反応フロー高速液体クロマトグラフィー用カラムを使用したポストカラム誘導体化

Summary

ポストカラム誘導体化(PCD)を採用する方法のための反応流高速液体クロマトグラフィーカラムの使用に関するプロトコールが提示されます。

Abstract

ポストカラム誘導体化(PCD)を採用する方法のための反応流高速液体クロマトグラフィーカラムの使用に関するプロトコールが提示されます。PCDを最新のHPLCシステムやカラムに適合させる際の大きな困難は、試薬の混合とその後の誘導体化反応を可能にする大容量の反応コイルの必要性です。この大きなポストカラムデッドボリュームはバンドの広がりにつながり、観察された分離効率と実際の感度の検出が失われます。反応フローポストカラム誘導体化(RF-PCD)では、誘導体化試薬は移動相の流れに逆らって反応フローカラムの1つまたは2つの外側ポートにポンプで送られ、カラムエンドフィッティング内に収納されたフリット内でカラム廃液と混合されます。この技術により、カラム廃液と誘導体化試薬の混合がより効率的になり、反応ループの体積を最小限に抑えるか、完全に排除することができます。RF-PCD法は、観察された分離効率とS/N比の点で、従来のPCD法よりも優れた性能を発揮することがわかっています。RF-PCD技術のさらなる利点は、中央港から来る廃水をその劣った状態で監視する能力です。RF-PCDは現在、比較的狭い範囲のポストカラム反応で試験されていますが、現在のところ、RF-PCDが既存の1つまたは2つの成分(両方の試薬が同時に添加される限り)のカラム誘導体化反応に適応できないと示唆する理由はありません。

Introduction

ポストカラム誘導体化（PCD）と結合された高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、分析研究室で多くの問題を解決するのに有用である強力なツールです。これは、利用可能な検出器^1,2のスイートとさもなければ検出不能である化合物を検出し、選択的検出および定量^3-5の下限を許可または標的分析物のシグナルを増加させることができることを避けるために、標的分析物を誘導体化マトリックス効果^6。一般的に使用されるPCD反応は^、9,10またはフルオレサミン^11,12ニンヒドリン、2,2-ジフェニルと反応性酸素種（ROS）の誘導体をオルト-フタルアルデヒド^7-9を有するアミノ酸などのアミンとの反応を含みます1- picrylhydrazilラジカル^{（DPPH•）13,14、}または2,2'-アジノ-ビス（3-ethylbenzothiazoline -6-スルホン酸^{（ABTS）15,16、}および硫黄cを誘導体化するためにヨウ化アジド試薬の使用ontaining化合物^17,18。

HPLCシステム⁶を有するPCD反応の使用には多くの欠点は、しかし、存在します。主にこれらの間混合し^、8を発生するための反応時間を可能にする誘導体化試薬（....

Protocol

注意：（ すなわち 、メタノールのためのMSDS）は、使用する前に、すべての材料および試薬のための材料安全データシート（MSDS）をご参照ください。溶剤および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を溶離液を取り扱うときは、すべての適切な安全対策を使用することを確認してください。 HPLC、分析天びんと検出器計測器の技術的管理の適切な使用を確保し、個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、およびクローズドつま先の靴）を使用することを保証します。

注：このプロトコルは、目的の化学化合物の性質に固有の異なる試薬と反応流ポストカラム誘導体化の3つの方法（RF-PCD）技術、それぞれについて説明します。 ROSの解析については^{、「DPPH•を}使用してROSの1検出」に進み、第一級アミンの分析については、「カミンを使用して、第一級アミンの2検出」、およびフェノール化合物の分析のために」セクションに移動を参照してください3 。フェノール類の検出4-aminoantipyreneとフェリシアン化カリウム」を使用して。全体に超純水（ 例えば 、ミリQ水）を使用します。

注：RF列の接続が主な違いは、RF列の端金具の数であると従来のHPLCカラムとほぼ同じ方法で達成されます。 HPLCシステムに標準的なHPLCカラムを接続するために使用される継手は、HPLCシステムへRF列を接続するために使用されることが可能です。

DP....

Results

RF-PCDによる使用のために適合された第一のPCD法は、2,2-ジフェニル-1- picrylhydrazilラジカル^{（DPPH•）24を}用いて^、酸化防止剤の誘導体でした。この反応は^、25。コーレバらによって導入された、広く以来使用されています。検出は、活性酸素種の存在下でDPPHラジカル^•の脱色、観察された吸光度の低下で抗酸化物質の結果のそれ故に存在に依存しています。 ^{DPPH•反応}は、多くの場合、しかし、それは、RF-PCDカラムを使用時に反応ループを必要としないことがわかった、500μL以上^13-15の大型反応ループを採用している。 図5は、使用して誘導体化リステロットコーヒーのサンプルの2つのクロマトグラムを示しています従来のPCDとRF-PCDの計測器の両方を使用して、DPPHラジカル^•。

RF-PCDによる使用のために適合.......

Discussion

RF-PCDは、バンドの広がりの影響を最小化し、分離性能を向上させる、反応コイルを使用することなくHPLC廃液ポストカラムで誘導体化試薬の効率的な混合を可能にします。 RF-PCD法はまた、検出方法に対する信号応答の改善を示しています。 Camenzuli ら ^28は、エスプレッソコーヒー、試料中のROSの検出のための^DPPH•との反応流列の使用を初めて報告しました。彼らの研究は、種々の^{DPPH•試薬}流量の^{DPPH•濃度}の範囲を試験し、最高のパフォーマンスを達成するRF状態の分析および最適化を含みました。これは、0.1ミリグラムml ^-1の0.5ミリリットル分の^DPPH•試薬の流量での^{DPPH•濃度}は^-1 RF-PCDの下で改善された分離性能（ すなわち 、効率性と感度）のための最適であると結論しました^{DPPH•誘導体}化の従来のPCD法に比べて条件。 図5は、エスプレッソ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC装置	Agilent	1290シリーズ HPLC
誘導体化システム用追加ポンプ	島津製作所	LC-20A
RFコラム			非商用
PEEKチューブ	Sigma アルドリッチ	Z227307
カラムストッパー			カラム
PEEKチューブカッター	Sigmaアルドリッチ	Z290882
分析スケール天秤			4点分析天秤
ストップウォッチ			非科学的な機器
溶離液収集バイアル			底が平らな小さなバイアルなら何でもいい、例えば、HPLCバイ
アル HPLCバイアル			使用する
機器によって異なります移動相および誘導体化溶液用容器	Sigma Aldrich	Z232211
一般実験用ガラス器具			容積フラスコ、ピペット、など 量と容量はサンプル調製方法によって異なります。
メタノール	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
酢酸アンモニウム	Σ Aldrich	17836
アンモニア	Σ Aldrich	320145	腐食性
アセトニトリル	Σ Aldrich	34998
Fluorescamine	Sigma Aldrich	F9015
4-アミノ解熱	Acros Organics BVBA	AC103151000
フェリシアン化カリウム	アナ	ラーB10204-30