幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

サマリー

Xenopusの胚では、胚盤胞の屋根からの細胞は多能性であり、さまざまな組織を生成するようにプログラムすることができます。ここでは、両生類の胚盤胞の屋根外植片をアッセイシステムとして使用するプロトコルについて説明し、初期の神経発達の主要なin vivoおよびin vitroの特徴を調査します。

要約

神経発生の根底にある遺伝的プログラムを理解することは、発生および幹細胞生物学の重要な目標です。両生類の胞胚では、胚盤胞の屋根からの細胞は多能性です。これらの細胞は単離することができ、遺伝子発現の操作やモルフォゲンによる誘導を通じてさまざまな組織を生成するようにプログラムできます。この原稿では、初期の神経発達の主要なin vivoおよびin vitroの特徴を調査するためのアッセイシステムとして、Xenopus laevis blastocoel roof外植片の使用に関するプロトコルについて説明します。これらのプロトコルにより、運命獲得、細胞移動挙動、細胞の自律的および非自律的な特性を調査することができます。胚盤胞の屋根の外植片は、無血清の定義された培地で培養し、宿主胚に移植することができます。この胚への移植により、移植された細胞の長期的な系統コミットメント、誘導特性、およびin vivoでの挙動を調べることができます。これらのアッセイは、神経発生の根底にある分子メカニズム、細胞プロセス、および遺伝子制御ネットワークを調査するために利用できます。再生医療の文脈では、これらのアッセイは、薬物スクリーニングに使用できる神経由来の細胞タイプをin vitroで生成する手段を提供します。

概要

脊椎動物の神経系は神経上皮細胞の均質層として神経板から出てきます。発生プログラムは、神経板の地域化の際に、誘導された符号化され、確立されている方法を理解することは、現時点では、発生生物学の主要な目標です。他のシステムと比較して、実験的に影響を受けやすいアフリカツメガエル胚は神経発達^1,2の初期段階を分析するための選択のモデルです。これは、胚を大量に得ることが容易であり、外部の開発は神経胚形成³の非常に最初のステップへのアクセスを提供します。多くのツールは、実験的にアフリカツメガエル （ アフリカツメガエル）胚発生を操作するために利用可能です。一緒に生化学的および薬理学的ツールで誘導MOを含めたmRNAまたはモルフォリノ（MO）のマイクロインジェクション、関数（GOF）および機能喪失（LOF）および経路^{4,5シグナリング}の特定の改変の制御ゲインができます。 BLA胞胚の動物極の周りに配置stocoel屋根外胚葉、または非常に初期原腸胚、および「アニマルキャップ」（AC）とも呼ばれる前に遺伝子発現を操作することによってプログラムすることができる多能性細胞の供給源であります準備を外植片。この原稿ではXを使用するための詳細なプロトコルは、 ツメガエル交流植片は、in vitroおよびin vivo分子機構および細胞プロセス基盤となる神経の発達にテストします。

技術は、 アフリカツメガエルのオタマジャクシの神経管における遺伝子発現パターンの微細な観察 ​​を可能にする、運命の決意キューの同定における予備段階を提示しています。フラットマウント組織の観察は、一般にニワトリ胚⁶の研究で使用されるが、それは適切にアフリカツメガエルに記載されていません。 2または4細胞期胚の割球に合成mRNAまたはMOを注入することにより、遺伝子発現の操作は、ACのプログラミングを可能にします外植^4。抗BMP要因ノギンの発現による骨形成タンパク質（BMP）経路の例を阻害するために、AC細胞³に神経アイデンティティを与えます。プロトコルは、陰イオン交換樹脂ビーズとの直接接触を介して、外因性の合図にAC外植片の局所及び露光時間制御を行うために詳述されています。最後に、技術は、解離および再会合プログラムの異なる細胞から調製した混合植片の移植により、インビボで神経前駆細胞の発達の機能をテストするために記載されています。

カエルの胚は、初期の脊椎動物の神経発達を研究するための強力なモデルです。 体外培養で外植片に遺伝子発現の操作を組み合わせることにより、神経上皮の地域化、増殖、および形態形成^7-12の研究に重要な情報を提供しています。交流外植片のプログラミングは 、ex vivo ^13,14の機能の心臓の開発を可能にしました。使用^15を移植植片の神経堤分化プログラム^{16を誘導する}最小の転写スイッチの同定につながりました。 透明帯境界のintrathalamica（ZLI）は尾側前脳の成長と地域化を制御するために、ソニックヘッジホッグ（Shhのを）分泌シグナルセンターです。連続のShhにさらされると、3転写因子の遺伝子を共発現神経上皮細胞- BARH様ホメオボックス2（barhl2）、orthodenticle-2（OTX2）とイロコイ-3（irx3 は） - ZLI室の二つの特徴を取得する：能力へSHH発現し、前方神経板の細胞から分離する能力。モデル系として、神経上皮細胞へのZLIの運命の誘導は^8に提示されます。

これらのプロトコルは、基本的なMECを探索するために発達生物学者や他の研究者のための単純な、安く、効率的なツールを提供することを目指してキー神経細胞の挙動のhanisms。これらのプロトコルは、非常に汎用性であり、外因性および内因性神経決意合図の大規模な範囲の調査を可能にします。これは、神経系統のコミットメント、誘導性相互作用および細胞行動の生体分析に長期を可能にします。

プロトコル

実験は科学的な目的のために使用される動物の保護に関する国内および欧州の規制で、交換、削減、洗練された国際的に確立原則に準拠しています。

in situハイブリダイゼーション全体のマウント後にアフリカツメガエルの1フラット実装はオタマジャクシ前方神経管をアフリカツメガエル

1. Xを取得標準的な手順^4、彼らは26歳以上（Nieuwkoopとフェイバー発達表¹⁷に従って神経胚の段階に到達するまで、それらを年齢に応じ胚をアフリカツメガエル 。
2. Xを修正4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液でそれらをインキュベートすることによって、オタマジャクシをアフリカツメガエル 。後の段階で胚を室温で38胚、2時間をステージングするステージ26のために、2ミリリットルのガラスバイアル中で、室温で1〜1.5時間の胚をロックし、回転させます。
   注意：PFAが接触し、疑いのある発癌物質によって有毒です。これは、ボンネットの下に操作する必要があります。
   注：One X.ラエビスのひながあります通常、2 mlのガラスバイアル中に固定ではなく、より大きなガラスバイアルを使用することができます。
3. 二回、0.1％のTween（PBT）で1×PBSを用いて、同じバイアル中の胚、室温で3分間洗浄します。
   注：それ以外の場合は使用PBSを指定しない限りで、カルシウムとマグネシウムを含まないです。
4. 同じバイアル中で、室温で少なくとも12時間、100％メタノール（MeOH中）中で胚を脱水します。プラスチックマイクロピペットを用いて、ボンネットの下に少なくとも2回のMeOH 100％に変更します。
   注：MeOHをそれに溶解した脂質としてわずかに黄色に変わります。 MeOHを吸入による毒性があり、フードの下に操作する必要があります注意。
5. 室温で、PBS中で2回メタノール75％、メタノール50％PBS中で、メタノール、PBS、PBS中25％の各バス5-10分：メタノール浴の段階的な一連の同じバイアルを使用して胚を再水和。メタノールソリューションは、プラスチック製のマイクロピペットを用いて、ボンネットの下に変更されます。
6. プラスチックピペットを用いて、PBTでトップに満たされた60ミリメートルペトリ皿に解剖する胚を移します。 2細かい鉗子のケアを使用して完全眼茎のレベルで、目や神経管の間に1つの微細鉗子を挿入して、目を削除します。神経管から目を外します。慎重に神経管を覆う外胚葉以下鉗子をご紹介します。注意して、頭の後ろから始まる外胚葉を剥がして、それを捨てます。
7. 以前に^{18,19に記載されているように}ジゴキシゲニン標識またはフルオレセイン標識プローブを用いた二重または単一のISHを実行します。
8. ISHは、PBTプラスチックピペットを用いた頂部に充填し、新しい60 mmのペトリ皿に胚を転送した後。
9. 細かい鉗子を使用すると、慎重に胚の残りの部分から神経管を取り外します。この段階では、前神経管は、後方神経管から分離します。神経管の上に位置する外胚葉の残りの部分、ゆるく神経管の下に装着されている脊索、耳小胞および中胚葉の残りの部分を慎重に取り外します。神経管は、任意の付録を欠いていることを確認してくださいこの段階で。
   注：必要に応じて、その端部に先端カットしてプラスチック製のトランスファーピペットまたはマイクロピペットを持つすべての神経管/胚移植を行う神経管の損傷を防ぐため。先端の直径は、神経管の大きさに調整されます。
10. PBSで希釈し、50％グリセロールを充填した1.5​​mlチューブに（ノートステップ1.9を参照）を切開し、神経管を転送します。神経管を4℃のグリセリン溶液、通常のO / Nの底に落ちているまで待ってください。
11. マイクロピペットP1000を使用して、50％のグリセロール/ PBSの溶液を除去し、同じ1.5ミリリットルチューブにマイクロピペットP1000を使用して、90％のグリセロール/ PBS溶液を加えます。神経管を4℃で90％グリセロール/ PBS溶液、通常のO / Nの底に落下するまで待ちます。
    注：長期保存のため、細菌の発生を防止するために、90％グリセロール/ PBSプラス抗生物質を使用しています。
12. ガラス板、プラスチック転送ピペットで顕微鏡スライド上に神経管を転送します。
13. ディスタングステン針を使用して、背側と腹側の中心線に沿った神経管を宗派。そのステップの間、神経管は、90％のグリセロール/ PBS中に保存されています。
14. 神経管の両側には、カバーガラスで覆われた補強リングを用いて、90％のグリセロール/ PBSにマウントします。
15. ワニスとカバーガラスを固定し、4℃で維持。

陰イオン交換樹脂ビーズを使用した2動物キャップ外植誘導

1. マイクロピペットP1000を使用して2ミリリットルチューブに陰イオン交換樹脂ビーズの100μlのを転送します。滅菌蒸留水でビーズを少なくとも5回連続して洗浄します。ビーズがチューブの底に沈殿し、マイクロピペットP1000を使用して滅菌蒸留水を交換できるようにします。ビーズに触れないでください。
2. ビーズを4℃でウシ血清アルブミン（BSA）（10 mg / mlで）を用いて滅菌蒸留水で満たされた2 mlチューブ中にO / Nを浸してみましょう。
3. 新しい1.5ミリリットルにビーズのACS、場所の半分を収集する前に2時間マイクロピペットP1000を使用してチューブ。その誘導性の可能性をテストする分子を含む培地500μlの滅菌蒸留水を交換するか、特定の運命を誘導することが知られています。彼らは陰性対照として使用されるように、ビーズの残りの半分にしてください。
4. 少なくとも2時間、4℃でビーズをインキュベートします。
5. 実体顕微鏡下で後続のすべてのステップを実行し、マイクロピペットですべてのAC転送を行います。
6. プラスチック製トランスファーピペットを用いて、0.2％のBSAで補足カルシウムとマグネシウムを含むPBSに胞胚または非常に初期の原腸胚を転送します。
   注：胚は、20〜24時間で12℃の範囲の胞胚と原腸段階で開発。
7. 以前に^20を説明するように鉗子を使用して、胚の卵黄膜を除去します。 1鉗子で胚を修正しました。他の鉗子の側面と卵黄膜をピンチ。膜を持ち、ゆっくりと胚を、それを剥がします。ヴェンでこの手順を実行し胚のクトル（植物性）側。胚の動物側に損傷を与えないでください。
8. 以前に^21を説明したように、小さなACSを分離します。動物極は、胚の着色された部分です。細かい鉗子を使用すると、動物極のうち、組織の小さな正方形をカット。交流組織のみが外胚葉細胞を含みます。組織は均一な厚さであることを確認してください。ない場合は、分析から交流を削除します。
9. バースの生理食塩水^（MBS）4変更された0.5倍でテラサキマルチウェルプレートの各交流を置きます。ウェルの丸底に接触して、ダウンして、その着色された動物側とよくにACを置きます。
   注：0.1％のBSA溶液でコーティングピペットは、プラスチックへの接着、組織の小片の付着を防止します。
10. マイクロピペットP20を使用して、各キャップに1ビーズを置きます。必要に応じて、慎重にキャップの中心にビーズを配置するために鉗子を使用しています。
    注：馴化培地中に浸漬すると、ビーズはピンクに着色されています。ほとんどの共同を選択loredビーズ。
11. 寺崎マルチウェルプレートを移動せずに6時間、室温（18〜22℃）でインキュベートします。ビーズ未満2時間のACにこだわっ。
12. 水に浸した紙の上に寺崎マルチウェルプレートを置きます。プラスチック容器でプレートをカバー。
    注：この「湿度室は「井戸の早期蒸発を防ぐことができます。
13. 同胞胚があなたの因子の影響を試験するための正しい段階に達するまで培養0.5倍MBSまたは3/4 NAMでACSは、15〜20℃で湿度チャンバ内（ステップ4.1を参照します）。
14. 新たに調製し、4％PFA中1時間ACSを修正しました。以前に（ステップ1.4）に記載されているように、100％MeOHにACSを脱水。

3.アニマルキャップアフリカツメガエル神経胚にグラフトする前に細胞解離と再凝集

1. コー​​トペトリ皿（60ミリメートル）または12ウェルプレートを3％アガロース滅菌水中またはPBS中のカルシウムとマグネシウムを含みません。 Bをカバーするのに十分なアガロースを追加ペトリ皿またはウェルのottom。 RT（18〜22℃）でプレートを事前に温めます。必要に応じて、脱水を防ぐために、4℃で数日間のためのプレートを保管していました。
2. カルシウムフリーHoltfreterの生理食塩水（60mMの塩化ナトリウム、0.7のKCl、4.6 mMのHEPES、0.1％BSA（-7888シグマのpH 7.6））とHoltfreterの生理食塩水（60mMの塩化ナトリウム、0.7のKCl、0.9 mMの_CaCl 2を、4.6 mMのを準備しますHEPES、0.1％BSA液pH ^7.6）5。注： _塩化カルシウムの溶液をオートクレーブ処理することはできません。
3. アガロースでコーティングされたカルシウムを含まないHoltfreterの生理食塩水でトップによくを埋めます。
4. 前述したように、そのACSを分離するために胞胚または非常に初期原腸胚の胚を準備する（2.7から2.5ステップ）。
5. 少なくとも15または30までを分離し、小さなACの^21。細かい鉗子を使用すると、動物極のうち、組織の小さな正方形をカット。 AC組織は、外胚葉細胞を含むので、均一な厚さです。ない場合は、分析から交流を削除します。
   注：動物極はエンブリーですOの着色された部分。
6. アガロースでコーティングされただけでなくカルシウムを含まないHoltfreterの生理食塩水でトップに埋めにACSを転送します。彼らの着色された側を上に向けた状態でACSを配置します。
   注：解離過程は、カルシウムを含まないHoltfreterの生理食塩水に急速に開始されます。
7. 細胞が解離開始するまで数分間待ちます。組織の分解を介してこれを確認します。細かい鉗子を使用して、交流の残りの部分から着色層を分離し、マイクロピペットP20でそれらを捨てます。完全な細胞解離過程は、互いに細胞の分離を示しています。
   注：1つまたは2つの着色された層は、移植の際に可視化を支援するために再集計し、外植片内で残すことができます。
8. プレートの円運動を用いて細胞を中央に配置します。マイクロピペットを使用して、慎重に、できるだけ多くのメディアを取り出しP1000。細胞を触れないように注意してください。
9. ウェルにカルシウムとHoltfreterの生理食塩水の1ミリリットルを追加します。解離ACSを転送1.5mlチューブに。
   注：2ミリリットルチューブは、その丸底に使用することはできません。
10. ベンチ遠心機（500 XG）2,000 rpmでの最高速度で遠心分離し、5分によって細胞をペレット化。マイクロピペットP1000で慎重に上清を取り除きます。
11. 解離した細胞にカルシウムとHoltfreterの生理食塩水（60mMの塩化ナトリウム、0.7のKCl、0.9 mMの_CaCl 2を、4.6 mMのHEPESの20μl加え、0.1％のBSA（A-7888シグマのpH ^7.6）5。
12. RT（18〜22℃）で6時間に解離ACS、3をしてください。
    注：これは再集合体への細胞のために必要な時間です​​。細胞がチューブの底に小さなボールを形成するように再凝集が表示されます。
13. 0.5倍のMBSまたは3/4 NAMの1ミリリットルの1ミリリットルを追加することにより、チューブの底から慎重に外植片を切り離し（ステップ4.1を参照）。プラスチック製トランスファーピペットを用いて、未コートプレートに外植片を移します。
14. それらの制御兄弟を使用して外植片を上演。長期培養用抗生物質の場合：kanamyCIN（50μg/ mlの）、アンピシリン（50μg/ ml）およびゲンタマイシン（50μg/ mlの）。

動物の4グラフトは、Xの神経板で外植片キャップツメガエル胚

1. 3/4 NAM準備（110ミリモルのNaCl、2 mMの塩化カリウム、1mMのカルシウムを（NO _3）2、1mMの_MgSO 4を、0.1mMのEDTA、1mMの_NaHCO 3を、0.2X PBS、50μg/ mlのゲンタマイシン）。 4℃での解剖や店舗のために1週間以上保管しないでください。古いNAM（下記）アガロースでコーティングされた解剖皿を調製するために使用することができます。
2. 小さな穴はシリコーン型、またはテーブルテニスラケットのカバーのいずれかを使用して行われているに3/4 NAMの3％アガロースでコーティングペトリ皿（60ミリメートル）。
   注：アガロースをペトリ皿の底をカバーしています。シャーレは3/4 NAMでいっぱいになるようにいくつかのスペースを入れてください。あるいは、不乾性粘土で解剖料理を作ります。粘土の中で、解剖の手順の間に若干の胚を絞ります。に小さな穴を掘りますアガロース丸い鉗子この「解剖皿」を使用すると、解剖手順中に胚を保持するのに役立ちます。
3. 解剖ツールを収集：プラスチック転送ピペット（ガラスパスツールピペットの先端にパラフィンに埋め込 ​​まれた眉の毛で作られた）「眉ナイフ²² '、2細かい解剖鉗子、P1000マイクロピペットやヒント、倍率8-40Xとstereosmicroscope、光ファイバガイドに明るい光源。きれいなすべての解剖ツールをキープ。各実験後、一旦100％エタノールと蒸留水で2回、それらをすすぎ、乾燥させてください。金属解剖ツールほこりから、必要であれば、オートクレーブ離れて保管してください。
4. X.解離し、再凝集のAC（プロトコル3）をしてみましょう、とその兄弟彼らはステージ13（神経胚）に達するまで、 ツメガエル胚を Nieuwkoopとフェーバー発達表¹⁷に従って開発しています。 15胚をステージングする神経板ステージ13内に移植するために使用されています。
5. すべてのアウトキャリー実体顕微鏡下でのその後の工程。
6. プラスチック製のトランスファーピペットを用いて、0.2％BSAを補足カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS中に胚を移します。以前に^20を説明したように、胚の卵黄膜を除去します。 1鉗子で胚を修正しました。他の鉗子の側面と卵黄膜をピンチ。しっかり膜を持ち、ゆっくりと胚を、それを剥がします。
   注：胚の腹側（植物性）側に、この手順を実行します。胚神経板を損傷しないでください。胚卵黄膜除去工程の間に損傷した場合は、プラスチック製のトランスファーピペットを用いて3/4 NAMを含む60 mmのペトリ皿に胚を移し、15分間、治癒過程が起こるのに十分な時間を待ちます。
7. 新鮮3/4 NAMでトップに解剖皿に記入してください。
8. プラスチック製トランスファーピペットを用いて、解剖皿に自分の卵黄膜なしで胚を転送します。胚の背側を上に置き井戸。転送処理中に胚はXのため、気液界面に接触して入力することはできません。 ラエビスは、表面張力によって溶解されます。
9. プラスチック製トランスファーピペットまたはマイクロピペットP1000を使用して、解剖プレートに移植する交流植片を転送します。ピペットは、液体内にあるならば、外植片をゆっくりと重力によって沈む、または非常に軽くプッシュすることができます。
10. 丸みを帯びたピンセットで胚を維持します。眉ナイフで、あなたの外植片の一部を移植する予定神経板に切り込みを入れます。
    注：神経板の前方曲がりがランドマークとして使用することができますステージ14で、それが間脳の領土（ 図4）をマークします。
11. 丸みを帯びたピンセットや眉kniveを使用して、神経上皮の小片を切り取り。眉ナイフで外植片の小片をカット。
    注：外植片が神経上皮アブレーションされた領域と同じ大きさと形状であるべきです。
12. 眉ナイフと細かい鉗子を使用して、神経上皮の切開部に外植片のピースを置きます。外植片が急速に胚に付着していることを確認してください。
13. あるいは、所定の位置に移植片を維持するために移植された胚の上にカバーガラスの作品を配置します。これを行うには、粗鉗子を使用して非常に小さい部分に細かいガラスカバースリップをカット。大きさは約1.5mm ²であることを確認してください。ピンセットを用いて3/4 NAMまたはPBSを含むペトリ皿にピースを浸し。それの損傷を防ぐために、胚よりも大きなガラス片を選択してください。胚は少し平らになります。
14. 移動せずに、少なくとも30分間待つか、だけ優しく解剖プレートを移動します。胚が2時間30分で回復し、必要に応じて静かにカバースリップを削除してみましょう。慎重にプラスチック製のトランスファーピペットを用いて、3/4 NAMで満たされたきれいな皿にグラフトされた胚をピペット。
    注：グラフト胚は、細菌または真菌汚染を開発する傾向があります。長期Cのカナマイシン（50μg/ ml）、アンピシリン（50μg/ ml）およびゲンタマイシン（/ mlの50μgの）：ultureは、抗生物質を使用しています。

結果

異なる種、発生学的操作、および調節遺伝子の発現パターンの形態学的考察に基づいて、概念モデルは、神経板が別個の組織原のフィールドを生成発達グリッドを定義し、横方向と縦方向のセグメントに分割されていることを保持しています。神経板では、前脳、中脳、後脳と脊髄の原基はすべて、すでに^（23-25 ​​で検討）原腸陥入時に前後（AP）軸に沿って確立されています。神経胚形成の間に、組織原のフィールドは、遺伝子発現の空間的に制限された領域として検出することができます。調節遺伝子の発現パターンに基づいて、前脳の原基はprosomeres（P）と呼ばれる別個の組織原のフィールドを生成し6の横方向のセグメントに分割されます。各prosomereは腹側（基礎）及び^（26,27に投稿）背側（鼻翼）の部分に分割されています。両生類では、prosomere 2（P2）は、視床上部と視床へとそのオーガナイザー^（28,29に概説されている）、Z ONA L imitans

ディスカッション

神経発生は^（3,31,32に投稿）周囲の組織からの細胞の発生プログラムと信号間の複雑な相互作用によって編成されます。ここでは、Xで使用することができるプロトコルのセットを記述し外因性およびin vitroおよびin vivoでの神経運命の決意と神経形態形成に関与する内因性の要因を探るために胚をアフリカツメガエル 。これらのプロトコルは、Xでそのまま使用することができしかしトロピカ胚 、X.トロピカ胚は、Xの後、4倍小さく、胚をアフリカツメガエル 。鉗子やタングステン針の両方が微細化する必要性を使用していました。可能な場合は、Xを使用しますアフリカツメガエル 。

Xの正確な可視化ツメガエルとX.トロピカ神経組織原のフィールドは、WM-ISHから解剖し、神経管の組織学的フラットマウントを使用して達成することができま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
パラホルムアルデヒド	VWR	20909.290	有毒な
陰イオン交換樹脂ビーズ	Biorad	140- 1231
ウシ血清アルブミン	SIGMA	A-7888	動物キャップの培養用pH 7.6
ゲンタマイシン	GIBCO	15751-045	抗生物質
ウシ血清アルブミン	SIGMA	A7906	ビーズ調製用