カーテンフローカラム：効率の最適化と感度

サマリー

ここでは、カーテンフロー(CF)モードでのアクティブフローテクノロジー(AFT)カラムの操作と最適化のためのプロトコルを提示します。これにより、分離性能が向上します。

要約

Active Flow Technology (AFT) は、特別に作られたマルチポートエンドフィッティングを使用して HPLC カラムの分離性能を向上させるカラム技術の一種です。カーテンフロー(CF)カラムはAFTカラムスイートに属し、具体的にはCFカラムは、サンプルがベッドの放射状中央領域に注入され、溶質の注入を囲む移動相のカーテンフローがサンプルの放射状分散を防ぐように設計されています。このカラムは「無限径」のカラムとして機能します。この設計の目的は、カラムベッドの半径方向の不均一性を克服すると同時に、カラムベッドの半径方向の中央領域へのサンプル負荷を最大化し、検出感度を向上させることです。本明細書に記載されているプロトコルは、システムおよびCFカラムのセットアップ、および最適化された無限径の「仮想」カラムのチューニングプロセスの概要を示しています。

概要

近年、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）用カラム技術が大幅に進歩しています。ピーク容量がかなり大きくより小さい粒径、より効率的なコアシェル粒子の使用のおかげで増加しています。分離は一般的に、より効率的であるため、ピークが今よりシャープと^1-8したがって、背が高いので、フローへの影響は感度の増加となっています。

それにもかかわらず、ラジアルベッドの不均一性は、まだすべてのカラムの性能の制限因子であるが、これはクロマトグラファーは、長年のためにこれを知っているので、新しい話ではないです。カラムベッドは、半径方向^9-12、および列軸^10,12-15に沿って両方に不均質です。壁効果は、特に分離性能の^7,16-18の損失に重要な貢献です。 Shallikerとリッチー^7は最近^、カラム床の不均一性の側面を見直し、したがって、これはdiscusseである必要はありませんさらにここ日間。言えば十分もののカラムベッドの変動充填密度と壁の効果は溶質プラグの歪みにつながることを、バンドが部分的に充填されたスープに似ているプラグにカラムを通って溶出するようにしていることではなく、薄い平らな固体のディスクよりも^7ボウル通常、基本的な教育の教科書に示されています。実験は、床を通る溶質の移行がカラム内部にプラグプロファイルを可視化することができることを、このような実施された場合には、部分的に中空であり、バンドのテーリング部分は、主にサンプルプラグの壁成分です。最終結果は、それがディスクが固体と^12,14,17横ばいであった場合に必要とされるよりも、これらの「部分的に中空」プラグを分離するために、より多くのプレートがかかることです。壁効果とラジアル充填密度の変動に関連したバンドの広がりの問題を克服するために、アクティブ・フロー・テクノロジー（AFT）として知られているカラム技術の新しいフォームは^7,19を設計しました。この設計の目的としましたコラム¹⁹の径方向中央領域に溶出する移動相のことから、壁の領域に沿って、溶出溶媒の物理的分離を介して壁の影響を除去します。 AFT列の2つの主要なタイプがあります。パラレル・セグメント化フロー（PSF）の列とカーテンフロー（CF）の列^7。このプロトコルは、CFカラムの使用および最適化を目的としているので、PSFの列はさらに説明しません。

カーテンフロー（CF）

カーテンフロー（CF）カラム形式入口とカラム出口の両方でAFTエンド金具を利用しています。 AFTエンドフィッティングはマルチ金具の内側に位置する環状フリットで構成されています。継手端部の中央のポートと位置合わせされる多孔半径方向中央部、端部取付具の周辺ポート（複数可）と整列している多孔質の外側部分、及び不透過性リング：フリットは、3つの部分から構成され任意のクロスを防ぐ2の多孔質部分を分離フリット¹⁹の径方向の中央と外側の領域の間-flow。 図1は、AFTフリットの設計を示 ​​し、 図2は、CFカラムフォーマットを示しています。追加の移動相は、半径方向中心領域を通って溶質の移行「カーテン」の入口の周辺ポートを介して導入されている間、この動作モード（CF）において、試料は、入口継手の半径方向の中央のポートに注入されますカラム。したがって、サンプルは、それを通過した移動相を持つカラムの外側領域とコラムの径方向中央領域におけるベッドに入ります。内径4.6mm（ID）の入口端部フィッティングのために列が最適^6,7,16である：（ペリフェラルポート中央）の研究は、約40:60の体積流量比が示されています。 CF列のAFT出口は、それらの相対的な部分に中枢および末梢流れの調整を可能にし、ほとんど任意の所望RATIに変えることができます圧力管理を通じてO。 CF列の最適化が著しく、このような分離効率や検出感度などのカラム技術の様々な機能面を、向上させることができます。このように「壁のない'、'無限直径」または「仮想」列には^{、6,10,18,20を}確立します。 CF列の目的は、積極的に壁領域に到達するサンプルを防止するために、カラムを通って試料の移動を管理することです。したがって、検出器の終了時に溶質濃度は、紫外線（UV）検出^16、および質量スペクトル検出^6を使用する場合^に一層を使用する場合、従来のカラム形式よりも約2.5倍の感度を増加させる、最大化されます。

検出感度が増加するので、CFカラムは理想的には、低濃度のサンプルに適しています。このような質量分析計^（MS）6のような速度制限された検出器を、流れるように接続されたときにまた、彼らは理想的です。 A同じ線速度で運転したときに、例えば4.6ミリメートルID形式でFTカラムは、21％の中央流を出る調整することにより、標準内径2.1 mmの形式の列として検出器に溶媒の同じ量を送達するように調整することができます。同様に、AFT列には、43％の中央流を出る調整することにより、3.0ミリメートルのidカラムとして検出器に同じボリュームの負荷を提供するように調整することができました。実際には任意の「仮想」列形式は、分析要件^6,18,22に合わせて製造することができました。入口と出口でこれらの特別に設計されたエンドフィッティングを使用すると、真の壁のない列が確立されることを保証します。

入口の中枢および末梢ポートへの溶媒配送システム設定には2通りの方法があります。スプリットフローシステム⁶と2ポンプシステムの^{6,7 3}は 、これらのCFシステムのセットアップのそれぞれを示しています。

スプリットフローシステム

私NA分流装置（ 図3A）、インジェクタに導くポンプ流量は、移動相のフローストリームは、その後に接続されている注射器に接続され、ゼロデッドボリュームTピースを使用して分割前のインジェクタでありますカラムの入口端部フィッティングの中央ポート。移動相の第二の流れストリームインジェクタによっては、通過し、カラムの入口の周辺ポートに接続されています。中央および周辺にポンピングするインジェクタから、行が列に接続される前、 すなわち ：流れの分裂の間、フローストリームの割合は、40：60（周辺中心）に調整されます。

二つのポンプシステム

CFの列は、列の入口エンドフィッティングに2つの流れの流れを必要とします。 HPLC装置のオートサンプラー/インジェクタの種類に応じて、設定スプリットフローを実現できない可能性があり、そのためCFを2ポンプ（ 図3B ^21）を介して達成することができます。各ポンプが割り当てられ、中枢または末梢ポート流量が中央ポートの流れの40％と周辺ポートの60％を表すように設定されているいずれかに接続されています。総流量1.0 mlの分^-1である場合、例えば、中央のポンプ流量0.4 mlの分に設定されて^-1と周辺ポンプ0.6 mlの分^-1に設定されています。

動作モードの選択は、HPLCの計装および動作のクロマトグラフモードに大きく依存しています。例えば、いくつかのオートサンプラにサンプル負荷位置と試料との間の圧力の変化は、位置が設定デュアルポンプを分流比を中断するので、この場合に発生する可能性があります注入最適なCFのパフォーマンスのために推奨されることになります。かかわらず、CFのカラムの入口のために選択された設定溶剤送達システムの、CF出口最適化は同じまま。 CFのカラムの出口中央のポートはSmaIで紫外可視（UV-Vis）で検出器に取り付けられています。ポストカラムデッドボリュームの影響を最小限にするためにチューブの容積可能LEST。 、CF列が狭いボアカラムをエミュレートするので、カラム出口と検出器との間のデッドボリュームはCFカラムの分離性能に有害です。このようなバンドの広がり、効率及び感度の損失として、デッドボリュームの影響を最小限にするために、中央ポートとの間の配管の容積の最小量と紫外可視検出器を確実にするために重要です。そのため、小口径チューブ（0.1ミリメートルのID）の使用が容易に不適切なデッドボリュームを追加することなく、圧力調整を可能にすることをお勧めします。チューブは、周辺ポートに接続し、廃棄するように指示されます。 CFカラムの出口の際、分割比は、アナリストの目的に合った任意の比率に調整することができます。内径4.6mmのCFを使用した場合、例えば、43:57または21:79（中央周辺）のいずれかとの比率を設定することがしばしば便利である「仮想」予約3.0つミリメートルIDカラム2.1ミリメートルid列をエミュレートします、謹んで。その方法は、分離性能を容易にベンチマーキングされています。分割比は、中央のポートに接続された期間の時間をかけて周辺ポートを出るフローである検出器から出る流量を計量することによって測定されます。各ポートを介して百分率流量が決定することができ、比は、添付のチューブの長さを変更すること、または異なる内径（ID）を有する管を使用して調整することができます。

このビデオプロトコルは、強化されたクロマトグラフィー性能のためのCF列の操作および最適化手順を詳しく説明します。

プロトコル

注意：（ すなわち、メタノールのためのMSDS）は、使用する前に、すべての材料および試薬のための材料安全データシート（MSDS）をご参照ください。溶剤および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を溶離液を取り扱うときは、すべての適切な安全対策を使用することを確認してください。 HPLC、分析天びんと検出器計測器の技術的管理の適切な使用を確保し、個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、およびクローズドつま先の靴）を使用することを保証します。

注：このプロトコルは、UV-Visの検出器に結合されたHPLCシステム上のCF列を使用する方法に関する説明が含まれています。プロトコルは、読者がクロマトグラフィーでの基本的な知識と経験を持っていると仮定すると書かれています。

HPLC機器の1.セットアップ

注：溶媒の選択、検出器波長、このセクションでは、 すなわち 、アナリストのニーズに、合わせて変更することができ、流量います興味のあるサンプルに適しています。

1. ラインA、100％の超純水でHPLC機器（ 例えば 、ミリQ水）を準備し、ラインBの100％メタノールを移動相として、製造業者の要件ごとにポンプをパージします。
2. 254 nmのUV-Visの検出器を設定します。
3. セットアップのプレ噴射流量スプリットモード、またはデュアルポンプ流量セットアップのいずれかを選択します。スプリットフローモードの場合は、手順3に進み、デュアルポンプ・モードでは、ステップ2に進みます。

2.スプリットフローシステムのセットアップ

1. オートサンプラのインジェクタバルブからポンプラインを外します。
2. ポンプラインにTピースを取り付けます。
3. Tピースの各ポートに0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの部分を取り付けます。
4. オートサンプラのバルブをインジェクタにTピースから一本のチューブを接続します。
5. 1.0ミリリットル分にポンプを設定^-1。
6. CFカラムの入口にポンプラインを接続する前に、チューニング40％への流れのセグメンテーション比：6 0％（中央線：外周線）としては、ステップ2.7に従っています。
7. スプリットフローシステムのCF導入比率のチューニング
   1. （中央ポー​​トおよびペリフェラル・ポートへのTピースからラインの一つにオートサンプラーからの行の1）化学天秤とラベル1捕集容器中央と周辺の他のいずれかを使用して、2つの空の回収容器の質量を測定します。
   2. 1.0分間、その質量2.7.1で測定した回収容器の中に（列に接続される点で）インジェクタから来るラインから出た移動相を収集します。
   3. 分析スケールでの回収容器を再計量し、収集した移動相の質量を決定します。
   4. 繰り返しは、ペリフェラルポートに接続されるTピースからラインを出た溶出液のために2.7.3に2.7.2を繰り返します。
   5. 流れの割合を決定（ミリリットル分^-1）以下の式に従ってフローの各ラインから：
      1 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg "/>
   6. 60％（±2％）（インジェクタから中央のポートへのライン： ペリフェラルポートへのTピースからライン）40％に流量比を調整します。 中央ポート流率にインジェクタからのラインが40％以上である場合には、チューブの内径を減少させる、またはその長さを増加させることによって圧力降下を増大させます。インジェクタから中央ポート流率のラインが40％未満である場合には、管の内径を大きくするか、チューブの長さを減少させます。
   7. 流量比が調整されていたら、ポンプ流量をオフにします。
   8. カラム入口とカラム入口のペリフェラルポートにTピースからラインの中央ポートにインジェクタからのラインを接続します。
   9. ゆっくりと1.0ミリリットル分の流量をランプ^-1 100％ラインBで
   10. 可能にすることにより、カラム（内径4.6mm×100mmの長さ）を平衡化します100％メタノール（ラインB）分1.0 ml ^-1の10分間でカラムを流れる移動相。この時間は、ユーザが使用することができる他の列の寸法に応じてスケーリングされます。
   11. CFコンセントのチューニングについて4.「CF出口流のチューニング」をステップに進みます。

3.デュアルポンプシステムのセットアップ

1. インジェクタにHPLCシステムのポンプを接続し、列の中央の入口ポートにインジェクタから回線を接続。
2. カラムの入口周辺ポートに直接追加のポンプを接続します。インジェクタを通過することにより、この第二ポンプことに注意してください。
3. 0.4ミリリットル分^-1 100％のメタノール（B線）で（1.0ミリリットル分^-1の全流量の40％の代表）に中央のポートに接続されたシステムのポンプの流量をランプアップします。
4. ステップ3.3と同時に、総流量の60％0.6mlの分^-1（代表的には、周辺のポンプの流量をランプ分1.0 ml ^-1の）100％メタノール（ラインB）において。
5. 100％メタノール（ラインB）移動相分1.0 ml ^-1の10分間でカラムを通って流れるようにすることによって、カラム（内径4.6mm×100mmの長さ）を平衡化。この時間は、ユーザが使用することができる他の列の寸法に応じてスケーリングされます。
6. CFコンセントのチューニングについて4.「CF出口流のチューニング」をステップに進みます。

CFアウトレットフローの4チューニング

1. 0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの片を用いて、UV-Visの検出器に中央出口ポートを接続します。
2. CF列の周辺出口ポートに0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの部分を接続します。
3. 化学天秤で2つの空の回収容器の質量を計量し、一つの容器の中央や他の周辺にラベルを付けます。
4. 1.0分間、質量4.2で測定された中央収集容器のラベル、中にUV-Visの検出器（中央流）から出る移動相を収集します。
5. 分析スケールでの収集溶離液を含む収集容器を再計量し、収集した移動相の質量を決定します。
6. 繰り返しは、周辺出口ポートからのラインを出た溶離液のために4.4〜4.5を繰り返します。
7. 以下の式に従ってフローの各ラインからの流れの割合を決定します。
   
8. UV-可視から中央流率が21％以上である場合には、圧力損失を増加させる。：79％（±2％）（行から周辺流出紫外可視から中央出口流：）21％に流量比を調整します紫外可視検出器の出口に取り付けられたチューブの内径を減少させることによって、またはその長さを増大させます。 UV-可視から中央流率が21％未満であると、紫外可視検出器の出口に取り付けられたチューブの内径を増加させる、または管の長さを減少させます。チューブの長さが変更された都度、繰り返し4.7から4.3を繰り返します。
   注：「仮想」内径2.1 mmのモードでCF列は、分析のために準備ができています。

結果

AFTカラムは、カラムベッドの不均一性を克服し、分離性能を向上させるためにマルチカラムエンドフィッティングの専門フリット設計（ 図1）を用いて開発されました。 CFクロマトグラフィーカラム（ 図2）の分離性能上の研究室間の研究は、このプロトコル²³のセクション3で説明したように（ 図3B）設定デュアルポンプシステムを用いて行きました。 3コンポーネント試験混合物は、CF列の中央出口流の21％が検出器に向けた「仮想」2.1ミリメートルIDを介して、下に分析しました。三成分試験混合物の分離は、標準的な列にCF列の相対効率および感度の点で改良された性能を示します。 3コンポーネント試験混合物をフェネトール、ブチルベンゼンおよびペンチルを含有しており、従来の4.6と2.1ミリメートルのidカラムと4.6上で分析しました 22:78（中央：周辺）のセグメンテーション比でミリメートルのid CF列には、内径2.1 mm（ 図4）を

ディスカッション

この研究では、効率性と感度の点で分析性能をテストするためにCFクロマトグラフィーカラムの間の実験室分析を含みました。 3」のセクションで説明したように、CF列は、デュアルポンプシステムで設定されました。 CFのカラムの入口に：デュアルポンプシステムは40:60（周辺中央）の流量比を達成するために」を設置しました。 40:60（中央周辺）流量比は、それぞれ、40％及び総流量の60％を表す値に各ポンプの流量を設定することによって達成されました。 CFカラム出口は4 'のセクションに記載された手順に従うことにより、2.1ミリメートルのIDを持つ「仮想」欄に同調しました。 CF出口流のチューニング」。フェネトール、ブチルベンゼンおよびペンチルを含むサンプル混合物を4.6 mmのIDのCFカラム（22:78）と、従来の4.6および2.1ミリメートルID列間分離性能の比較のための試験用標準として使用した。 図4は chromatograpのオーバーレイであります3つの列の各々を用いて行った試験混合物のHIC分離。この図において観察された主な違いは、CFカラムを使用して得られた分離のための信号応答の有意な増加...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HPLC装置
2ポンプCFシステムセットアップを使用する場合は	、追加のポンプ
カーテンフロー HPLCカラム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	定義	まもなく商品化される
メタノール	任意のブランド		HPLCグレード
PEEKチューブ	任意のブランド		さまざまな長さとi.d.
PEEKチューブカッター	任意のブランド
分析スケールバランス	任意のブランド
ストップウォッチ	任意のブランド
溶離液収集容器	任意のブランド		1-2mlサンプルバイアルを溶離液収集容器として使用可能
Tピース	任意のブランド