可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

Summary

このプロトコルの目的は、気孔複合体の細胞皮質内に、GFPタグPATROL1、膜輸送タンパク質のドットを点滅示す可変角度落射蛍光顕微鏡で植物細胞表面上の蛍光標識タンパク質のダイナミクスを監視する方法を示すことですシロイヌナズナ 。

Abstract

植物の細胞表面は、環境の手がかりを知覚するためのインターフェースであり、膜輸送や細胞骨格の再配列などの細胞生物学的変化に反応します。このような細胞内イベントのリアルタイムかつ高解像度の画像解析により、分子レベルでの植物細胞生物学の理解が深まります。可変角度落射蛍光顕微鏡(VAEM)は、植物細胞表面上の蛍光標識タンパク質の高品質なタイムラプス画像を提供する新しい技術です。この記事では、VAEM試料作製、VAEM光学系の調整、動画撮影、画像解析の実践的な手順について説明します。VAEM観測の一例として、PATROL1のダイナミクスに関する代表的な結果を示します。これは気孔運動に必須のタンパク質で、シロイヌナズナの気孔複合体の原形質膜へのプロトンポンプ送達に関与していると考えられています。A. thaliana cotyledonsのガード細胞と補助細胞のVAEMリアルタイム観察では、蛍光タグ付きPATROL1が数秒間、原形質膜上にドット状構造として現れ、その後消えることが示されました。VAEM動画データのキモグラフ解析により、ドット状構造の存在(「滞留時間」と呼ばれる)の時間分布が決定されました。VAEM の使用については、この例のコンテキストで説明します。

Introduction

細胞表面は、細胞膜とそれに隣接する細胞質を含み、植物細胞が細胞外環境からの生物的および非生物的手がかりを知覚し、統合する主要な領域です。これらの合図に応答して、原形質膜タンパク質や皮質細胞骨格などの細胞表面成分は、数秒から数分の時間スケールで動的に変化します1^〜4。したがって、細胞表面上の蛍光タンパク質のリアルタイムかつ高解像度のイメージングにより、環境の手がかりに対する植物の応答を分子レベルで明らかにすることができます。

共焦点レーザー走査型顕微鏡は、蛍光タグ付きタンパク質の局在³を決定するための強力なツールですが、その比較的長い捕捉時間のために、リアルタイムのタンパク質ダイナミクスを監視することはしばしば困難です。植物細胞内のタンパク質をリアルタイムでモニタリングするための新しい技術は、可変角度落射蛍光顕微鏡(VAEM)であり、これは全反射蛍光(TIRF)顕微鏡に通常使用される装置を適応させたものです。TIRF顕微鏡では、蛍光励起光源は、レーザーの入射角がガラスと水の界面で光を完全に内部反射するほど浅い場合に生成されるエバネッセント光場です。エバネッセントライトフィールドの浸透深さは約100nmです。TIRF顕微鏡は、動物細胞のエキソサイトーシスの検出など、1分子イメージングのための優れたツールです⁵。しかし、エバネッセント光は、細胞壁が厚いため、植物細胞の原形質膜や皮質細胞質に到達することができません。最近、TIRF顕微鏡装置は植物細胞生物学者によって採用され、レーザーが全反射現象を誘発するために使用される場合よりもわずかに深い角度でレーザーが植物細胞サンプルの表面を励起する可能性があることを観察し、高品質の植物細胞イメージングをもたらすことを発見しました^6,7。励起照明の深さは、レーザーの入射角度を調整することによって変化します。したがって、この手法はVAEMと呼ばれます。この光学系は、細胞壁-ペリプラズム界面⁷で全反射が発生する可能性があるため、可変角度TIRF顕微鏡(VA-TIRFM)とも呼ばれますが、植物⁶の最初の報告によると、この記事ではVAEMという用語が使用されています。

このプロトコルの目標は、VAEMを使用して植物細胞表面上の蛍光タグ付きタンパク質動態を視覚化するための実践的な手順を示すことです。さらに、VAEM動画解析のために、分子の滞留時間(存在時間)を定量化する画像解析プロトコルについて説明します。例として、シロイヌナズナの気孔複合体細胞上のGFP-PATROL1ドットの点滅が用いられます。PATROL1は、A. thaliana⁸の気孔応答欠損変異体の原因遺伝子として、前方遺伝学的アプローチによって同定されました。PATROL1は、シナプス小胞エキソサイトーシス⁸のプライミング因子であるMUNC-13の植物相同体です。光や湿度などの環境的な手がかりに応答して、PATROL1は気孔複合体の原形質膜へのプロトンポンプの送達を可逆的に調節すると考えられています。気孔複合体は、それぞれ一対のガード細胞⁸と補助細胞⁹を含み、気孔運動にはプロトンポンプを必要とする。これらの細胞では、GFPタグ付きPATROL1は、細胞膜上に1分未満しか留まらないドット状構造に局在します⁹。

Protocol

苗の調製

1. 種子を滅菌します。
   1. 1μlの10％トリトンX-100〜500μlの滅菌水：500μLのNaClO（5.0％有効塩素）を加えることによって滅菌溶液を調製します。
   2. 場所の約 10 形質転換A. 1.5 mlチューブに、GFP-PATROL1 ^8を運ぶ シロイヌナズナの種子。
   3. 1ミリリットルの70％エタノール溶液を追加し、5回反転させてよく混ぜます。 1分間のままにしておきます。
   4. 種子は、チューブの底に沈む確認します。クリーンクリーンベンチでは、静かにマイクロピペットを用いて70％のエタノールを除去し、1ミリリットルに滅菌溶液を添加。 5回反転させることによって十分に混合し、5分間放置します。
   5. 種子を洗ってください。それでもクリーンベンチに無菌状態の下で働いて、静かにマイクロピペットを用いて溶液を除去し、1ミリリットルに滅菌水を追加します。この5回繰り返します。滅菌種子は、2日間4℃で滅菌水に格納されてもよいです。
2. だから、0.5％ジェランガム固化1/2ムラシゲ・スクーグ培地プレート（pHは^5.8）9の滅菌種子ワットサージカルテープの二つの層を用いてプレート上にふたをテープで固定します。
3. 冷蔵室、O / Nで、4℃で暗所でプレートをインキュベートします。
4. 100マイクロモルメートル^-2秒 -1白いライトを使用して12時間/ 12時間の明暗サイクルで23.5℃に設定し、成長チャンバ内にプレートを移し、7日間インキュベートします。長い1mm程度の子葉と苗木は、その後収穫することができます。

2.スカイドロップ子葉片の取り付け

注：VAEM観察用の試料の調製における重要な要因は、試料とカバーガラスの間に気泡の混入を回避されます。気泡が大きく屈折率の差を生じさせることによってVAEMの画質を低下させます。我々は、「空のドロップ」と呼ばれている単純な実装方法は、気泡を回避するために使用することができA.間のシロイヌナズナ子葉とカバーガラス。これは、観測の直前に行​​われる必要があります。

1. 76：スライドガラス（サイズの中央に基礎緩衝液30μl[5 mMの2-（N-モルホリノ） -エタン酸トリス（MES-トリス）pH6.5で、50mMの塩化カリウム、100μMのCaCl _2]を配置します×26ミリメートル、厚さ：1.0〜1.2ミリメートル）。
2. 解剖ハサミを使用して、7日齢の苗から子葉を削除します。観察側が基底バッファ降下（ 図1、ステップ1）上に向けて子葉をフロート。
3. カバーガラスの中心に基礎緩衝液30μlを置き（サイズ：18×18ミリメートル、厚さ：0.12〜0.17ミリメートル）（ 図1、ステップ2）。逆さまに静かにカバーガラスを回します。表面張力が脱落バッファ低下を防ぐことができます。一方の縁部にピンセットでカバーガラスを保持します。バッファ降下は約子葉の上にあるように、スライドガラス上に反対側の端を置きます。
4. それは子葉試料（ 図1、ステップ3）の真上になるように、スライド上の静止カバーガラスのエッジ、まだピンセットで反対側の縁部を保持して、カバーガラスの下にバッファのドロップの位置を調整します。カバーガラスを手放します。気泡のない準備で得られた試​​料のドロップをマウントします。
5. 糸くずの出ない組織を使用して余分なバッファを拭き取ってください。すぐに準備を観察し（ステップ3を参照）。
   注：サンプルをシールする必要はありません。

3. VAEM観察ムービー取得

倒立顕微鏡はTIRFユニットと1.49の開口数とTIRF対物レンズを搭載しています。注：以下のように本研究で使用するTIRF顕微鏡システム^{9について説明します} 。レーザー入射角のコンピュータ制御は、制御ボックスが使用されます。緑色蛍光タンパク質（GFP）は、488nmの光励起半導体レーザで励起され、そしてt彼は、蛍光が葉緑体の自己蛍光を防ぐために、510から550 nmのバンドパスフィルタを介して検出されます。ファイバ出力電力の測定された最大値は13.0から13.5ミリワットです。検出のために、電子増倍電荷結合素子（EM-CCD）カメラヘッドシステムとCマウントカメラ倍率変更手段が使用されます。

1. 製造元の指示に従ってを中心と集光レーザーを調整します。
   注：この手順は、正確なVAEM観測のために重要です。それは強くレーザー経路の調整手順の定期的なチェックは、あなたの顕微鏡に応じて、実行することをお勧めします。
   1. 顕微鏡室の天井に対物レンズのない光路で照射中心位置を決定します。中央の位置をマークするには、天井に色付きの円シールを置く（ 図2、ステップ1、2）。
   2. 対物レンズ（ 図2、ステップ3、4）で天井を照らします。私を移動します中心位置（ 図2、ステップ5）に地域をlluminated。レーザー（ 図2、ステップ6）フォーカス。微調整の中心に集光されたレーザ（ 図2、ステップ7）の位置。
2. 顕微鏡のステージ上の試料をセットし、明視野照明を使用して観察するためのセルを選択します。
3. 蛍光タンパク質は、細胞で観察することができることを確認し、落射蛍光照明（ 図3A）を用いて細胞表面でのz -軸位置を設定します。
4. VAEM観測を行います。
   1. コントローラボックスで徐々にレーザービームの入射角を傾け。同時に、慎重にライブ映像を監視します。最初は、イメージが（ 図3B）ぼかされます。
   2. レーザー角が増加するにつれて、VAEM画像は最終的には鮮明な画像（ 図3CおよびD）を製造する 、より少ない不鮮明になるであろう。この時点で、increaを停止レーザー角度を歌います。蛍光信号が失われた場合、より浅い角度に減少します。
   3. 微調整のレーザー入射角は、より良好な画像を得ることができます。 Z -軸の位置の微調整は、画像を改善することができます。必要に応じて、光学パラメータ（レーザー出力、波長フィルタセット）を調整し、画像センサパラメータ[画像サイズ、露出時間、ゲイン、デジタイザと電子増倍（EM）ゲイン]。
      注：以下のように上述のTIRF顕微鏡装置の場合には、代表的なパラメータです。ちょうどカメラの前でレンズの倍率：2倍。レーザー出力：1.0 mWの。画像サイズ：512×512ピクセル。露光時間：100ミリ秒。ゲイン：5×を。デジタイザ：11 MHzの。 EMゲイン：100。
5. 商用顕微鏡ソフトウェアを使用して、複数ページのTIFF画像ファイルとして映画を取得します。ここでは、映画は、気孔細胞の表面上の点滅GFP標識されたドットです。
   注：代表画像取得条件はFOLの通りであります安値。取得モード：ストリームは、RAMに。フレームの数：600;マルチページTIFFファイルサイズ：〜302メガバイト

フィジーソフトウェアを使用したGFP標識ドット滞留時間の定量化のための4カイモグラフ分析

1. 著者の命令（http://fiji.sc/Fiji）を使用して、フィジー（ 'フィジーはちょうどImageJのである'）ソフトウェア^{10をインストールします} 。
2. フィジーを実行し、フィジーメニュー「 ファイルを開く」を使用して取得したマルチページTIFFファイルを開きます。
3. フィジーツールバーメニュー「 直線選択ツール」を使用して 、目的の部位に線を配置します。必要に応じて、「 セグメント化されたライン選択ツール 」または「 フリーハンドライン選択ツール」を使用します。ここに提示した結果では、100ピクセル（8.0ミクロンに相当する）の直線を子会社細胞（ 図4A）の上に置きました。
4. フィジーメニューの 「画像・スタックダイナミックResliceを使用してカイモグラフイメージを作ります "（http://fiji.sc/Dynamic_Reslice）（ 図4B）。カイモグラフイメージで必要に応じて、「垂直フリップ 」とチェックボックスウィンドウで「90度回転」も（ここで提示された結果では使用されません）があり、x軸とy軸線位置に対応する（100画素を示しそれぞれ8.0μm）とし、観測時間（600ピクセルが60秒に相当）、。カイモグラフイメージが満足できない場合は、複数ページの画像上の線の位置と種類は（ストレート、セグメント化され、フリーハンド）のよう。変更することができますラインの変更、カイモグラフイメージが動的に変化します。フィジーメニュー「ファイルとして保存-TIFF」を使用して、TIFFファイルとしてカイモグラフ画像を保存します。
5. 時間軸の向きにブロブの長さを測定します。
   1. ノイズリダクションを実行するには、フィジーメニュー「 プロセス・フィルタ-ぼかし（ガウス）」を使用してカイモグラフ画像にガウスフィルタを適用します。 「 シグマ（ラッドIUS）」パラメータが調整可能（1ピクセル半径が提示された結果のために使用される）です。
   2. セグメントフィジーメニューを使用して、しきい値による信号領域、「イメージ・調整・しきい値を 」。
      注：選択可能ないくつかの閾値化アルゴリズムがあります。提示された結果では、「円」のアルゴリズムは、（ 図4C）を選択しました。
   3. メニューを使用してブロブの-軸の長さを時間（y）を測定するための準備」 を分析・セットの測定を 」。 「 セット測定」ウィンドウの「 境界の矩形」を確認してください。理想的には、領域セットは、ノイズを排除するために、可能な限り小さくすべきです。ここでは、最小面積は50ピクセルに設定しました。時間（y）を測定し、メニュー「 分析・解析粒子」を使用してブロブの長さを-axis。結果の値を取得し、測定領域の信頼性を証明するために、「 結果の表示」をチェックし、「Managerへの追加</ em>の "ボックス。
   4. 「 高さ 」の欄の値は、（y）が測定されたブロブ（ 図4D）のための長さを-axis時間です。結果テーブルメニュー「ファイルとして保存」を使用して値を保存し、計算し、統計パッケージ、および/ ​​または表計算ソフト（ 図4E）を使用してブロブ画像期間のデータセットを処理します。

Results

このビデオの記事では、Aの GFP-PATROL1のVAEM観測のためのプロトコルシロイヌナズナ子葉気孔複雑な細胞が提供されています。空ドロップ実装はA.のVAEM調製物中の気泡の発生を減らすことができ、簡単な製造方法でありますシロイヌナズナ子葉（ 図1）。エントリーレーザーおよび/またはVAEMのための検体のz位置決めOvertiltingは不明画像を提供します。その場合、それは落射蛍光照明によって判断されるように、すぐにサンプル上の位置から再スタートすることをお勧めします。 VAEM観測の数日経験した後、それが成功し、日常VAEMムービーを取得することが可能であるべきで、GFP-PATROL1のここに示したような点滅が点在しています。 A.で12の独立した補助セル185からのGFP-PATROL1ドットの滞留時間は、 図4に示すカイモグラフ分析を使用してシロイヌナズナ子葉を測定しました。フィット密度関数は、ほとんどのGFP-PATROL1ドットは補助細胞表面上...

Discussion

このビデオの記事では、プロトコルは、 シロイヌナズナの気孔複合体上のGFP-PATROL1ドットの動的挙動を監視し、測定するために与えられています。ここに示されているように、VAEM観測は、植物の細胞表面のライブイメージングのための強力なツールです。高感度EM-CCDはVAEM光学系では比較的弱い励起レーザの使用を可能にするため、GFP-PATROL1の監視のためにここに使用した実験条件下では、ビデオキャプチャの1分間使用したサンプルはほとんど蛍光退色がありました。レーザーを中心と各実験の開始前に、焦点を当て、成功VAEM観測のために重要です。ユーザーがVAEMを使用する前に選択した顕微鏡会社から専門のスタッフによって訓練されるべきです。

VAEMは、GFP-PATROL1が原形質膜に点滅不動のドット状の区画とダイナ​​ミックな局在を持っていることが明らかになりました。蛍光標識された原形質膜プロトンポンプAHA1ミスLpatrol1変異孔辺細胞と子会社細胞でocalizes、以前に^8,9を報告したように。したがって、VAE...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
倒立顕微鏡	オリンパス	IX-73
TIRFユニット	オリンパス	IX3-RFAEVAW
TIRF対物レンズ	オリンパス	UAPON 100 ×OTIRF	NA = 1.49
レーザー角度制御ボックス	中央精機	QT-AK
光励起半導体レーザー	コヒーレント	サファイアTM LP USB 488-20 CDRH レーザー
510–550nmバンドパスフィルター	オリンパス	U-FBNA
EM CCDカメラ	浜松ホトニクス	ImagEM C9100-13
Cマウントカメラ 倍率変更ユニット	オリンパス	U-TVCAC
MetaMorphソフトウェア	分子デバイス	MetaMorphバージョン7.7.11.0
TIRF顕微鏡マニュアル	オリンパス	AX7385	手順:全反射照明システム(2012年8月24日に日本で印刷)
浸漬油	オリンパス	浸漬油Typr-F	ne = 1.518(23度)