可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

Summary

このプロトコルの目的は、気孔複合体の細胞皮質内に、GFPタグPATROL1、膜輸送タンパク質のドットを点滅示す可変角度落射蛍光顕微鏡で植物細胞表面上の蛍光標識タンパク質のダイナミクスを監視する方法を示すことですシロイヌナズナ 。

Abstract

植物の細胞表面は、環境の手がかりを知覚するためのインターフェースであり、膜輸送や細胞骨格の再配列などの細胞生物学的変化に反応します。このような細胞内イベントのリアルタイムかつ高解像度の画像解析により、分子レベルでの植物細胞生物学の理解が深まります。可変角度落射蛍光顕微鏡(VAEM)は、植物細胞表面上の蛍光標識タンパク質の高品質なタイムラプス画像を提供する新しい技術です。この記事では、VAEM試料作製、VAEM光学系の調整、動画撮影、画像解析の実践的な手順について説明します。VAEM観測の一例として、PATROL1のダイナミクスに関する代表的な結果を示します。これは気孔運動に必須のタンパク質で、シロイヌナズナの気孔複合体の原形質膜へのプロトンポンプ送達に関与していると考えられています。A. thaliana cotyledonsのガード細胞と補助細胞のVAEMリアルタイム観察では、蛍光タグ付きPATROL1が数秒間、原形質膜上にドット状構造として現れ、その後消えることが示されました。VAEM動画データのキモグラフ解析により、ドット状構造の存在(「滞留時間」と呼ばれる)の時間分布が決定されました。VAEM の使用については、この例のコンテキストで説明します。

Introduction

細胞表面は、細胞膜とそれに隣接する細胞質を含み、植物細胞が細胞外環境からの生物的および非生物的手がかりを知覚し、統合する主要な領域です。これらの合図に応答して、原形質膜タンパク質や皮質細胞骨格などの細胞表面成分は、数秒から数分の時間スケールで動的に変化します1^〜4。したがって、細胞表面上の蛍光タンパク質のリアルタイムかつ高解像度のイメージングにより、環境の手がかりに対する植物の応答を分子レベルで明らかにすることができます。

共焦点レーザー走査型顕微鏡は、蛍光タグ付きタンパク質の局在³を決定するための強力なツールですが、その比較的長い捕捉時間のために、リアルタイムのタンパク質ダイナミクスを監視することはしばしば困難です。植物細胞内のタンパク質をリアルタイムでモニタリングするための新しい技術は、可変角度落射蛍光顕微鏡(VAEM)であり、これは全反射蛍光(TIRF)顕微鏡に通常使用される装置を適応させたものです。TIRF顕微鏡では、蛍光励起光源は、レーザーの入射角がガラスと水の界面で光を完全に内部反射するほど浅い場合に生成されるエバネッセント光場です。エバネッセントライトフィールドの浸透深さは約100nmです。TIRF顕微鏡は、動物細胞のエキソサイトーシスの検出など、1分子イメージングのための優れたツールです⁵。しかし、エバネッセント光は、細胞壁が厚いため、植物細胞の原形質膜や皮質細胞質に到達することができません。最....

Protocol

苗の調製

1. 種子を滅菌します。
   1. 1μlの10％トリトンX-100〜500μlの滅菌水：500μLのNaClO（5.0％有効塩素）を加えることによって滅菌溶液を調製します。
   2. 場所の約 10 形質転換A. 1.5 mlチューブに、GFP-PATROL1 ^8を運ぶ シロイヌナズナの種子。
   3. 1ミリリットルの70％エタノール溶液を追加し、5回反転させてよく混ぜます。 1分間のままにしておきます。
   4. 種子は、チューブの底に沈む確認します。クリーンクリーンベンチでは、静かにマイクロピペットを用いて70％のエタノールを除去し、1ミリリットルに滅菌溶液を添加。 5回反転させることによって十分に混合し、5分間放置します。
   5. 種子を洗ってください。それでもクリーンベンチに無菌状態の下で働いて、静かにマイクロピペットを用いて溶液を除去し、1ミリリットルに滅菌水を追加します。この5回繰り返します。滅菌種子は、2日間4℃で滅菌水に格納されてもよいです。
2. だから、0.5％ジェランガム固化1/2ムラシゲ・スクーグ培地プレート（pHは^5.8）9の滅菌種子ワットサージカルテープの二つの層を用いてプレート上にふたをテープで固定します。
3. 冷蔵室、O / Nで、4℃で暗所でプレートをインキュベートします。
<....

Results

このビデオの記事では、Aの GFP-PATROL1のVAEM観測のためのプロトコルシロイヌナズナ子葉気孔複雑な細胞が提供されています。空ドロップ実装はA.のVAEM調製物中の気泡の発生を減らすことができ、簡単な製造方法でありますシロイヌナズナ子葉（ 図1）。エントリーレーザーおよび/またはVAEMのための検体のz位置決めOvertiltingは不明画像を提供します。その場合、それは落射蛍光照明によって判断されるように、すぐにサンプル上の位置から再スタートすることをお勧めします。 VAEM観測の数日経験した後、それが成功し、日常VAEMムービーを取得することが可能であるべきで、GFP-PATROL1のここに示したような点滅が点在しています。 A.で12の独立した補助セル185からのGFP-PATROL1ドットの滞留時間は、 図4に示すカイモグラフ分析を使用してシロイヌナズナ子葉を測定しました。フィット密度関数は、ほとんどのGFP-PATROL1ドットは補助細胞表面上.......

Discussion

このビデオの記事では、プロトコルは、 シロイヌナズナの気孔複合体上のGFP-PATROL1ドットの動的挙動を監視し、測定するために与えられています。ここに示されているように、VAEM観測は、植物の細胞表面のライブイメージングのための強力なツールです。高感度EM-CCDはVAEM光学系では比較的弱い励起レーザの使用を可能にするため、GFP-PATROL1の監視のためにここに使用した実験条件下では、ビデオキャプチャの1分間使用したサンプルはほとんど蛍光退色がありました。レーザーを中心と各実験の開始前に、焦点を当て、成功VAEM観測のために重要です。ユーザーがVAEMを使用する前に選択した顕微鏡会社から専門のスタッフによって訓練されるべきです。

VAEMは、GFP-PATROL1が原形質膜に点滅不動のドット状の区画とダイナ​​ミックな局在を持っていることが明らかになりました。蛍光標識された原形質膜プロトンポンプAHA1ミスLpatrol1変異孔辺細胞と子会社細胞でocalizes、以前に^8,9を報告したように。したがって、VAE.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
倒立顕微鏡	オリンパス	IX-73
TIRFユニット	オリンパス	IX3-RFAEVAW
TIRF対物レンズ	オリンパス	UAPON 100 ×OTIRF	NA = 1.49
レーザー角度制御ボックス	中央精機	QT-AK
光励起半導体レーザー	コヒーレント	サファイアTM LP USB 488-20 CDRH レーザー
510–550nmバンドパスフィルター	オリンパス	U-FBNA
EM CCDカメラ	浜松ホトニクス	ImagEM C9100-13
Cマウントカメラ 倍率変更ユニット	オリンパス	U-TVCAC
MetaMorphソフトウェア	分子デバイス	MetaMorphバージョン7.7.11.0
TIRF顕微鏡マニュアル	オリンパス	AX7385	手順:全反射照明システム(2012年8月24日に日本で印刷)
浸漬油	オリンパス	浸漬油Typr-F	ne = 1.518(23度)