小さな汚染物質の免疫学的分析のための水試料の自動固相抽出ための簡単​​な方法

Summary

自動化された小型化されたシステムを使用して、水サンプルからエストラジオールを抽出し、予備濃縮するためのプロトコルが提示されます。

Abstract

環境水サンプルの固相抽出（SPE）のための新たな方法が提案されています。開発されたプロトタイプは、コスト効率的でユーザーフレンドリーであり、迅速な自動化と単純なSPEを行うことができます。プレ濃縮液は、低有機溶剤の含有量を、免疫測定法による分析と互換性があります。この方法は、100 mlの水サンプル中の天然ホルモンの17βエストラジオールの抽出及び予備濃縮のために記載されています。逆相SPEは、オクタデシル - シリカ吸着剤を用いて行われ、溶出はメタノール50％v / vの200μlで行われます。溶離液は、メタノールの量を低下させるために脱イオン水を添加することによって希釈されます。手動SPEカラムを準備した後、全体的な手順は、1時間以内に自動的に行われます。プロセスの終わりには、エストラジオール濃度は、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて測定されます。 100倍のプレ濃度が達成され、わずか10％v / vの中のメタノール含有量。分子の完全な回復1 ngので達成される/ Lは、脱イオン化された合成海水サンプルをスパイクしました。

Introduction

サンプル調製は、任意の分析のプロセスの重要なステップです。具体的には、マトリックス効果、干渉の減少、および分析物の濃縮の除去は、正確な結果を得るため、検出の下限に到達するために必要です。内分泌かく乱化合物（のEDC）による生物に対する作用に特に懸念た場合であっても、環境が非常に低いレベルで存在します。天然ホルモン17βエストラジオールは、EUの水質汚染の監視リスト上に存在し、欧州の水枠組み指令で規制優先物質のリストに追加されやすいです。固相抽出（SPE）は、一般に、化学^1-5（クロマトグラフィー、質量分析法）及び免疫^6-9検出方法の両方で、水の小さな汚染物質の分析に適用されます。後者は、イムノアッセイは、フォーマットの多種多様で利用可能であるTAに固有のものとして、環境モニタリングの分野に関心を得ました目標確認検体、検出の下限に達した^{。6、7、10、11、}種々の酵素免疫測定法（ELISA）は市販されており、マルチウェルプレート上で一度に複数のサンプルを分析するために使用可能に連結されました。手続きには数時間かかることがあり、連続反応工程で構成されています。反応の最終生成物は、検量線に基づいて、標的分子の濃度を決定するために、光学的に検出することができます。

クラシックSPE手順は、吸着剤プレコンディショニング、サンプル抽出、洗浄、溶出、および溶離液の蒸発による濃縮を含みます。この抽出物の希釈のために使用される溶....

Protocol

注意：以下のプロトコルは、SPEが50％（v / v）のメタノールで18の吸着剤および溶出で100mlの水のサンプルに対して行う説明します。酵素免疫測定法（ELISA）キットを用いて連結された濃縮されたサンプルは、分析前に10％（v / v）のメタノールに達するように希釈されます。

1.試薬の準備

1. 水サンプルを準備
   1. 他のステップの前に、0.2μmの孔径のフィルターを各100 mlの水のサンプルをフィルタリングします。
   2. 水の量に参照溶液の適切な量を希釈することにより、所望の濃度でサンプルをスパイク。例えば、300μgの/ Lの濃度のE2参照溶液の3.3μLを希釈することにより、E2の100 ngの/ Lの水サンプルを100mlを調製します。 10 ngの/ L E2をスパイクサンプルを得るために、このソリューションを10回希釈します。 1 ngの/ L E2で100mlのサンプルを取得するために、この後者に別の10倍希釈します。
   3. Gでガラス瓶にろ過した試料（未修正またはスパイク）を配置L45スレッド。同じ日にサンプルを使用してください。初期濃度を推定するためにELISAを用いて分析する小さな部分を取ります。
2. タイトなチューブに50％v / vのに脱イオン（ジ）を水にメタノールを希釈することにより溶離液の300μlのを準備します。

Results

吸着剤の充填の再現性は、乾燥することによって評価し、ガラスバイアルにピペッティング吸着剤を重み付けし、その結果を図1に示された。 図2に示すように、注入の時間の再現性を、100 mlのサンプルを試験した。初期およびプレで濃縮スパイクされたサンプルは、17βエストラジオールのための市販のELISAキットを用いて測定し、 図3に示されて濃縮しました。

提案された手順は、吸着相（ 図1）の調製のためのユーザを含みます。吸着剤粒子は、機械的安定性のための2つの膜の間保持され、密列中の懸濁液をピペットながら注射器で加えられる圧力によってパックされています。結果の列は、この値のわずか6％の誤差で選ばれた吸着剤の6ミリグラムの最適化された量が含まれています。このステップは、働き吸着剤のコンディショニ.......

Discussion

イムノアッセイを用いて分析を行った水試料の調製のための新しい方法を提案しました。機器は、自動化されたユーザーフレンドリーな方法で固相抽出を行うことができます。

システムに前の注入に水試料の濾過が非常に重要です。溶液中にまだ存在する任意の粒子は、潜在的に流体ネットワークの目詰まりの原因とSPEカラムを妨害します。もう一つの重要なステップは、SPEカラムの製造です。カラム中の粒子の量は、可能な限り最高のパフォーマンスを達成することが重要です。粒子の凝集を回避するために、吸着剤粒子の懸濁液を調製する場合には、特別な注意が必要です。この吸着剤は、乾燥し、次いで脱イオン水画分に第一の溶媒の画分を添加することによって達成されます。ピペットで100μLを吸引しながら、包装工程の間に、それはよくサスペンションを混合することが重要です。 SPEのプロの終わりcedureは、システムを適切に洗浄することが重要です。異なるサンプルを扱う場合、まず、それは、交差汚染を防止し、そして第二に、それは、それが使用されていない機器の生物汚染の危険性を回避します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
フィルターメンブレン0.2 μm 細孔径	メルク ミリポア	GNWP04700	サンプルろ過用
ナイロン膜 11 μm孔径	メルクミリポア	NY1104700	SPEカラム用
使い捨て生検パンチ 5 mm	医療予算	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μm 粒子径
合成海水	シグマ アルドリッチ	SSWS500-500ML
メタノール	VWR
17β-エストラジオール標準	エンツォ ライフサイエンス		300 ng/ml
17β-エストラジオール ELISA キット	エンツォ ライフサイエンス	ADI-900-008	96 ウェル、範囲 30 - 3,000 ng/L