Method Article

の発達過程を追跡し、定量化 C。エレガンスオープンソースのツールを使用しました

DOI:

10.3791/53469

⸱

December 16th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Buchmann Institute for Molecular Life Sciences and Institute of Biochemistry II, School of Medicine, Goethe University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、C.エレガンスの発生過程を追跡し定量化する方法を示しています。提示されている方法は、簡単に実装できるオープンソースのツールに基づいています。3D細胞形状モデルの再構築方法、細胞内構造の手動追跡方法、皮質収縮流の解析方法などを実演します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

定量的に発生過程を捉えることは、変異体の表現型を識別し、記述するためのメカニズムのモデルと鍵を導出することが重要です。ここではプロトコルは、胚および成体Cを調製するために提示されていますエレガンス短期および長期タイムラプス顕微鏡検査のために動物や発達過程の追跡と定量化のための方法。提示された方法は、すべてのCに基づいています線虫遺伝学センターから入手でき、簡単に独立して使用する顕微鏡システムのいずれかの実験室で実現することができるオープンソースソフトウェアの株エレガンス 。モデリングソフトウェアIMOD、汎用の画像解析プログラムEndrovを使用して蛍光標識された細胞内構造の手動追跡、及びPIVlab（時間分解デジタル粒子画像流速を使用して、皮質収縮フローの分析を用いて、3Dセル形状モデルの再構築MATLAB用ツール）が示されています。しかし、これらの方法はまた、Tを展開する方法を説明されていますO定量的に、細胞追跡と系譜トレース 、 例えば 、小胞の流れの追跡を異なるモデルの他の発生プロセスをキャプチャします。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛍光タンパク質、ゲノム工学、光学顕微鏡、およびコンピュータ・ソフト及びハードウェアの着実な改善と、それは前例のない、時空間分解能で多くのモデル生物の開発を記録することが可能になりました。これは、研究者は、以前に対処することができなかった質問をするか、見落とさ側面を探索するために知られている発達過程を再検討することができます。この進歩は、徹底した測定と統計解析によって定量的モデルに定性的な、非公式のモデルを変換することを目的と量的発生生物学の分野を巻き起こしました。

追跡細胞と細胞内構造は、胚発生、神経系の活性、または細胞分裂1-12の定量的モデルを導出することを可能にしました。 Cの初期の開発中に細胞分裂の残党を追跡することによりエレガンス胚 、我々は、彼らがステレオに従っていることを明らかに最近できましたパスを入力し、構成する重要な偏光は13,14因子 。

ここでは、プロトコルは、非専門家のためのアクセス可能な定量的な発生生物学のアプローチを行うことが提示されています。焦点は、標準的な共焦点顕微鏡およびコンピュータへのアクセスを持つ任意のラボで実施可能である3つのストレートフォワード、自由に利用できるツールです。これらは、3Dセル形状を生成するためのプロトコル、細胞分裂の残....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.の調製エレガンス胚は、タイムラプス顕微鏡用のマイクロビーズを使用して

  1. 歯のピック/ピペット先端に取り付けられた第1の勢いよく撹拌した後、アイラッシュを使用して、M9の隣のドロップにそれぞれワームを転送することによりM9バッファのドロップにワームピック（白金線）を使用して妊娠成虫を移し、細菌をきれいにまたは尖ったガラスキャピラリーを使用しています。
  2. M9緩衝液中に直径20μmのポリスチレンビーズの10倍を含有する分散液を希釈し（1 L M9バッファーが3gのKH 2 PO 4、6グラムHPO 4、5グラムのNaCl、及び、オートクレーブ後（20分、120℃2のNaが含まれC）、）、1MのMgSO 4溶液の追加の1ミリリットルを追加します。
  3. 薄いガラスキャピラリー（例えば、注射針を引っ張るために使用されるポイントの毛細血管または毛細血管を溶融）、およそ0.5メートル長いゴムの作品、シリコーンまたは類似の材料のチューブ（理想的に透明）、200μlの任意のタイプから口のピペットを作りますピペットチップ、200μlのPCRチューブの蓋、小さな注射器（ 例えば 、0.2から0.45ミクロンの細孔径と15〜50ミリメートル直径ナイロン、PTFEまたは類似の材料のフィルター）、1000μl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プロトコール2、3、および4を使用して、野生型における生殖腺の、タイムラプスイメージングC.エレガンス大人が実行される（株OD58（UNC-119（ED3）III; ltIs38 [PAA1;パイ-1 :: GFP :: PH（PLC1delta1）+ UNC-119（+）]）、生殖細胞系のプロモーターからの膜マーカーを発現します）。生殖腺の順番に着目し、生殖細胞の3Dモデルは、顕微鏡データ（ 図2）から生成されます。 //www.wormatlasを：このモデルは、細胞の通過は、近位アームに先端を形成しながら、細胞の大きさの変化を分析することができ、また、HTTPを参照してください（花軸に花軸の組織や個々のセルのコンタクトの大きさを明らかにしています。 ORG /ふたなり/胚芽％20line / Germframeset.html）。

次に、プロトコル1,3、および5 は 、Cの長期タイムラプス顕微鏡検査を実行するために使用されitIs37 [パイ-1P :: mCherryを:: H2B ::パイ-1 3'U.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

開発中のオブジェクトの追跡を介して、特定の核の追跡では、Cの中央のパターン形成機構を解明することが可能でした胚1,23,24 エレガンス 。より高いスループットにこの戦略を展開するには、追加のパターニングルールを明らかにし、パターニング規則に新たに 10を推定する方法の方法を提案する最近ことが可能でした。多くの変異体は、しかし、正確なパターニング欠陥はまだ不明です。ここで説明する方法は、それらの解明に尽力することができるツールです。重要なのは、それはあるが、他の多くのモデルシステムは、Cのような不変の開発に従わないことを近年明らかになってきましたエレガンス 、オブジェクト追跡及び定量的追跡データの分析は、発生メカニズムおよび疾患の機序を特定するための重要なツールです。

ここに示す方法は、それがすぎるかになるような状況では特によく適していますそれぞれ、市販のソフトウェアツールを実装するために、より複雑な、および/または自己生成ソフトウェアソリューション.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CPの研究室での研究は、Deutsche Forschungsgemeinschaft(EXC 115;FOR 1756)およびLOEWE研究クラスターユビキチンネットワーク。CPは、欧州連合フレームワークプログラム7(マリー・キュリー・アクション・プロジェクト326632)によってさらにサポートされています。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
実体顕微鏡Motic/VWROT4005S解剖と取り付け用実体顕微鏡
 Polysciences18329胚の取り付け
20 & マイクロ;m
ポリビーズポリスチレンマイクロスフィア、 Polysciences876成獣
0.1 & マイクロ;m
顕微鏡スライドVWR631-0902成体動物の取り付け
カバーガラス 18x18 mmVWR631-1331胚/大人の取り付け
カバーガラス 24x60 mmVWR631-1339胚の取り付け
メスVWR233-5455胚解剖
シリコーンチューブVWR228-1501マウスピペット用チューブ
30mm PTFEメンブレンフィルターNeoLabJul-01マウスピペット用フィルター
キャピラリーチューブVWR621-0003マウスピペット用ピペットチップ
ワセリンロスE746.1胚/成人用マウント
寒天ロス5210.5成体動物用マウント
リン酸カリウム・ジ・ヒドロス・ロスP018.2M9バッファー
リン酸二ナトリウム-水素RothP030.2M9バッファー
塩化ナトリウムRoth3957.1M9バッファー
VisiScope、スピニングディスク、共焦点システム、ビジターシステム、N / a、共焦点顕微鏡
Polybead ポリスチレン マイクロスフィアのマウント

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
  2. Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C Elegans Developmental BiologyTime lapse MicroscopyOpen source Software3D Cell Shape ModelingFluorescent TrackingParticle Image VelocimetryCortical Contractile FlowCell Lineage TracingVesicle Flow TrackingQuantitative Image Analysis

Related Articles