パラレル・セグメントフローカラムをチューニングし、多重化された検出のイネーブル化

サマリー

ここでは、マルチプレックス検出を可能にするための並列セグメントフロークロマトグラフィーカラムの操作とチューニングのためのプロトコルを提示します。

要約

アクティブフローテクノロジー(AFT)は、フローの不均一性を克服し、効率と感度の面で分離性能を向上させ、多重検出を可能にするために設計された新しい形のカラムテクノロジーです。この形式のAFTは、平行セグメントフロー(PSF)カラムを使用します。PSFカラムアウトレットエンドフィッティングは、2つまたは4つのポートで構成されており、最大4つの検出器を接続するために多重化できます。PSFカラムは、マルチプレックス検出用のプラットフォームだけでなく、破壊検出器と非破壊検出器の両方を同時に組み合わせることができ、デッドボリュームチューブを追加する必要はありません。各ポートを通る流量は、特定の検出器の要件に合わせて圧力管理を通じて調整することもできます。PSFカラムを使用してマルチプレックス検出を実現するためには、最適な分離性能と結果の品質を確保するために制御できるいくつかのパラメーターがあります。つまり、各ポートのチューブ寸法、各タイプの検出器のポートの選択、および流量調整です。このプロトコルは、多重化検出モードで機能する PSF 列の使用方法とチューニング方法を示すことを目的としています。

概要

アクティブ・フロー・テクノロジーの列

アクティブフロー技術（AFT）クロマトグラフィーカラムは、最近の流れ異質^1-6に関連した分離において非効率性を克服するために開発され、また、多重化された検出を可能にします。この特定の通信我々の詳細に並列の運用プロセスは、多重化された検出と流れ（PSF）の列をセグメント化。 PSF列の主要な機能の利点は次のとおりです：（1）カラムベッドの径方向中心領域からの流れは、（2）検出によって処理されなければならない移動相の体積流量の周辺や壁の領域から分離されていますソースが低減され、そして（3）検出ソースは、各検出処理を横切っ検出遅延を点滴、またはその後ポストカラム流ストリーム^7,8の分割を必要とすることなく、試料情報を拡張するために多重化することができます。 Aを可能PSF列の設計において重要な特徴多重化検出のdvantageは新規アウトレットフィッティングとフリット集合体である。 図1は、従来のカラムに比べAFT列の写真です。これは、セグメント化されたパラレルフローカラムを使用して得られた分割処理は、ポストカラム流ストリーム分割と同じではないことを理解することが重要です。ポストカラム流量で流れは、尾の先端にリーディングエッジからサ ​​ンプル全体バンドを分割均等に（ すなわち、軸方向）にサンプリングされ、それによって、各フローストリームは、効率性と感度に関して等しいです。感度の大きさは、それによって多数の分割により分割されます。 PSFにおいて、しかしながら、分割処理サンプルバンド半径方向、軸方向ではありません。このように、中央のポートサンプルピーク頂点 - ピークの最も集中領域。ピークが拡散テーリング地域によって希釈されていないとしてこのように、ここでの感度が最も高いです。周辺機器ポートから溶出した試料は、セントラほど効率的ではありませんバンドではなく、軸方向よりも半径方向にサンプリングされるので、Lゾーン、しかしは、ピークの幅、 すなわち、軸方向にポストカラムスプリットピークを分割サンプリングプロセスの場合よりも狭くなっています。したがって、濃度依存性の検出感度が低下しません。

PSFの欄では、出口のフィッティングには、複数の出口ポートを備え、フィット、この最後の内側に環状のフリットが収容されています。出口フリットチャンネルの外側半径方向部分は、周辺又は壁領域流出ポートを介してカラムから流出しながら、この環状フリットチャネルの内側部分は、半径方向の中央の出口ポートを介して、カラムから流出します。出口フリットの内側と外側の部分は、これらの流れ領域^{2との間の}クロスフローを防止する不透過性のバリアによって分離されています。この設計の結果として、カラム床を通る中央の半径方向の流れストリームは、壁領域流インから分離されています列をIDE。これらの二つの領域からの流れの相対的な部分は、分離効率や検出感度などのカラム技術の様々な機能的態様を最適化するために、圧力管理​​を介して、ほぼ任意の所望の比率を変化させることができます。本質的に、この設計は、効果的により狭い内径を有する、大きなフォーマット列内の「仮想」列を確立し、真の壁のない列として従って列関数、カラムベッドの不均一や壁効果^{9,10を克服します} 。

PSF列の主な利点は、検出のソース（S）のための溶媒処理の最小カラム効率の向上であり、多重化された検出を可能にします。しかし、付加的な利点は、テーリングので、任意のバンドの領域を臨むが溶出または検出時の溶質がそうでなければ、同じ秒間観察されるよりも高い濃度で存在する全体的な溶出プロフィールから削除されているということです採用分割比に応じて、従来のカラムに注入し、集中荷重をolute。結果として、多くの場合、PSFの列²で行わ分離のための信号強度の利得が観察されます。実際には、分割比は、4つの出口ポートの各々からの流れ出口の25％は、紫外線（UV）検出を用いて観察されたシグナル強度は、従来のを使用して明らかなように正確に同じ信号強度を実質的に示しているように調整された場合移動相の全体（100％）の^7を分析するカラム。また、中央壁流れ領域との間の出口比の微調整は、カラム効率を最適化することを可能にします。 （1）流量、（2）分割比、及び（3）溶質保持因子：カラム効率の向上は、これらの効率性の向上は、三つの要因の関数であるので、1つの値を記載することができないAFTカラムを使用して観察します。それにもかかわらず、効率の向上はCONVと比較entional列はほとんど常に観察され、時にはこれらのゲインは理論プレート^1,2の数が100％以上です。調整する能力は、分割比は、アナリストが効果的に「仮想」列の直径を調整することができ、これは検出プロセスに関連する重要な要因です。分割比がラジアル中央出口から溶出する移動相の21％である場合、例えば、仮想2.1 mmの内径（ID）欄は、物理4.6 mmのIDカラムから確立されます。これらの条件下では、仮想2.1 mmのIDカラムは、流速に応じて、従来の2.1 mmのIDカラムよりも70％以上大きくすることができる効率的に行い、溶質保持率^10。

多重化検出のために使用される現在のPSFの列設計は、4ポートフィッティング出口組み込むが、列しかし、これは検出さtを制限し、2ポートのエンドフィッティングでも取り付けることができ2つだけの検出器O。これらの列の基本的な動作は、4つの検出器が多重化検出のための範囲を広げる4ポート出口PSFカラムに同時に結合することができる以外は、しかしながら、同じです。別に前後の列接続管から、PSFの列を操作するための唯一の追加要件は、周辺出口ポートに接続することができ、チューブ、各チューブを通過する移動相の量を測定することができる手段であります通常、質量測定または容積測定のいずれか。チューニングを容易にするために、すべての出口流管の内径は同じでなければなりません。末梢および半径方向の中央の出口ポートとの間の流量比は、単に嵌合周辺出口、または半径方向の中央の出口ポートにチューブポスト検出器の長さに位置する配管の長さを変更することにより、圧力管理​​を使用することによって変更されます。

多重化検出PSFの列を使用して

PSF列の重要な利点は、排出出口ポートの各々は、このように多重化された検出を可能にする、検出ソースに直接接続することができることです。うまく設計された検出システムでは、多重化検出を備えた単一の分析では、試料中の成分の性質に関しての実質的な情報を提供することができます。重要なことには、破壊的な及び非破壊検査は、検出遅れなく、正確に同じ時間で行うことができます。これは、UVおよび/ ​​または質量分析（MS）検出応答^7,11で溶出することが観察さコンポーネントと^{、DPPH•試薬}を使用して、たとえば、抗酸化剤の絶対的な割り当てを可能にします。したがって、4つの独立した検出器は、4つの出口ポートのいずれかを介して検出器に向かう流れの適切な部分と同時に動作させることができます。これらのポートを通る流れを容易に検出器のいずれかに到達する溶質の量を調整することができるので、合わせて調整することができ指定された検出器のソースの感度。これは、最も効率的な溶質の移動を半径方向の中央の出口ポートを介して観察されることに留意すべきです。周辺ポートの各々は、各ポートを介して25％に設定すると、ほんの少しだけ効率の低い従来のカラムよりも同等の分離効率を提供します。このように、定量的な検出器は、半径方向の中央出口からの試料を分析するように設定することが重要です。

多重検出の目的のためのPSFの列を設定する際に、効率的かつ高品質の結果を達成するためになされる必要がある考慮事項の数があります。それは、検出器および流量調整のタイプにどのポートを選択する各ポートのチューブ寸法です。

各ポートのチューブ寸法

クロマトグラフィーではポストカラムチューブの長さは、分離の効率と性能に重要な役割を果たしています。大DEA検出器へのカラム出口からの長いまたはワイドIDチュービングの結果、D-ボリュームは、効率、分解能と感度が失われます。多重化の利点を提供しながら、効率的な分離を提供する上での最大の可能性を達成するために、PSFの列を設定するときにこのように、適切なチューブの寸法が利用されなければなりません。

検出器へのポート

図2は、多重化検出（紫外-可視（U可視）、質量分析（MS）および2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル^{（DPPH•）}検出）の設定例を示す図です。図は、中央のポートは^DPPH•一方で、MS検出器に取り付けられており、紫外可視検出器は、周辺ポートに接続されている示しています。 MS三の最も敏感な検出器であるので、この検出器への流れは、中央吹出口から指示されました。 ^{DPPH•検出}としてpresencに選択的です酸化防止剤のE、およびバンドの広がりに最も敏感で、最も寛容は、この検出器への流れは、周辺ポートから指示されました。 UV-Visの二次「一般的な」検出器だったので、この検出器に流れは、第二の周辺ポートから指示されました。

流量調整

適切な管が検出器に取り付けられたポートから一旦、各検出器から出た流れは、必要な量に調整することができます。各検出器から出る流れの量を測定するための簡単​​な方法は、所定の期間にわたって各ポート​​を介して溶出する移動相の量を計量することです。パーセンテージの流れはこのようにして決定することができ、流量比は、いずれかの短縮によって調整または最適な検出器の要件に合うようにそれに応じて検出器に排出ラインに取り付けられたチューブを長くすることができます。異なる検出器は、例えば、フローセルは、フローの異なる要件を有しています蛍光検出器（FLD）の速度が制限されない流れが、注意がフローセルの過剰加圧を避けるように注意しなければなりません。したがってFLDを通る流れの制御は、通常、他の検出器を横切る圧力降下を調整することによって達成され、流れの残りはその後FLDを通過します。配信される流れの量に敏感な検出器は、MSです。一般的に、現在のハイエンドの質量分析計は、約1〜1.5ミリリットル/中程度の水移動相の分を容易に処理することができます。この流量の上に、ソースの洪水は、MSが動作不能にすることがあります。しかし、ほとんどの質量分析計で検出感度は低い流速を使用することによって恩恵を受けれます。したがってPSF分流機能がMS検出を含む用途に極めて有用です。高いカラム体積流量はなく、MS検出器に運ば低容量負荷と、利用することができます。 MS検出器への流れの調整は、しかし、前圧力降下を調整することによって行われなければなりませんMS検出器ではなく、後のMS。圧力は容易に不適切なデッドボリュームを追加することなく調整することができ、ここで、ナローボアチューブ（0.1 mm内径）を使用することは、非常に有用です。

検出器のタイプに応じて分割比の調整は、いずれかの事前または事後検出を行うことができます。そのような可視UVなどの非破壊検出器が使用される場合、フロー率を測定し、後の検出器を同調させることになります。単一の破壊的な検出器がセットアップマルチプレックスで使用されている場合、フロー比率は、他のバックポートフロー比率に関して計算することによって決定されます。試薬ベースの検出器は^、DPPH•として使用される場合、流動比率は、試薬の添加なしポスト検出器で測定します。二つ以上の破壊的な検出器が使用されている場合には、その後流量比は、予め検出器で測定されます。追加の機器を必要とするかもしれない検出システムは、このような^DPPH•は 、流れを変えることがあり、余分なシステム圧力を持っています一度検出システムに接続されている割合。そのため、慎重に検討は、破壊的な検出器のシステム圧力、流量の割合を調整する前の検出器に支払われるべきです。関係なく、ポートのいずれかを介して設定された流量比の、定量的な情報は、適切な標準化を介して取得する必要があります。流量比が設定されると、しかし、それらは、ロバストであり、それらは、勾配溶出条件⁷の下であっても変化しません

この原稿を伴う詳細なビデオプロトコルは、検出の多重化モードでPSF列機能を使用してチューニングする方法を示すことを意図しています。

プロトコル

注：このプロトコルは、多重化された検出のための複数の検出器に結合されたHPLCシステムでPSFの列を使用する方法に関する説明が記載されています。プロトコルは、読者がクロマトグラフィー、様々なHPLC検出方法における基本的な知識と経験を持っていると仮定すると書かれています。

注意：（ すなわち、メタノールのためのMSDS）は、使用する前に、すべての材料および試薬の材料安全データシート（MSDS）をご参照ください。溶剤および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を溶離液を取り扱うときは、すべての適切な安全対策を使用することを確認してください。 HPLC、分析天びんと検出器計測器の技術的管理の適切な使用を確保し、個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、およびクローズドつま先の靴）を使用することを保証します。

HPLC機器の1.セットアップ

1. LIN用の超純水（例えば、100％のミリQ水）を用いたHPLC機器を準備します移動相としてのラインBのE Aと、100％メタノールとメーカーの要件ごとにポンプをパージします。それはここでそのまま使用する検出器の一つは、MSである場合、移動相AとBの両方に0.1％のギ酸を添加
2. 図2に示すように、HPLC楽器部品および検出器を設定する。検出器と列の間のデッドボリュームを最小にするようにこれは、列に対して検出器の便利な配置を必要とします。 HPLCシステム構成の自由度が望ましいです。

2.紫外 - 可視のセットアップおよびMS検出器

1. 対象サンプルに依存して所望の波長の紫外・可視検出器（ 例えば、280 nm）を設定します。
2. フルスキャンの検出方法を用いて、総イオンカウント（TIC）分析のためのポジティブモードでMS検出器を設定します。また、それに応じて、以下のMSのパラメータを調整する：気化温度500℃で、キャピラリー温度350℃で、60単位の割合に設定シースガス、補助ガス流を40と5ユニットのガス流、スプレー電圧3.5 kVのスイープ。これらの設定は、分析されるサンプルに依存して特定のユーザーの要件については、後で調整することができます。

^{DPPH•システム}の検出器の2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジルラジカル^{（DPPH•）}試薬セットアップの調製

1. ^DPPH•25mgを秤量し、メスフラスコにメタノール250mlに溶解します。
2. ^{DPPH•試薬に}ギ酸250μlのを追加します。光への暴露を防止するために箔でフラスコをカバー。
3. 10分間^{DPPH•試薬}を含有するフラスコを超音波処理。
4. メーカーの要件ごとのように調製し^{、DPPH•試薬とDPPH•ポンプを}パージします。
5. Tピースの入口にポンプラインを取り付けることにより、 図2に記載の ^{DPPH•システム}を設定します。
6. 目に100μlの反応コイルを取り付けTピースのE出口とは、検出器に反応コイルのもう一方の端を接続します。
7. およびカラムヒーターで反応包むコイル60℃のカラムヒーターの温度を設定します。
8. 520 nmの^DPPH•紫外可視検出器を設定します。

PSFの列の4セットアップ

1. HPLC装置にPSFのカラムの入口に接続します。
2. 0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを使用して、MS検出器の中心にポートを接続します。
3. 0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを用いてUV-Visの検出器へのペリフェラルポートに接続します。
4. 0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを使用して^{DPPH•検出システムの} Tピースに他のペリフェラルポートに接続します。
5. 列のストッパーを使用して、未使用のペリフェラルポートをブロックします。
6. 100％メタノール（0.1％ギ酸） -分1 ^ml -1の100％の線BにまでHPLCポンプの流量をもたらします。
7. 100％メタノールの携帯pHを有するカラムを平衡化内径4.6 mm×250 mm長さ列の20分間のASE。この時間は、ユーザが使用することができる他の列の寸法に応じてスケーリングされます。

5.マルチプレックス検出のためのPSF列のチューニング

1. 化学天秤を用いて、少なくとも2つの空の回収容器（UV-Visの検出および^{DPPH•検出器}のための1つに接続されているポートごとに1つ）の質量を測定します。
2. 二つの別個の、予め秤量した回収容器（5.1）に紫外可視および^{DPPH•ポートから}移動相を収集します。収集のための時間を記録します。各容器内の溶媒の少なくとも500ミリグラムを収集します。
3. 回収容器を計量し、移動相の質量を決定します。メタノールの密度は0.791グラムのミリリットル^-1で考えると、各ポートから収集した移動相の量を決定します。
4. 違いによって、すなわち、名目上のポンプ設定流量マイナス^DPPH•通る流量とUV-VisのdetectoRフローポートは、MS検出器への流量を決定します。総流量の割合として各流割合を発現します。
   注：理想的には、フローの割合は以下のとおりです。MSに^{DPPH•検出器に} 22％、60％、可視紫外線に、総流量の18％です。
5. そうでない場合、紫外可視検出器上の背圧を変化させることにより流量割合を調節します。例えば、UV-可視の流量が高すぎる場合、紫外可視検出器の出口に0.13ミリメートルIDチューブの15cmの部分を追加添加することによって、比率を減少させます。その後5.5に、手順5.1を繰り返します。

6.最後の設定条件

1. ^{DPPH•検出器に}接続された出口ポートを出る同じ流量に^{DPPH•試薬}ポンプの流量を設定します。
   注意：紫外-可視と多重化PSF列を^、DPPH•MSは今分析の準備ができています。

結果

多重化されたHPLC分析は、PSFモード（ 図1）でAFTカラムを用いて行うと、図2に示すように設定した。このタイプのセットアップは、コーヒーサンプルは合計でUV-Visの^、DPPH•およびMSを用いて同時に分析することが許可されイオンカウント（TIC）モード。クロマトグラムを同時に記録したことから、 図3に示すように、保持時間のアラインメントに基づいてTIC回答- ^DPPH•に応えコーヒーサンプルの化合物は、簡単に、UV-VisのとMSまで一致させることができました。肯定応答は、MS-TICの検出器から見た場合には、ピークの分子質量を記録した。 表1に ^{DPPH•ピーク}の保持時間、及びUV可視及び/またはMSにこのようなピークの応答したがって、分子量を提供検出器。 AFのために許可された異なる検出プロセス間のマッチングピークを容易にコー​​ヒーなどの複雑なサンプルのスクリーニングおよび特徴付けのAST、より効率的な形式。

ディスカッション

本研究では、並列セグメント化されたフロー（PSF）のカラムを用いて多重化検出を備えたHPLCを使用してコーヒーの特性とプロファイリングを伴います。 PSFカラムを用いて多重化されたHPLCは、従来の多検出プロセスを使用してかかる時間の画分内の分子固有情報のより大きな程度を得ながら、サンプルのデータの複雑さを低減することにより、キーの化学物質の特徴付けおよび同定を可能にします。 PSFの列には、多重化検出のためのプラットフォームを可能にするだけでなく、追加のデッドボリュームとチューブなしの両方の破壊的および非破壊検出器の組み合わせ。 ^DPPH•、紫外-可視およびMS（TIC）は、エスプレッソコーヒーの分析のために多重化されました。

4ポートPSFカラムは、3つの異なる検出器を用いたコーヒーの多重化分析に使用しました。 PSFのカラム出口の中央口はMS検出器およびTHREの2つに接続されましたE周辺ポートは^{DPPH•検出システム}またはUV可視検出器のいずれかに接続されていました。第三の利用可能なペリフェラルポートが使用されなかったため、カラ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HPLC装置			マルチプレックス検出のための選択可能な複数の検出器。選択した検出器には、追加の計装、例:、ポンプが必要になる場合があります。
パラレルセグメントフローHPLCカラム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	定義	まもなく商品化される
メタノール	任意のブランド		HPLCグレード
PEEKチューブ	任意のブランド		さまざまな長さと内径
カラムストッパー	任意のブランド		未使用の周辺機器ポートをブロックします。
PEEKチューブカッター	任意のブランド
分析スケールバランス	任意のブランド
ストップウォッチ	任意のブランド
溶離液収集容器	任意のブランドの		1-2mlサンプルバイアルを溶離液収集容器として使用できます

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