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方法論記事

の発達過程を追跡し、定量化

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⸱

DOI：

10.3791/53469

⸱

2015年12月16日

 ,  ,  ,  , 
1Buchmann Institute for Molecular Life Sciences and Institute of Biochemistry II, School of Medicine, Goethe University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、C.エレガンスの発生過程を追跡し定量化する方法を示しています。提示されている方法は、簡単に実装できるオープンソースのツールに基づいています。3D細胞形状モデルの再構築方法、細胞内構造の手動追跡方法、皮質収縮流の解析方法などを実演します。

要約

定量的に発生過程を捉えることは、変異体の表現型を識別し、記述するためのメカニズムのモデルと鍵を導出することが重要です。ここではプロトコルは、胚および成体Cを調製するために提示されていますエレガンス短期および長期タイムラプス顕微鏡検査のために動物や発達過程の追跡と定量化のための方法。提示された方法は、すべてのCに基づいています線虫遺伝学センターから入手でき、簡単に独立して使用する顕微鏡システムのいずれかの実験室で実現することができるオープンソースソフトウェアの株エレガンス 。モデリングソフトウェアIMOD、汎用の画像解析プログラムEndrovを使用して蛍光標識された細胞内構造の手動追跡、及びPIVlab（時間分解デジタル粒子画像流速を使用して、皮質収縮フローの分析を用いて、3Dセル形状モデルの再構築MATLAB用ツール）が示されています。しかし、これらの方法はまた、Tを展開する方法を説明されていますO定量的に、細胞追跡と系譜トレース 、 例えば 、小胞の流れの追跡を異なるモデルの他の発生プロセスをキャプチャします。

概要

蛍光タンパク質、ゲノム工学、光学顕微鏡、およびコンピュータ・ソフト及びハードウェアの着実な改善と、それは前例のない、時空間分解能で多くのモデル生物の開発を記録することが可能になりました。これは、研究者は、以前に対処することができなかった質問をするか、見落とさ側面を探索するために知られている発達過程を再検討することができます。この進歩は、徹底した測定と統計解析によって定量的モデルに定性的な、非公式のモデルを変換することを目的と量的発生生物学の分野を巻き起こしました。

追跡細胞と細胞内構造は、胚発生、神経系の活性、または細胞分裂1-12の定量的モデルを導出することを可能にしました。 Cの初期の開発中に細胞分裂の残党を追跡することによりエレガンス胚 、我々は、彼らがステレオに従っていることを明らかに最近できましたパスを入力し、構成する重要な偏光は13,14因子 。

ここでは、プロトコルは、非専門家のためのアクセス可能な定量的な発生生物学のアプローチを行うことが提示されています。焦点は、標準的な共焦点顕微鏡およびコンピュータへのアクセスを持つ任意のラボで実施可能である3つのストレートフォワード、自由に利用できるツールです。これらは、3Dセル形状を生成するためのプロトコル、細胞分裂の残りを追跡するためのプロトコル、および定量皮質アクトミオシンのダイナミクスを説明するためのプロトコルを含みます。線虫C.エレガンスは、典型的なケースとして使用されている、しかし、ここで説明する方法とツールがなど他の生物学的モデルでの質問、 例えば、培養細胞、組織外植片、オルガノイドまたはスフェロイド、他の胚、各種のに適しています

一般的に、ここに示した分析のいくつかはまた、人気のあるオープンソースのツールはImageJ（http://imagej.nih.gov/ij/docs/indexを行うことができます。HTML;またはフィジー、別の定量分析のための多くのプラグインが利用可能なImageJの、http://fiji.sc/Fiji）のバージョンを「電池が含まれます」。しかし、ここで説明するプログラムは、特定の問題に取り組むために設計されています。

まず、IMOD、画像処理、モデリング、ディスプレイスイートは、電子又は光学顕微鏡15からの連続切片の3次元再構成のために使用することができます。 IMODはまた、任意の方向から3Dデータを表示するためのツールが含まれています。第二に、Endrov、ImageJのプラグイン互換性16と 、ネットワークまたは拡張プラグインアーキテクチャに基づいて（とりわけ）トラックの画像解析、データ処理、および注釈を実行するように設計されたJavaプログラム。これは、140以上の画像処理操作とモデルと生データを別々に表示されている拡張可能なユーザー・インターフェースが含まれています。そのソースコードはhttps://github.com/mahogny/Endrovで見つけることができます。第三に、PIVlab、Mユーザは、定量的および定性的粒子の流れ場17を分析することを可能にするデジタル粒子画像流速用ATLABツール。このプログラムの使用は、画像処理ツールボックス（http://mathworks.com）が含まれ、MATLABのライセンスが必要です。 PIVlabを定量的に流れを記述するために設計されたプログラムです。これは、画像対またはシリーズ内の速度分布、大きさ、渦度、発散、または剪断を算出します。このためには、画像対の画像（プロトコルセクションに「パス」と呼ばれる）の小領域は、最も可能性の高い粒子変位を導出するために相互相関します。この相互相関は、それぞれ、直接相互相関または高速フーリエ変換（FFT）を使用して空間または周波数領域で分析することができ、相関行列が得られます。

ここで使用される機器は、ニポー（ '回転'）ディスク、EMCCD、488および561 nmの標準固を備えた倒立顕微鏡でありますステートレーザ、および油性または水浸対物レンズアポクロマート20X空気または40倍または60倍プラン/。しかし、他の撮像モダリティでタイムラプス撮影を行うことも可能であり、 例えば、ポイント- 、ライン-またはデコンボリューションまたは構造と組み合わせたシート走査レーザベース顕微鏡、多光子顕微鏡法、ならびにエピ蛍光顕微鏡照明。ニポーディスクシステムを使用する利点は、ストリーミング・モード（連続移動及びz次元でのオブジェクトのスキャン）が利用可能である場合は特に、非常に高速な画像取得です。また、解像度を向上させるために、EMCCDの前に1.5倍拡大エクステンダーを使用することができます。

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プロトコル

C.の調製エレガンス胚は、タイムラプス顕微鏡用のマイクロビーズを使用して

  1. 歯のピック/ピペット先端に取り付けられた第1の勢いよく撹拌した後、アイラッシュを使用して、M9の隣のドロップにそれぞれワームを転送することによりM9バッファのドロップにワームピック（白金線）を使用して妊娠成虫を移し、細菌をきれいにまたは尖ったガラスキャピラリーを使用しています。
  2. M9緩衝液中に直径20μmのポリスチレンビーズの10倍を含有する分散液を希釈し（1 L M9バッファーが3gのKH 2 PO 4、6グラムHPO 4、5グラムのNaCl、及び、オートクレーブ後（20分、120℃2のNaが含まれC）、）、1MのMgSO 4溶液の追加の1ミリリットルを追加します。
  3. 薄いガラスキャピラリー（例えば、注射針を引っ張るために使用されるポイントの毛細血管または毛細血管を溶融）、およそ0.5メートル長いゴムの作品、シリコーンまたは類似の材料のチューブ（理想的に透明）、200μlの任意のタイプから口のピペットを作りますピペットチップ、200μlのPCRチューブの蓋、小さな注射器（ 例えば 、0.2から0.45ミクロンの細孔径と15〜50ミリメートル直径ナイロン、PTFEまたは類似の材料のフィルター）、1000μlのピペットチップのための疎水性フィルター。口のピペットのこのタイプには、生物学的材料は、実験者と接触して得ることができないことを保証します。
  4. チューブに最初のヒントと200μlのピペットチップを挿入することにより、ピペットを組み立て、使用毛細血管の直径に一致する中央穿孔を持つPCRチューブの蓋を差し込みます。非常に尖っ錐または調製針が穿孔を生成するために使用することができます。
  5. 細い毛細血管を描画し、穿孔に挿入します。チューブのもう一方の端にフィルタを挿入し、マウスピース（ 図1）として1000μlのピペットチップを挿入します。
  6. きれいなカミソリの刃またはメスで外陰部に横方向にワームを切断することによって妊娠成人を解剖。
    注：通常、多くの胚はEになります切断後xpulsed。初期胚が必要な場合は、それらは時々目のラッシュまたは尖った針を用いてカーカスから放出されなければなりません。
  7. 口のピペットを使用して、このドロップに24x60 mmのカバーガラスと移植胚の上に希釈したポリスチレンビーズの分散（〜4μL）のピペット一滴。
  8. ドロップの上にガラスをカバーして、ドロップが完全に広がっていることを確認して小さい（例えば、18×18または20×20 mm）を慎重に配置します。
    注：ドロップも小さなカバーガラスの縁に触れないように十分に小さくなければなりません。
  9. 液化ワセリンでマウントをシール。 24x60ミリメートルのカバースリップ側にイマージョンオイルの滴を追加し、「タイムラプス顕微鏡」セクションに進んでください。

アダルトC.の調製エレガンス動物ナノビーズを用いたタイムラプス顕微鏡用

注：一般的に、成体動物を装着するためのプロトコルは、参考文献からプロトコルを適応したものです。 18。このプロトコルでは、成体動物の長期経時的共焦点顕微鏡検査を行うことができます。

  1. 1.5％を準備M9緩衝液中のアガロース溶液（w / v）の、沸騰（1分、水浴または電子レンジで100℃）。これは腸および/または生殖腺の部分の押し出しにつながることができますので、アガロースのより高い濃度の使用が推奨されていません。
  2. 2顕微鏡スライド上に各テープの2-3層を下に貼り付けます。テープで2つのスライド間のテープなしでスライドを置きます。
  3. ピペットチップを使用して、中央のスライドの中央に熱いアガロース溶液の一滴を置きます。それはそれぞれの側にテープ層によってサポートされるように急速に低下に別のスライドを配置。これは、周りに直径10mmのラウンドとフラット寒天パッドを作成します。
  4. パッド上に（（V）/ wの2.6％である希釈せずに、）100 nmのビーズ溶液の液滴を入れてください。ワームピックとドロップに1-10清掃成虫を転送します。 Protので説明したように18×18ミリメートルのカバーガラスとワセリンとシールocol 1。

3.タイムラプス顕微鏡

  1. 顕微鏡スライドまたはカバーガラスサンドイッチ上にイマージョンオイルの滴を入れてください。サンプルを見つけるために低倍率（5倍または10倍レンズ）で明視野を使用してください。
    注：（特にC.胚エレガンスのための）可能な限り多くの青色光への露出を制限し、 例えば、試料を集中ではなく、明視野を使用する/見つけるためにエピ蛍光顕微鏡を使用しないでください。
  2. （収集ソフトウェアに応じて、中心面またはサンプルのトップ/ボトム面のいずれか）の焦点に試料をもたらす、より高い倍率（40倍または60倍目標）に変更します。
  3. 1ミクロン間隔で30面にサンプリング間隔を設定するには、すべての1分を記録しました。自動化されたXY-またはXYZステージが利用可能である場合には、複数のスポットは、1回のセッションで記録することができます。蛍光イメージングに切り替え、再びフォーカスをチェックしてください。
    注：むしろわずかに長い露光時間を使用し、高いレーザー出力を使用しないようにしてください非常に低い強度で。測定は、飽和を避けるために、画像取得プログラムまたはImageJのいずれかで、すぐに画像を取得し、ダイナミックレンジをトリミングし、また過度の放射線被ばくを意味しています。
  4. タイムラプスシリーズの記録を開始します。
    注：アーティファクトを分析除外サンプルスキャン間の長い（3-10分）の時間間隔で開始し、徐々に任意の間隔に時間的なサンプリングを増やします。統計的分析を実行するときにどちらの場合も発生のタイミングだけでなく、エンドポイントは類似していなければなりません。また、毒性および生存率を評価することがしばしば必要です。したがって、長期的タイムラプス顕微鏡検査の後、マウントからの試料を回収し、彼らはライブ/開発を続けているかどうかを確認。

4. IMODで3Dセルの形状モデルの再構築

注：http://bio3d.colorado.edu/imod/：IMODソフトウェアは、IMODのWebページから入手可能です。ソフトウェアのインストールは説明していますそこ日間。 WindowsのOSを使用する場合は、Unixのツールキットには、IMODのWebページ上のパッケージとして見つけることができる、インストールする必要があります。また、IMODのウェブページ（http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html）で利用可能な良好コンパイル3dmod導入があります。

  1. Unixシェルを開き、「IMOD」を入力します。 IMODウィンドウが開きます。 3Dモデルを生成するために、そこから生データ（理想的に積み重ねられたTIFまたは類似）を使用してファイルを選択します。
  2. 情報ウィンドウ（アップ＆ツールをスクロールダウン）を使用して、ZAPウィンドウ内のオブジェクトの底部と上部の位置を確認します。
  3. セルのアウトラインをトレースを開始します。重要なのは、各セルは一つのオブジェクトであることを確認してください。各セルの上部面で始まり、情報ウィンドウを使用して、そこに第1の輪郭を作成します。 Zを下にスクロールし、各z平面のための新しい輪郭を作成します。
  4. 3Dでモデル化するのに必要な数のセルに対して同じ操作を行います。新しいセルを開始するとき、新しいオブジェクトを作成することを忘れないでください。
    NOTE：輪郭追跡と、いくつかの便利なプラグインのための多くの異なる方法があります。詳細については、IMODのウェブページやオンラインチュートリアルをご覧ください。ここに示す例では、デフォルトの設定が使用されています。
  5. オブジェクトとその輪郭を検査する「モデルビュー」ウィンドウを開きます。
  6. 「オブジェクト」 - 「モデルビュー」ツールバーの「編集」を選択します。それぞれの編集ウィンドウが開きます。
  7. 「データ型を描く」と「描画スタイル」と「塗りつぶし」と「メッシュ」を選択し、充填され、閉じたオブジェクトなどの細胞をモデル化します。ウィンドウの左下のスクロール可能な選択で「メッシュ」をクリックします。右下の選択にオプション「キャップ」を確認してください。必要な数のオブジェクトを確認し、「すべてをメッシュ」をクリックします。プログラムは輪郭のスタックからの固体のオブジェクトを生成します。 Zサンプリング係数は、「表示」ウィンドウの「Zスケール」を変えることによって調整することができます。
  8. 移動/ 3D OBJECを回転させますトン（「編集」 - 「表示」）およびスナップショットや動画を保存（「ファイル」 - 「スナップティフとして...」または「ムービー/モンタージュ」）。

Endrov 5.トラッキング蛍光標識構造

注：細胞分裂の残党を追跡するために、セル識別（例えば、H2B、PH-PLC-D1）および細胞分裂残骸マーカーのために、核または原形質膜マーカーで株を用いる（例えば、Nmyの-2、ZEN-4 ）。核やプラズマ膜マーカーは、細胞分裂の残骸を継承するセルを決定することが重要です。

  1. 高速ロードと使用を容易にするために、生データは、（ImageJの中など）、TIFFファイルに変換する必要があります。次に、オープンEndrov、ファイルメニューから「読み込みファイル」オプションを選択することによって分析するファイルをロードします。ツールバーの「2Dビューア」アイコンをクリックします。
  2. 「フィット範囲」アイコン（右下隅にある青いアイコンをクリックして、ヒストグラムを調整しますEndrov画面の）。 "ファイル名" - - "Imageset" - "チャンネル" - "XYZ解像度の設定」「データ」に行くことによって、XYZ解像度を設定します。 XとYの解像度が0.2μmである場合、X、Y、Zの、 例えば、5,5、1の値を入力し、Zにすべての1ミクロンをサンプリング
  3. 核に注釈を付けるために、関心の面に移動し、「2Dビューア」をクリックしてください。ドロップダウンメニューから「リネージュ」を選択し、「新しい系譜 "を選択します。
  4. クリックして核にドラッグすることで、マークを付けることができます。核に名前を付けるには、右クリックし、ドロップダウンメニューから「粒子の名前を変更」を選択します。円の直径を増減するには、マークされた円の左側に表示される矢印のアイコンをドラッグします。核の中心面をマークするには、右のアイコンをクリックしてください。原形質膜のマーカーを使用する場合、大きな球体は、細胞の大部分をカバーすること描くことができます。
  5. 時間や平面に進むには、「フレーム」と「Z」を選択してください下部のツールバーにあるオプション。次の時点に行くの後、それに応じて核をマーク円の位置やサイズを調整します。追跡された細胞が分裂するまで、これを繰り返します。
  6. 細胞分裂があると、娘核をマークし、「リネージュビューア」に切り替えます。これは、上部のツールバーの「Windows」アイコンをクリックして選択することができます。同時に3つのすべての核マークは、トップツールバーの「リネージュ」オプションに移動し、「准親」を選択します。
  7. 細胞追跡が終了すると、トラッキングのために細胞分裂の残りマーキングチャネルに切り替えます。チャンネルを切り替えるには、ツールバーの左下隅にファイル名をクリックしてください。核のために上記のように細胞分裂の残り（または任意の他の構造体）を追跡することができます。
  8. 「リネージュ」 - - 「編集」および編集される系統番号をクリックして閉じた後、ソフトウェアに戻ったとき、それは「2Dビューア」に行くことが必要です。

6. PIVlabと皮質アクトミオシンフローの分析

注：PIVlabがより自由に利用可能なソフトウェアです。http://pivlab.blogspot.de/。それはPIVlab_GUIを入力して、MATLABコマンドライン環境内から呼び出すことができます。 PIVlabで作業する場合、それは別のフォルダに画像シリーズを保存することをお勧めします。

  1. 「ファイルメニュー」から新しいセッションを開始します。 「ロードイメージ」ボタンをクリックして画像ファイルをロードします。
  2. シーケンシングスタイル1-2、2-3、選択...と希望する画像のシーケンスが含まれているディレクトリに移動します。画像を選択し、「追加」ボタンおよびインポートをクリックしてください。
  3. 「解析の設定」に移動し、「除外（ROI、マスク）」を選択します。また、押して "Ctrlキー+ E」。画像/秒（胚外すなわち、面積）の不要部分を不活性化するために、「現在のフレームのマスク（複数可）を描画」ボタンを使用します。
  4. 「PIVの設定」を選択し、FR「分析設定」メニューをオム。また、押して "Ctrlキー+ S」。希望PIVアルゴリズムとして「FFTウィンドウ変形」を選択してください。
    注：高速フーリエ変換（FFT）が、計算コストを削減するだけで、信号がよく、ノイズの上、研究粒子の変位を分析半分パス領域を（6.5を参照）を超えていない場合であることをお勧めします。
  5. 16のステップと32ピクセルの尋問面積：32パス2のステップと64ピクセルの尋問エリア：1を渡します。その後の画像間の強度の相互相関のために尋問の面積である3つのパスに次の値を入力してください。ドロップダウンメニューウィンドウの変形から「線形」を選択します。サブピクセル変位推定のためのガウス2 * 3点法を選択してください。
  6. 選択して「分析！ " Analysisメニューから、ボタンを使用して分析を開始するには、「すべてのフレームを分析します」。
  7. 後処理のために ""ベクトルの検証」を選択;ポスト処理」メニューおよび7に標準偏差（STDEV）フィルタ閾値を設定し、すべてのフレームに適用されます。
  8. 「プロット」メニューから「データを変更/パラメータを導出」を選択します。ドロップダウンメニューから「ベクトル[PX /フレーム]」を選択します。ベクトルとハイパスフィルタの滑らかさを調整し、すべてのフレームに適用されます。
  9. 、すべてのフレームの平均ベクトルを計算する1に「使用済みフレーム」に設定するには、次の終了をし、「平均ベクトルを計算する」ボタンをクリックします。

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結果

プロトコール2、3、および4を使用して、野生型における生殖腺の、タイムラプスイメージングC.エレガンス大人が実行される（株OD58（UNC-119（ED3）III; ltIs38 [PAA1;パイ-1 :: GFP :: PH（PLC1delta1）+ UNC-119（+）]）、生殖細胞系のプロモーターからの膜マーカーを発現します）。生殖腺の順番に着目し、生殖細胞の3Dモデルは、顕微鏡データ（ 図2）から生成されます。 //www.wormatlasを：このモデルは、細胞の通過は、近位アームに先端を形成しながら、細胞の大きさの変化を分析することができ、また、HTTPを参照してください（花軸に花軸の組織や個々のセルのコンタクトの大きさを明らかにしています。 ORG /ふたなり/胚芽％20line / Germframeset.html）。

次に、プロトコル1,3、および5 は 、Cの長期タイムラプス顕微鏡検査を実行するために使用されitIs37 [パイ-1P :: mCherryを:: H2B ::パイ-1 3&#...

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ディスカッション

開発中のオブジェクトの追跡を介して、特定の核の追跡では、Cの中央のパターン形成機構を解明することが可能でした胚1,23,24 エレガンス 。より高いスループットにこの戦略を展開するには、追加のパターニングルールを明らかにし、パターニング規則に新たに 10を推定する方法の方法を提案する最近ことが可能でした。多くの変異体は、しかし、正確なパターニング欠陥はまだ不明です。ここで説明する方法は、それらの解明に尽力することができるツールです。重要なのは、それはあるが、他の多くのモデルシステムは、Cのような不変の開発に従わないことを近年明らかになってきましたエレガンス 、オブジェクト追跡及び定量的追跡データの分析は、発生メカニズムおよび疾患の機序を特定するための重要なツールです。

ここに示す方法は、それがすぎるかになるような状況では特によく適していますそれぞれ、市販のソフトウェアツールを実装するために、より複雑な、および/または自己生成ソフトウェアソリューション...

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開示事項

CPの研究室での研究は、Deutsche Forschungsgemeinschaft(EXC 115;FOR 1756)およびLOEWE研究クラスターユビキチンネットワーク。CPは、欧州連合フレームワークプログラム7(マリー・キュリー・アクション・プロジェクト326632)によってさらにサポートされています。

謝辞

著者は何も開示していません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
実体顕微鏡Motic/VWROT4005S解剖と取り付け用実体顕微鏡
 Polysciences18329胚の取り付け
20 & マイクロ;m
ポリビーズポリスチレンマイクロスフィア、 Polysciences876成獣
0.1 & マイクロ;m
顕微鏡スライドVWR631-0902成体動物の取り付け
カバーガラス 18x18 mmVWR631-1331胚/大人の取り付け
カバーガラス 24x60 mmVWR631-1339胚の取り付け
メスVWR233-5455胚解剖
シリコーンチューブVWR228-1501マウスピペット用チューブ
30mm PTFEメンブレンフィルターNeoLabJul-01マウスピペット用フィルター
キャピラリーチューブVWR621-0003マウスピペット用ピペットチップ
ワセリンロスE746.1胚/成人用マウント
寒天ロス5210.5成体動物用マウント
リン酸カリウム・ジ・ヒドロス・ロスP018.2M9バッファー
リン酸二ナトリウム-水素RothP030.2M9バッファー
塩化ナトリウムRoth3957.1M9バッファー
VisiScope、スピニングディスク、共焦点システム、ビジターシステム、N / a、共焦点顕微鏡
Polybead ポリスチレン マイクロスフィアのマウント

参考文献

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