チック小脳スライスと顆粒細胞前駆体の空間的にターゲットを絞ったエレクトロポレーションの ex vivo培養

サマリー

小脳外顆粒層は、脳の発達で最大のトランジット増幅のサイトです。ここでは、胚の14日目のニワトリ胚からex vivoでエレクトロポレーションおよび小脳スライスの文化を使用して、増殖のピーク時にこの層に遺伝子改変をターゲットにするプロトコルを提示します。

要約

小脳外顆粒層（EGL）は、脳の発達で最大のトランジット増幅のサイト、および神経増殖および分化を研究するための優れたモデルです。また、その増殖能力の進化の変更は、小脳脊椎動物の脳のEVO-DEVO研究のための優れたモデルを作り、羊膜における小脳のサイズの劇的な拡大を担当しています。 EGLを構成する細胞は、小脳顆粒前駆細胞は、また、髄芽腫のための最も一般的な小児神経腫瘍の起源の有意な細胞を表します。トランジット増幅後、顆粒の前駆体は、彼らが成熟した哺乳動物の脳における最大のニューロン集団を表す小脳の内部顆粒層に半径方向に移動します。ひよこでは、EGLの増殖のピークは妊娠の第2週の終わりに向かって発生します。この層での遺伝子改変を標的とするために増殖のピークは、我々は、胚14日目のニワトリ胚から小脳スライスのex vivoでのエレクトロポレーションを介して、遺伝子操作のための方法を開発しました。この方法は、 インビボでの顆粒ニューロンの発達のいくつかの重要な局面を再現すると、小脳顆粒細胞の増殖および分化の、ひいては小脳の開発、展開、および疾患の完全な理解を生成するのに有用であろう。

概要

小脳は、後脳の前方端に座って、成熟した脳内の感覚と運動処理の統合を担当するだけでなく、高い認知過程^1を規制です。哺乳類や鳥類では、成人の脳におけるニューロンの半分以上が生産する開発中に、前駆細胞の大規模なトランジット増幅の産物を精巧な形態を有し、重く葉状されます。小脳は、何世紀にもわたって、および分子時代の神経生物学者のための調査の対象となっている、同様に重要な注目を集めています。これは、本質的に興味深い生物学だけでなく、それが頻繁にそのような最も一般的な小児の脳である自閉症スペクトラム障害²と最も顕著に小脳癌、髄芽腫^3、などの発達の遺伝的障害を含む、ヒトの疾患に関与しているという事実だけでなく、関連します腫瘍。重要なことは、WH内の優れたモデル系でありますICHは、脳の発達⁴中に運命の割り当てと神経新生を研究します。近年では、それはまた、脊椎動物系統^5-10横切っ見小脳形態の巨大な多様性のために、脳の発達の比較研究のためのモデル系として確立されています。

小脳は、後脳¹¹でrhombomere 1の背側半分から発達と発達二つの主要な前駆細胞集団、菱形リップと脳室帯から構成されています。菱形リップは、屋根板との国境で後脳の神経上皮の背部の周りに延びます。これは、小脳^12-14のグルタミン酸作動性ニューロン興奮性の発祥の地です....

プロトコル

注意：全ての実験は、キングスカレッジロンドン、英国、英国内務省動物保護ガイドラインに基づいて実施しました。

E14小脳の1解剖

1. 胚14日目に38℃で茶色の受精鶏卵をインキュベートします。
2. 卵のはさみを使用すると、 卵内ニワトリ胚を刎ねると氷冷PBS（ 図1A）を含むペトリ皿に頭を削除します。
3. 標準の鉗子を使用して、目と上顎の除去、組織を通ってそれぞれの目の後ろにすべての方法を切開を行います。すべての方法下顎（ 図1B）を除去咽頭を介して第2の切開を行います。
4. 標準の鉗子を使用して、（ 図1C）を 、それを剥がすことにより、頭蓋骨の表面からすべての皮膚を除去し、前頭葉と頭頂骨を削除し、脳を明らかにする。
5. 腹側面から、咽頭軟骨と補助間葉を削除します。
6. 背側面から、慎重にLY軟膜を損傷しないように注意しながら後脳、独立した脳全体（ 図1D）に間充織の背側を削除します。
7. すべての方法中脳と後脳と小脳（ 図1E）を含む別々の後脳の間の組織を通して切開を行います。
8. すべての方法小脳および後脳の翼板の両側接合部で組織を通って切開を行うことにより、解剖を通してPI....

結果

このセクションでは、胚の14日目のニワトリからスライスエレクトロポレーションおよび小脳の文化を使用して得ることができる結果の例を示します。小脳の解剖は 、図1に示され、セットアップのエレクトロポレーションチャンバーは、図2に示されている。我々は、それが成功したin vitroで （ 図3A）、その構造や細胞形態を保持して培養小脳スライスを、エレクトロポレーションとすることが可能であることを示しています。個々フォリアをターゲットにエレクトロポレーションが容易（ 図3B）が達成されます。我々は成功し、図3D（ii）の小脳細胞における機能のための可能なゲノム領域をテストするために、レポーターは彼らの行動（ 図3C）を観察するために構築物で細胞を標識する）EGL細胞に異なるプラスミドの数をエレクトロポレーションし、それが可能私で.......

ディスカッション

ここで報告プロトコルは、解剖電気穿孔とひよこから胚14日目小脳のスライスを培養するための方法を説明します。このプロトコルは、個々の小脳ローブの孤立したターゲティングを含むEGLの小さな焦点領域にエレクトロポレーションのターゲティングが可能。これは、高解像度と利便性で遺伝子解析とイメージングを可能にし、低コストでげっ歯類^43-47で確立された技術と比較。このような分析が原因変更がEGLに影響を与える可能性があるということを意味し、拡張発育期間、マウスでEGL-特異的な遺伝子ターゲッティング可能性の不足、及び菱形リップとEGLの間の分子メカニズムの共通性、 インビボで現在は不可能です彼らは菱形リップ神経発生に影響を与え、EGLの形成^{49を無効に}するので生物学は頻繁に分析することができません。私たちのシステムは、このようにEGL sに遺伝子改変をターゲットの面で大きな進歩を表していますpecifically、そして我々はそれがこのような非モデル哺乳類や爬虫類など多分比較関心のひよこを越えて他の種に適用されます期待しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
McIlwain組織チョ	ッパーMickle Laboratory Engineering Ltd		300 μm で最良の結果が得られます。
基礎ミディアムイーグル(ギブコ)	ライフテクノロジー	41010-026
L-グルタミン	シグマ	G7513
ペニシリン/ストレプトマイシン	シグマ	P4333
0.4 μm カルチャーインサート	ミリポア	PICM0RG50
TSS20 オボダインエレクトロポレーター	Intracel	01-916-02	エレクトロポレーションには3 x 10 V、10 msecパルスを使用します。

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