増殖のための90％コンフルエント、MSCのために通常48〜72時間になるまで細胞をインキュベートします。
   注：多くの足場依存性細胞は、その遊走能を変更することができる接触阻害を経験するので、100％のコンフルエンスは、推奨されません。画像解析ソフトウェアは、ギャップを解釈するので、80％未満のコンフルエンスでプレートを使用できない写真になりますスクラッチの周囲の一部として、細胞間のS（ 図1Dを参照してください ）。
4. 細胞が90％コンフルエンスに達した後は、アプリケーションに応じて細胞を損傷。可溶性タバコの煙抽出物（CSE）への曝露後の細胞損傷を評価するために、2分¹⁸以上の吸引ビン内の完全培地25ミリリットル1〜ケンタッキー大学の研究タバコ（3R4F）から煙を描画することにより、100％のCSEを生成します。
5. 完全培地中で希釈した4ミリリットル1〜4％のCSEで24時間細胞をインキュベートします。インキュベーション後、4ミリリットル新鮮な完全培地と交換する前に、暖かい滅菌PBS 4mlで細胞を2回洗浄します。
   注：タバコ煙抽出物の高濃度の損なう細胞（> 5％）は、実質的に合流を低減することができます。

2.スクラッチの作成

1. 無菌環境では、損傷したMSCの60ミリメートルプレートからふたを削除し、ストレートエッジを築く（例えば滅菌済みプラスチック定規）交流ロスプレートの上部リム。メディアを削除せずに、約5mm離れてプレート全体で1個から4個の並列傷や長い50ミリメートルを作るために、無菌のストレートエッジによって導かれた無菌の200μlのピペットチップを使用しています。
   注意：ストレートエッジは、顕微鏡のステージ上にあるときプレートに必要な回転の調整の量を最小限に抑えることができます。それは傷が画面上に完全に垂直（または水平）表示されることが不可欠です。 60 mmのプレートに複数の傷を生成する細胞移動を（データは示していない）に影響を与えるように微小環境を変化させないが、他の細胞タイプを考慮してもよいです。ウェルの縁の近くに増殖する細胞の変動がより顕著になり、傷の均一な世代に影響を与える可能性があるため、より小さい井戸の使用が推奨されていません。
2. 培地を吸引し、穏やかに傷の中心に付着する細胞を防ぐために、予め温めた完全培地2mlでプレートを洗浄し、細胞を除去するためにスクラッチによって緩めてきたの。新鮮な完全培地4mlで交換してください。
3. 無菌の永久的なマーカーを使用して、傷を画像化すると干渉しない位置でプレートの下に1-4からの各スクラッチラベルを付けます。
   注：スクラッチ幅にばらつきがある場合もありますので、それは、同じスクラッチからの画像が前と移行後に比較することが重要です。

3.スクラッチの初期画像を撮影

注：スクラッチアッセイは複数のプレート上で実行されている場合、それは傷が次のプレートの上に作られています前に、単一のプレート上のすべての傷の初期画像が取られることをお勧めします。

1. 分析に必要な画像を生成するカメラで倒立位相差顕微鏡を使用します。
2. 顕微鏡上で培養プレートを置き、スクラッチ＃1を見つけるために、低消費電力の目標（10倍）を使用します。培養プレートの蓋に結露が明確IMAGを妨害した場合細胞のeは、37℃に加熱されたステージセットを使用します。
3. 完全に水平方向と視野の中心にスクラッチを維持、傷の長さの90％を包含することを必要な限り多くの画像を得ます。画像間の重複がないとスクラッチの異なる部分の画像を取得します。
   注：培養皿の縁で光の屈折が分析するためにそれらを不可能に、画像をover​​exposes。そのため、傷の長さの最初と最後の5％から画像を取ることはありません。
4. 別のフォルダに各一から画像を保存します。
5. 繰り返し傷2、3のための3.2から3.4、および手順4。
6. すぐに最初の画像の後にインキュベーターにプレートを返します。細胞は4-7時間に移行しましょう​​。
   注意：CSEで損傷したMSCを評価する際に7時間が最適です。細胞増殖は、細胞移動のための交絡変数として作用することができるので、より大きく7時間細胞をインキュベートする（オプション注以下の8.2を参照）が推奨されていません。

4。初期傷の画像の解析

1. ImageJのをダウンロードして、創傷治癒ツールプラグインをインストール（材料/機器の表を参照）。
2. ImageJの中の画像ファイルを開き、「プロセス」をクリックして、スクラッチ領域（ 図2B）を計算するためにツールを創傷治癒のためのスクラッチを周囲の細胞を強調するために「エッジを探します」。次に、「画像」、「調整」「カラーしきい値」と「しきい​​値の色」と表示されたドロップダウンメニューで値を変更する]をクリックし、「白黒」を
3. 傷やセル前面との間の最適なコントラストが達成されるまで、「カラーしきい値」メニュー内では、両方の明るさしきい値スライダを調整します。画像のコントラストを作成しようとしたとき、最大の範囲を可能に右（完全に黒画像）に完全に底のスライダを移動し、最大コントラストを生成するためにトップのスライダーを調整します。
4. ゆっくりとトップBRIを調整画像がきれいにスクラッチ（ 図2C）の輪郭が表示されるまで、左から右にghtnessスライダー。スクラッチのエッジが識別されると、スクラッチ領域を強調するために（つまり、ImageJのツールバーに表示されます）、ImageJのツールバーの「その他のツール」をクリックし、ドロップダウンメニューから「MRI_Wound_Healing_Tool」を選択し、「M」ボタンを押してくださいそして、出力結果ポップアウトウィンドウ （図2D）で計算されたエリア。
5. コピーし、Excelスプレッドシートに結果画面（ 図2E）からすべての数字を貼り付けます。個々の傷からデータを分離することを確認します。

5.スクラッチの最終画像を撮影

1. 細胞は（4-7時間）に移行した後、繰り返しは3.2から3.4を繰り返します。画像各プレート上の細胞が移動に等しい時間があったように、彼らは傷されたのと同じ順序でプレート。
   注：細胞は、センシに応じて、複数の時点で撮像することができます両方の温度およびpH変化にtivity。また、ライブセルイメージングは​​、彼らが移行するとリアルタイムで細胞を追跡するために使用することができます。

6.最終的なスクラッチ画像の解析

1. 繰り返し、最終的なスクラッチ画像の4.2から4.5を繰り返します。

7.移行を定量化するためのスクラッチ領域を計算します

1. それぞれの傷の初期面積値を平均することにより平均移行前の面積を計算します。
2. 平均移行前のエリア（ステップ7.1）から、ステップ6で算出された各画像のための最終的な移行領域を減算することによって、移行の合計金額を計算します。移行の変化を表す各スクラッチの値のリストを生成します。
3. プール同じ試験群（ すなわち、全てのプレートと0％CSEに曝露された細胞上のすべての傷）内に複数の傷からのデータ。実験群間の差を分析するために分散テストの分析を使用してください。
4. 細胞は移行遅い場合及び（10-12時間よりも大きい）をスクラッチした後に、より長いインキュベーション時間を必要とし、細胞が遊走アッセイが発生している期間中に増殖を受けているかどうかを決定するのBrDUまたはEDU取り込みアッセイ^{19を実行します} 。有意な細胞増殖を避けるために、遊走アッセイ時間を選択してください。

8.オプション

1. 有意な細胞老化は、スクラッチの手順の結果として発生しているかどうかを評価するために^{、19に傷をつけ}た後、所定の時間に試験板の老化関連β-ガラクトシダーゼアッセイを行います。

結果

ここで提示スクラッチアッセイは、マウスの肺常駐間葉系間質細胞（LR-MSCS）を使用して実施し、プロトコル・ノートで参照として単離しました。 LR-MSCは、60 mmの組織培養皿中の500,000個の細胞の密度で播種し、48時間で90％コンフルエンスまで増殖させました。損傷を生成するために、4％のCSEは、（上述の）初期播種期間後24時間が、スクラッチアッセイの前に細胞とともにインキュベートしました。各アッセイのために、傷を200μlのピペットチップを使用して生成されました。傷が生成された後の初期の画像が撮影された、と緩んで細胞や破片は、完全培地で洗い流されていました。 図1AおよびBに示すように、適切な合流は、イメージングソフトウェアが正常に傷の境界を識別できるようにすることが重要です。 図1Cに示されるように、細胞は、（いずれかのために不十分な播種密度の、不十分なINC十分にコンフルエントでありません簡単にイメージングソフトウェア（ 図1D）で区別されていない異種の境界を有する傷をもたらすことができるubation回、または過度の...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、スクラッチアッセイを実施し、分析するための定量的堅牢な、標準化された方法を提供します。単純なスクラッチアッセイは日常的に細胞の遊走を調べるために、研究のさまざまな分野で使用されています。しかし、伝統的にスクラッチアッセイは再現^7,10の問題につながっている、標準化されたセットアップと定量化プロトコルを欠いていました。スクラッチアッセイを改善するための改変および最適化の多くは、個々の生細胞画像化、標準化されたストッパーに基づくアッセイ、および三次元マイクロピラーアッセイ^4,8,10を含む、これらの問題が、減少しています。しかしながら、これらのアッセイは、カスタマイズまたは^{10を適合させる}ことが困難であることができ、いくつかの用途のために、これらの技術はまた、法外な費用がかかることができます。

標準化されたスクラッチアッセイプロトコルを生成するために、細胞のinvolに関する特定の情報を必要とし、ここで提示したプロトコルのいくつかの重要なステップがありますVED、およびアッセイの最適化は、関連...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM(高グルコース、グルタミン無添加)	Life Technologies	31053-036
Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3091002
Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SV3007901
Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3003401
TypeLE cell dissociation reagent	Life Technologies	12563-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone	フィッシャーサイエンティフィ	SH3002802
ファルコン標準60mm組織培養皿	フィッシャーサイエンティフィック	08-772B
フィッシャーブランド滅菌200 μl ピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	02-707-502
カメラアタッチメント付き倒立光学顕微鏡	Variable
ImageJソフトウェア	http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healingプラグイン	http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
統計解析ソフト	Microsoft Excel