効率的な哺乳動物細胞発現および結晶化のための細胞外糖タンパク質のシングルステップの精製

Daniel L. Kober; Zeynep Yurtsever; Thomas J. Brett

doi:10.3791/53445

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方法論記事

効率的な哺乳動物細胞発現および結晶化のための細胞外糖タンパク質のシングルステップの精製

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DOI:

10.3791/53445

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2015年12月23日

Daniel L. Kober^*¹^,²^,³ , Zeynep Yurtsever^*²^,³^,⁴^,⁵ , Thomas J. Brett²^,³^,⁵^,⁶^,⁷

¹Molecular Microbiology and Microbial Pathogenesis Program, Washington University School of Medicine, ²Department of Internal Medicine, Washington University School of Medicine, ³Drug Discovery Program in Pulmonary and Critical Care Medicine, Washington University School of Medicine, ⁴Biochemistry Program, Washington University School of Medicine, ⁵Center for the Investigation of Membrane Excitability Diseases, Washington University School of Medicine, ⁶Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, ⁷Department of Cell Biology and Physiology, Washington University School of Medicine

^* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

これは、分泌されたグリコシル化された哺乳類タンパク質の生産と、その後のX線結晶構造解析やその他の生物物理学的研究のための十分な収量の均質なタンパク質のシングルステップ精製のための迅速で費用対効果の高いプロトコルです。

要約

>jove_content<構造的および生物物理学的研究のための分泌された哺乳類タンパク質の生産は、困難で、時間がかかり、費用がかかる可能性があります。ここでは、哺乳動物細胞における分泌タンパク質発現とニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用したワンステップ精製のための時間とコスト効率の高いプロトコールについて説明します。このシステムは、懸濁液中の哺乳動物細胞の大規模な一過性トランスフェクションに基づいており、発現ウイルスの開発や安定発現細胞株の生成などのステップを排除するため、タンパク質の産生時間が大幅に短縮されます。このプロトコルは、簡単な化学修飾によって簡単に作ることができる安価なトランスフェクション剤、またはトランスフェクション効率の向上と細胞毒性の低減により収率を向上させる手頃な価格のトランスフェクション剤を利用しています。培地のグルコースレベルを注意深くモニタリングし、維持することで、タンパク質の収量が増加します。発現ステップで天然糖鎖の成熟を制御することで、適切に折りたたまれた機能的な哺乳類タンパク質の最終収率が増加するため、X線結晶構造解析を追求するのに理想的な特性です。場合によっては、シングルステップ精製により、結晶化に十分な純度のタンパク質が生成され、ここではその例として示されています。

概要

原子レベルでタンパク質の構造を理解することは、生物学的経路および疾患の分子基盤を解明する鍵となります。 X線タンパク質結晶学は、高分子構造を決定するための最も広く使用される/適用可能な方法です。この方法の主な課題は、適切に折り畳まれた、純粋なタンパク質の十分な量を得ることです。これは、特に、特定の翻訳後修飾を受ける哺乳類分泌タンパク質を扱う問題となります。

細菌発現タンパク質は、タンパク質データバンク¹に堆積し結晶化するタンパク質の主要な源です。それらは安価、高速であり、典型的にはタンパク質の高収量を産生するための細菌発現系は、主に好ましいです。しかし、細菌中で発現哺乳動物タンパク質の細胞外ドメインは、多くの場合、適切にケースがリフォールディングし、大規模な精製工程をfoを均一に得るために必要とされる、折り畳まれていませんldedタンパク質。さらに、多くの哺乳動物タンパク質は、適切なフォールディング^{2を達成するために} 、翻訳後グリコシル化を必要とします。酵母または昆虫細胞での発現およびグリコシル化は、フォールディングの問題を克服することができるが、グリコシル化を含む翻訳後修飾は、不正確なまたは不均一な修飾を有するタンパク質をもたらす、哺乳動物細胞³のものとは大きく異なります。

哺乳動物細胞は、適切な翻訳後修飾や折りたたみを確保するために必要なすべての分子機....