Method Article

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

DOI:

10.3791/53417

⸱

February 25th, 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、(細胞周期)キナーゼのミトコンドリア局在を研究する方法と、その亜ミトコンドリア位置と潜在的なミトコンドリア基質/標的を決定する方法を概説します。タンパク質のミトコンドリアへの強制発現は、目的のタンパク質のミトコンドリア局在の機能的影響を研究するための有用なツールを提供します。

Abstract

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ミトコンドリアは独自の転写機構を持っていますが、ミトコンドリアタンパク質のわずか1%がオルガネラ内で合成されます。核にコードされたタンパク質は、ミトコンドリアターゲティング配列(MTS)によってミトコンドリアに輸送されます。しかし、ミトコンドリアに局在するタンパク質の大部分は、識別可能なMTSを欠いています。それにもかかわらず、MTS がタンパク質をミトコンドリアに入れるように指示できるという事実は、正常な核タンパク質および/または細胞質タンパク質のミトコンドリア機能を研究するための貴重なツールを提供します。私たちは最近、ミトコンドリアの細胞周期キナーゼCyclinB1/Cdk1複合体を同定しました。この複合体のミトコンドリア機能を特異的に研究するためには、この複合体の核機能や細胞質機能を妨げることなく、ミトコンドリアの過剰発現とノックダウンが不可欠でした。CyclinB1/Cdk1をMTSで標識することにより、この複合体のミトコンドリア過剰発現を達成し、そのミトコンドリア標的と機能を研究することができました。ドミナントネガティブCdk1をMTSでタグ付けすることにより、特にミトコンドリアでCdk1活性の阻害が達成されました。CyclinB1/Cdk1複合体の潜在的なミトコンドリア標的は、ゲルベースのプロテオミクスアプローチを使用して特定されました。従来の2Dゲル解析とは異なり、2次元差分ゲル電気泳動(2D-DIGE)技術とそれに続くリン酸化タンパク質染色を使用して、ミトコンドリアCdk1発現細胞中の差次的リン酸化タンパク質を蛍光標識しました。野生型とドミナントネガティブCdk1でミトコンドリアを持つヒト型で変化したリン酸化タンパク質スポットの同定により、Cdk1のミトコンドリア標的の同一性が明らかになりました。最後に、細胞周期の進行におけるCyclinB1/Cdk1ミトコンドリア局在の影響を判断するために、合成チミジン類似体EdU(5-エチニル-2′-デオキシウリジン)を使用した細胞増殖アッセイを使用して、細胞が細胞周期を通過し、DNAを複製するときに細胞をモニターしました。全体として、細胞周期キナーゼのミトコンドリア局在と活性を研究するために利用可能なさまざまなアプローチを実証しました。これらは高度でありながら、多くの細胞生物学研究者にとって有益な方法に従うのが簡単です。

Introduction

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哺乳類では、細胞周期の進行は、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ（CDK）1によって制御される、高度に秩序イベントに依存しています。その細胞質、核、および中心体の局在化を通じ、サイクリン/ Cdk1のは、核エンベロープの破壊や中心体の分離2などの有糸分裂におけるさまざまなイベントを同期することができます。サイクリン/ Cdk1のは、アポトーシス3に対して有糸分裂細胞を保護し、ミトコンドリアの分裂、新たに形成された娘細胞4にミトコンドリアの平等な分配のための重要なステップを促進します。

哺乳動物細胞の増殖には、ミトコンドリアのATP、5マルチサブユニット複合体で構成されている酸化的リン酸化（OXPHOS）機械（電子伝達系）を介して生成されます。複合体I - 複雑なV（CI-CV）。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）：ユビキノン酸化還元酵素または複合体I（CI）は、5つの複合体5の理解最大と最小です。複雑なC45サブユニットの14のonsistsは、触媒コアを形成します。一旦組み立てられる、複合体は、1マトリックス内に突出するアームと内膜6,7に埋め込 ​​まれ、他方のアームとL字型構造を前提としています。 CIサブユニットの変異は、ミトコンドリア病8の様々な原因です。 OXPHOSで機能的、効率的なCIが....

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Protocol

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培養細胞からミトコンドリアの1の単離

  1. 細胞（IBC）バッファのための単離緩衝液の調製
    1. 0.1 Mトリス/ MOPS（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン/ 3-（Nモルホリノ）プロパンスルホン酸）を準備し、蒸留水800mlにトリス12.1グラム溶かしMOPS粉末を使用してpHを7.4に調整し、合計の蒸留水を加えます4 O℃で1 Lと店舗の体積
    2. 0.1 M EGTA（エチレングリコールビス（2-アミノエチルエーテル）四酢酸）を準備/トリス：蒸留水800mlにEGTA 38.1グラム溶かしトリス粉末を使用してpHを7.4に調整し、1リットルの総容積まで蒸留水を加えますそして4 O℃で保存
    3. 1 Mスクロースを準備します。蒸留水100ml中のスクロースの34.23グラムを溶かし、C. oを -20℃で20ミリリットルのアリコート、および店舗を作ります
    4. バッファーC 0.1 Mトリス/ MOPSの10ミリリットルと20ミリリットルの0.1 M EGTA /トリスの1ミリリットルを追加することで、IBの100ミリリットルを準備します。IB cのバッファを準備; 1 Mショ糖。 100ミリリットルの全容量に蒸留水を追加します。 pHを7.4に調整します。

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Results

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サイクリンおよびCdk1ののサブミトコンドリア局在

炭酸ナトリウム抽出は、タンパク質がミトコンドリア内部又は外部表面、すなわち、外膜上に位置しているかどうかを決定するために使用されます。タンパク質は、ミトコンドリア内部で局在することが示されたら、サブミトコンドリア局在のさらなる決意は、プロテアーゼ消化と組み合わせmitoplastingを介して行うことができます。サイクリンまたはCdk1ののサブミトコンドリア局在を指定するには、ミトプラストは25 mmまでの200mMから浸透圧のスクロースの濃度を減少させて低張緩衝液中のミトコンドリアを希釈することによって単離しました。内膜は、ショ糖の25 mMの（ 図1A）での最終濃度まで無傷のまま外膜は、ショ糖の150 mMので破裂し始めます。 mitoplastingと組み合わせて、プロテアーゼ保護アッセイはtrypsを用いて行うことができます.......

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Discussion

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他の細胞内小器官宛のタンパク質と同様に、ミトコンドリアの標的タンパク質は、精巧なタンパク質のトランスロケーションと折り機21,22の支援を受けて細胞小器官にそれらを向ける彼らの一次または二次構造内ターゲティングシグナルを有しています。例えばCOX8としてのみミトコンドリア常駐タンパク質から得られた配列（MTS）を標的とするミトコンドリアは、ミトコンドリア11,23,24に特定のタンパク質を標的とする任意の遺伝子配列のN末端 ​​に付加することができます。ここでは、サイクリンおよびCdk1の遺伝子がベクターを含むCOX8のMTSへと発現の際にクローン化した、組換えサイクリンおよびCdk1のは、ミトコンドリアに局在していました。このアプローチの利点は、全体的な遺伝子発現を変化させることなく、この場合、ミトコンドリアに、特定の副細胞区画に遺伝子発現の改変を可能にすることです。この戦略では、ミトコンドリア特異的核キナーゼの機能は、Cdk1のがdeましたtermined。同様に、ドミナントネガティブCdk1のにMTSを添加することにより、ダウンCdk1のミトコンドリア特有の機能のノックミトコンドリアCD.......

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Disclosures

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

Acknowledgements

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この作業は、NIHの助成金CA133402、CA152313、エネルギー省科学局DE-SC0001271の支援を受けました。NCI P30 CA0933730からの資金提供、NIH NCRR C06-RR12088、S10 RR12964、S10 RR 026825 からの資金提供を受けたカリフォルニア大学デービス校のフローサイトメトリー共有リソース研究所、およびフローサイトメトリー実験に協力してくださった Bridget McLaughlin 氏と Jonathan Van Dyke 氏からの技術支援に感謝します。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
32P ATP パーキンエルマーBLU002001MC 
抗マウス二次抗体Invitrogen A-11003Alexa-546標識
抗ウサギ二次抗体Invitrogen A11029Alexa-488 標識
ATPResearch Organics1166Ain vitro キナーゼアッセイ用
Cdk1 抗体Cell Signaling Technology9112
Cdk1 kinase bufferNew England BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging KitLife TechnologiesC10337EdU 標識
による細胞周期解析用COX IV抗体細胞シグナル伝達技術4844Sミトコンドリア免疫染色用
サイクリンB1抗体サンタクルーズバイオテクノロジーsc-752
サイクリンB1/Cdk1酵素複合体ニューイングランドバイオラボP6020S凍結/融解を避ける
CyDye DIGE FluorラベリングキットGEヘルスケアライフサイエンス25-8009-83
DIGEゲルおよびDIGEバッファーキットGEヘルスケアライフサイエンス28-9480-26AA
ジメチルホルムアミド Sigma Aldrich319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004部位特異的変異導入用
Dpn I 酵素Stratagene200519-53部位特異的変異導入用
ドライストリップカバー液GE Healthcare Life Sciences17-1335-01鉱物油として使用
EDTAJ.T. Baker4040-03
EGTAアクロス オーガニックス409910250
エッペンドルフ 真空濃縮器フィッシャー・サイエンティフィック07-748-13真空遠心分離濃縮器として使用
フルオロマウントGサザン・バイオテック0100-01アンチフェードマウントソリューション
フォルテッサ・フローサイトメーターBDバイオサイエンス649908細胞周期用EdU標識による分析
Histone H1Calbiochem382150in vitroキナーゼアッセイ用
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704アガロースゲルからDNA断片を精製するため
Immobiline DryStrip GelsGE Healthcare Life Sciences18-1016-61IEF(等電点電気泳動)ストリップ
固定化グルタチオンThermo Scientific15160グルタチオン-アガロースビーズ
ヨードアトアミドSigma AldrichI1149IAA
IPGphor 3 等電点集型装置GE Healthcare Life Sciences11-0033-64IPGphor ストリップホルダー
イソプロピル-b-D-チオ-ガラクトピラノシド RPI Corp156000-5.0IPTG
ロイペプチンSigma AldrichL9783細胞溶解バッファー用
リポフェクタミン 2000Life Technologies11668027トランスフェクション試薬
リジンSigma AldrichL5501CyDye 標識用
リゾチームEMD Chemicals5960
Mitoctracker 赤/緑Invitrogen M7512/M7514ミトコンドリア蛍光色素
MOPSEMD Chemicals6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1GFP発現ベクター
PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 GEヘルスケアライフサイエンス28-9545-53GST発現ベクター
フェニルメチルスルホニルフッ化物シェルトンサイエンティフィックIB01090 PMSF
リン酸緩衝生理食塩水ライフサイエンステクノロジーズ 14040PBS
Spectra/Por 4透析チューブSpectrum Labs132700透析用多孔質膜チューブとして
Pro-Q ダイヤモンドリン酸化タンパク質ゲル染色ライフテクノロジーズ P-333002Dゲル上のリン酸化タンパク質の染色用
プロテイナーゼ阻害剤 カクテルカルバイオケム539134細胞溶解バッファー用
QuikChange部位特異的突然変異導入キットStratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104MiniPrep プラスミド単離キット
RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Cdk1阻害剤
ロテノンMP Biomedicals 150154Complex I阻害剤
炭酸ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS93359
塩化ナトリウムEMDケミカルズSX0420-5細胞溶解バッファー用
オルトバナジン酸ナトリウムMP Biomedicals159664細胞溶解バッファー用
ピロリン酸ナトリウム十水和物Alfa Aesar33385細胞溶解バッファー用
ナトリウム &β;-グリセロリン酸Alfa AesarL03425細胞溶解バッファー用
SpectraMax M2e モレキュラーデバイスM2Eマイクロプレートリーダー
ショ糖フィッシャーサイエンティフィック57-50-1
ティッシュグラインダー 乳棒キンブルチェイス885301-0007ミトコンドリア分離用
ティッシュグラインダーチューブキンブルチェイス885303-0007ミトコンドリア分離用
トリクロロ酢酸溶液シグマ アルドリッチT0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
TrypsinCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09レーザーゲルスキャナー 2D-DIGE
UbiquinoneSigma AldrichC7956

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.

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Mitochondrial LocalizationCdk1 KinaseMitochondrial Overexpression2D DIGE AnalysisEdU Labeling AssayFlow CytometrySodium Carbonate ExtractionSubmitochondrial FractionationMitochondrial Targeting SequenceCell Proliferation Assay

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