コンピュータ支援ビデオとデジタル画像解析を用いた銅水溶液の急性暴露に応答して、魚の遊泳行動を定量化

サマリー

魚の行動に環境汚染物質の影響を測定することは、亜致死エンドポイントを扱う場合は特に、多くの場合、主観的かつ挑戦的です。我々は、中および銅の種々の濃度に対する96時間の急性曝露後初期生活段階白チョウザメ（ シロチョウザメ ）の遊泳行動を定量化するためのビデオ技術を含む方法が記載されています。

要約

>jove_content<環境汚染物質に対する水生生物の行動反応は、生存、成長、または繁殖などの他の影響の前兆である可能性があります。 ただし、これらの応答は微妙である可能性があり、測定が困難な場合があります。 この論文では、銅を露出したシロチョウザメの稚魚(Acipenser transmontanus)を使用して、コンピューター支援ビデオおよびデジタル画像分析を使用して行動反応を定量化するために使用される手法を示しています。 以前の研究では、初期の生活段階のシロチョウザメの間で、銅への急性および慢性の曝露中に遊泳行動の深刻な障害が観察されました。 チョウザメの行動は急速に損なわれ、魚が下流に流されたり、捕食者に容易に捕らえられたりするため、野外での生存が危険にさらされるほどでした。 この調査の目的は、一連の急性銅曝露中の遊泳活動を定量化して、初期のライフステージの発達中に効果を発揮する時間を決定するためのプロトコルを説明すること、およびこれらの応答がこれらの脆弱な初期ライフステージの魚の生存に関連することを理解することでした。 死亡率は時間連続体上にあるため、銅が最初に遊泳能力に影響を与える時期を特定することは、人口レベルの影響への影響を理解するのに役立ちます。使用される技術は、他の生物やストレッサーを用いた実験計画に容易に適応できます。

概要

汚染物質の曝露は行動にどのように影響するかを理解することは時間に非常に困難かつ主観的です。行動は、一般的に、中枢神経系を介して動作と、生き残る成長し、再現するために生物を有効に明白な、観察可能な、全身の一連の活動として定義されています。生存率¹と比較した場合に起因する毒物への暴露に行動の変化は、環境ストレス、多くの場合、10から100の間の倍の感度の最も敏感な指標の一つです。これらの研究の大半は、スイミングアクティビティ、換気、および魚の^2,3,4の採餌行動を調べました。水泳の活動は、毒性試験⁵中の汚染物質に反応して行動変化を決定する上で最も頻繁に使用される亜致死のエンドポイントです。水泳変数は、周波数や旅の移動、速度と距離の期間、頻度およびターンの角度、位置水柱中や水泳のパターンを含みます。水泳活性があります遊泳行動の有効な手段水生毒性の本の基礎にランド⁶により、第9章で提案された基準に基づいて、毒性物質に対する感受性を評価します。

本稿では、早期開発の様々な段階での早期のライフステージ白チョウザメへの銅の毒性（ シロチョウザメ ）水のみの遊泳行動を評価したチョウザメする相対的なエクスポージャー方法の例として、毒性学的研究を提示し、水泳を定量する方法を示しています動作。

以前の研究では、有害な行動反応は銅に急性および慢性暴露の最初の数日の間に早期発症と明らかにしたと暴露時間と濃度の^7,8,9の上に次第により厳しいなりました。これらの行動反応の発症の大きさとタイミングが長期生存を制限する可能性が十分であり、したがってrecruiに影響与え懸念されますtment障害^10。正確に金属露出方法および手順に、この感度の意義を解釈するために銅濃度を基準に行動の減損の時間経過と程度を定量化するために開発されました。

行動機能と開発のための試験プロトコルは、露光チャンバ内でチョウザメのオーバーヘッドビデオサンプルを分析することによって確立しました。ビデオサンプルは、暴露期間を通して銅処理間発達と機能の定性的な評価を提供します。行動と避難所を追究活動を行うようにと協調、平衡、および呼吸を泳いで、避難所のシーク、無気力に影響を与える減損の時系列を特徴づけるために時間を決定するために、水性銅濃度に対するエクスポージャーの間に評価しました。また、ビデオ録画を定量的に文書化する自発的な水泳ACTIの目的のために複製それぞれからサブサンプリングされたチョウザメで作られていましたVITY。これらのエンドポイントは、持続時間の測定が含まれるか、または時間が移動費やし、遊泳速度及び距離は、商業的に利用可能なデジタル画像分析ソフトウェアパッケージを用いて^5,11を旅しました。このソフトウェアは、視野内の各画像の輪郭を定義し、このことから、各画像の重心を定義します。ソフトウェアは、運動の経路を決定するために、フレームの連続によってフレーム内の各重心の位置を追跡することができます。

動物福祉法の規定（9 CFR）の最終規則の該当するすべてのセクションで、文化と実験中の試験生物の人道的な扱いのためのすべての施設のガイドラインを遵守し、この研究。研究の終了時に、すべての魚は、米国地質調査所のための制度的動物実験委員会、コロンビア環境研究センターによって承認されたように、適切なガイドラインに従って安楽死させました。

プロトコル

銅水溶液濃度に幼虫チョウザメ曝露1.セットアップ希釈

1. ASTMインターナショナル^13,14,15によってガイドライン以下のように変更されたマウントとBrungs ¹²希釈システムとしてフロースルーシステムを使用して設定エクスポージャー。
2. 効果は4-6μg/ Lが周囲に観察された前回のテスト結果に基づいて、高銅濃度として25μg/ Lがを選択します。試薬グレード銅II硫酸五水和物（純度> 98％）を使用し、試験原液をミックス。
   注：エクスポージャーについては実施例の一連の濃度は25、12.5、6.25、3.125、1.0625、0μg/ Lがあります。高濃度として25μg/ Lが始まる50％の段階希釈を使用すると、行動障害を引き起こすことが観察された濃度の範囲を対象とします。
3. 使用して希釈混合室をスパイクするために提供するために、露光開始の48時間前までにメスフラスコ中の試験原液を調製し、設定自動シリンジディスペンサー。
4. 希釈混合室は、試験ストック溶液1mlでスパイクされたときに、25μgの/ Lの銅濃度をもたらす1Lの脱イオン水に添加する化学物質の量を決定するために、スプレッドシートテンプレートを使用します。
   注： 図1は、希釈毒性試験のための化学ストックを調製するためのスプレッドシートテンプレートの例を示します。
5. 化学天秤を使用して、試薬グレード銅II五水和物195mgのを秤量し、1リットルのメスフラスコに注ぎ、48.65 mg / Lでのストック濃度を脱イオン水1Lと混合。
6. 試験原液に自動シリンジディスペンサーから吸気管を配置し、1ミリリットルにスパイク音量を設定し、電源スイッチを反転することによって希釈をオンにし、48時間サイクルは、それはストッキングの前に、対応する銅濃度に平衡化することを可能にしましょうチョウザメ。
7. インラインの4ウェイ・フロー・スプリッタを取り付け 16。重力は水を供給しました。希釈の電源がオンになり、ソレノイドバルブは、水が希釈タンクに流れることができる開かれた希釈を循環水を。 15℃にチラーユニットを設定し、希釈水槽内の水を循環させるウォーターポンプをオンにします。
   注：このプロセスは、自動タイマーを用いて調節されます。
8. 自動タイマーを使用してのサイクルに30分毎に希釈を設定し、それぞれに一日あたり12ボリュームの追​​加で、その結果、各サイクルでの試験250mlの水を届ける試験室を複製します。
9. チョウザメの大きさに基づいて選択曝露試験チャンバは、任意の時点で任意のチャンバ内の許容可能な負荷である速度<10グラムの魚の湿重量/ Lを維持します。たとえば、30日後に孵化（DPH）白チョウザメ（グラムでの平均重量0.17グラム）、12×を使用するとエクスポージャーを実施しますサイド4cmの穴に21.5センチメートル²ガラスの瓶。試験水の通る流れを可能にするために、30ミクロンメッシュのステンレス鋼スクリーンでこの辺をカバーしています。露出の瓶内の試験水の体積は1 Lです。
10. 12個のサンプルの合計各濃度の2つの複製50mlの水のサンプルを採取し、100mlのガラスビーカーに試験水を分配し、溶存酸素（DO）、温度、伝導率、pHは、アルカリ性、硬さを測定する50 mlのプラスチック製注射器を用いて、トータルアンモニア、主要な陽イオン、主要な陰イオンおよび溶存有機炭素の標準的な業務用機器を使用し、製造元の指示に従ってください。
    注：サンプルは、露光の開始と終了時に取られるべきです。
11. 化学分析のためにサブサンプルを収集するには、代わりに針の注射器に取り付けられたシッパーわらを用いて露光室から試験水の約24ミリリットルを描き、25ミリリットルのプラスチック注射器を使用しています。
12. SYからシッパーわらを削除しますringeポリプロピレンフィルターカートリッジハウジングをプラスチックシリンジに孔径0.45μm、ポリエーテルスルホン膜を配置し。
13. フィルターを通して試験水4mlを押して処分します。
14. 酸洗浄ポリエチレン瓶にフィルターを通して試験水の残りの20ミリリットルを分配し、3ヶ月までの貯蔵のための高純度、16 M硝酸1％体積/体積に酸性化します。
    注：化学分析のための試料は、銅濃度を確認するために、露光の開始、中間及び終了時に取られるべきです。
15. 米国環境保護庁メソッド6020a ¹⁷以下の誘導結合プラズマ質量分析法を用いて化学分析を行います
16. すべての水のサンプルを採取し、希釈はそれぞれに、株式10（ランダム、でたら​​め）チョウザメを循環した後に試験室を複製します。彼らは小さなメッシュ非研磨ネットを使用して収容されている培養槽からチョウザメを収集します。小さなbuckeでチョウザメを配置培養水でトン。 240魚の合計は、露光を開始するために必要とされます。
17. 露光中に魚を餌を与えないでください。
    注：希釈レイアウトの視覚的なセットアップについては図1を参照してください。
18. 露出と記録魚の死亡率およびモニタ遊泳行動の期間中、毎日のテストをお読みください。
    注：他のエンドポイントは無気力、均衡の喪失、呼吸の変化、色素沈着の変化を含めるを探すためには、位置の魚が活動し、視覚的に識別することができる任意の他の異常を隠し、水柱です。
    注：一貫性を保つために毎日同じ時刻にテストをお読みください。
19. 市販のデジタルトラッキングソフトウェアプログラムを使用して（時間の魚は、移動速度を過ごしたとの距離を移動）を測定し、水泳の活動を定量化します。

2.露光中に観察および死亡率のカウント

1. 視覚的に各テストCHを検査アンバーノートの死亡率、好ましくは朝に、96時間の曝露の間、毎日ほぼ同じ時刻にデータシート上の行動チェックリスト（ 表1）を使用して、異常行動の観察。
   注：著しく、柄にもなく、主観的に、コントロールとは質的に異なるが異常と見なされている行動。最適な観察者が治療を認識しません。
   注：平衡の損失が水柱内に直立姿勢を維持するために魚のできないこととして定義され、不動が移動または突いない限り泳ぐ魚のできないこととして定義されています。そのような無気力、多動、呼吸の増加または減少、色の変化、振戦、痙攣、肥大化した腹部、水柱内の位置や他の異常な水泳パターンは、データシートに記録されるべきであるとして、他の異常。
   注：異常の例については、ビデオ1を参照してください。動作。
2. 記録と毎日死んでチョウザメを削除します。
3. プローブを用いて溶存酸素（DO）メーター手持ちを使用すると、データシート上の各暴露濃度とレコードの2回の反復でその場で 、レコード水温の溶存酸素を測定します。

3.ビデオ撮影水泳活動

1. 手持ち式ビデオカメラを用いてキャプチャ映像データサンプルは、行動異常を記録するために検査室の真上に配置三脚に取り付けられています。
2. 水泳の活動を定量化するために、直径PVCパイプ13 cmの部分をカットし、背の高い13センチは、テストアリーナ（ 図1）として使用します。各対応する銅濃度の暴露タンク内の希釈に塩ビ管を配置します。これは、約自由に泳ぐチョウザメのために十分な大きさであるように、テストアリーナとしてPVCパイプ内の領域を使用してください。
3. 96時間の曝露の終了時に、ランダムに各銅concentratioから5生き残ったチョウザメをサブサンプリングnは水泳活性について測定し、小さなメッシュネットを使用して、テストアリーナにそれらを配置します。
   注：チョウザメ死亡率が優勢であったより高い試験濃度で、任意の残りの生存チョウザメが水泳活性を測定するために使用する必要があり、場合によっては5未満であるかもしれません。
4. テストアリーナに魚を置いた後、魚は30分の時間のために順応することができます。
   注：ビデオの成功、エラーフリー分析魚の画像を不明瞭または非表示にするかもしれない構造の最小と背景に魚の高コントラスト画像を必要とします。魚のイメージが良い焦点でなければなりませんし、表面グレアの無料または希釈システムをオフにする必要がありますので、水の移動に起因する歪みのないものでなければなりません。
5. 30分後、ビデオカメラをオンにし、2分間の期間、スイミングアクティビティを記録するRECに設定します。
6. であることを決定するためにビデオ録画を取った後、魚を安楽死させますhavior。
7. ふたの運動の停止を可能にするために、少なくとも10分間、トリカインメタン（MS222）水の濃縮溶液中でチョウザメを置きます。
   注：少なくとも250 mg / Lでの濃度が推奨されており、特定の種のためにはるかに高くなる可能性があります。
8. 後で廃棄するために冷凍庫にプラスチックジップロックバッグ、所定の位置に安楽死させチョウザメを置きます。ビデオカメラの電源をOFFにして、デジタルトラッキングソフトウェアを使用して、後処理のためにコンピュータにすべてのビデオファイルを転送します。

ビデオ再生から水泳活動の4施策

1. 実験は、分析するためのデータシートおよび映像データファイルを検索します。デジタル解析ソフトウェアが扱うことができる互換性のある形式にビデオファイルを変換します。
2. ソフトウェアに処理されるすべてのファイルをアップロードします。アイコンをクリックして開く追跡ソフトウェア。 「新しい実験を作成し「○下の「新しいデフォルトの実験」をクリックします。メイン画面のption。
3. 画面に表示される「新実験」ダイアログボックスで、テストの名前を入力します。場所の実験ファイルを選択すると、保存します。 「OK」をクリックします。 「ビデオソース」の下の「ビデオファイルから」「セットアップ」.Chooseの下の "実験の設定」オプションを選択します。
4. "アリーナの数」を「1」を選択します。 「アリーナ当たりの被験者数」のための「3」を選択します。 「追跡された機能」の下に「センターポイントの検出」を選択します。目的の単位を選択します。
5. 「設定」の下の「トライアルリスト」オプションを選択します。画面の上部にある「ビデオを追加」をクリックします。画面に表示される「動画を追加」ダイアログボックスの「ソート順」オプションで「アルファベット順」を選択します。 「参照」をクリックしてください。ビデオファイルが置かれている場所フォルダに移動します。
6. すべてのビデオファイルを強調表示します。 「開く」をクリックしてください。画面の上部にある「変数の追加」をクリックします。 "に"集中 "を入力してくださいラベル」ボックス。入力してください "説明"ボックス "への"マイクログラム/ L中の銅濃度。
7. 「タイプ」のためのドロップダウンリストから「数値」を選択します。 「事前定義された値」ボックスをクリックしてください。表示された「数値を事前定義」ダイアログボックスでオプション「個々の値を定義」を選択します。
8. 「所定の値」の空間に「0」、「3」、「6」、「13」、「25」と入力し、「50」。各番号の添加の間、「追加>>」をクリックします。オプション「他の値を許可する」のチェックを外してください。 「OK」をクリックします。
9. 「適用範囲」ボックスで、ドロップダウンメニューから「体験版」を選択します。提供ボックスに各試験のための適切な濃度を入力します。画面の上部にある「変数の追加」をクリックします。 「ラベル」ボックスに「複製」と入力します。 「説明」ボックスに「番号を複製」を入力します。 「タイプ」のためのドロップダウンリストから「数値」を選択します。
10. P」をクリックします再定義された値」ボックス。選択」の数値を事前定義」のオプション「個々の値を定義します>> "。スペースをクリックして" 1 "、" 2 "、" 3 "と" 4定義済みの値」に「 "ダイアログボックスが。入力し、「追加します「各番号の添加の間。チェックを外し、「他の値を許可」option.Click「OK」。
11. 「適用範囲」ボックスで、ドロップダウンメニューから「体験版」を選択します。提供ボックス内の各試験のために適切な複製番号を入力します。画面上部の「設定」タブの下に "アリーナ設定」を選択します。最初の設定「試験1」という名前を付けます。 「アリーナ設定（試験1）」ダイアログボックスから「グラブ背景画像」オプションをクリックします。
12. 「グラブ背景画像」ダイアログボックスの「参照」をクリックします。試験1のためのビデオファイルを見つけて、「開く」をクリックします。ビデオが表示された後、「グラブ背景画像」ダイアログボックスで「グラブ」オプションをクリックします。画面ウントの上部付近に白い丸いアイコンをクリックします「アリーナ設定」えー。
13. 全体スイミングエリアが円で囲まれているように表示される円を操作します。アリーナエリアが定義されている場所ハッチマークが表示されます。 「アリーナ設定」の下の画面の最上部付近に「キャリブレーションスケール」アイコンをクリックします。アリーナの一方の端を左クリック。持ち、アリーナの反対側の端に上にマウスをドラッグします。左クリックを離します。
14. 表示された「キャリブレーション距離」ダイアログボックスで「実世界距離」ボックスに「10.5」と入力します。 「OK」をクリックします。必要であれば、それは円形競技場の全体の直径にまたがるように、検量線を調整します。
15. 「アリーナ設定（試験1）」ダイアログボックスの「検証アリーナ設定」オプションをクリックします。設定が検証されていない場合は、任意の問題に対処。右画面の左メニューから「新規作成」を選択する上で「実験エクスプローラ」ツールバーから「設定」オプションで「アリーナ設定」をクリックします。
16. アリーナは、時間設定が終了するまで繰り返して、4.11から4.15ステップ各試験のために作成されてAVE。各試験のための適切なビデオファイルを選択してください。画面左側の「実験エクスプローラ」ツールバーから「設定」オプションで「検出設定」を選択します。
17. "：検出設定1検出設定」ダイアログの「件名識別」の下で、各被験者ごとに異なる​​塗りつぶしの色をappears.Choose：「検出設定の1検知設定」ダイアログボックスでドロップダウンメニューから「メソッド」の下の「動的減算」を選択します。ボックス。
18. 「選択ビデオ」を選択して、「ビデオ」の下の「サンプルレート」ボックスから試用1.Click「開く」.Select「5.9941」のためのビデオを見つけて、「検出設定：検出設定1」ダイアログボックス。 "：検出設定1検知設定」ダイアログボックスで「検出」の下の「参照画像」オプションの「設定」をクリックしてください。
19. 「スタートラーニング（C）をクリックします4;参照画像を学習するプログラムは、「参考画像」ダイアログbox.Waitでオプション。 「参照画像」ダイアログボックスの画像が動物なしで表示されたら、クリックしてダイアログボックス内の「取得の設定」の「動的な参照画像を使用してください」。
20. 「閉じる」をクリックします。ダイアログボックス：「検出設定1検出設定」の「検出」の「サブジェクトがある」のドロップダウンメニューから「暗い」を選択します。検出設定1」ダイアログボックス：「33」に、より少ない数と「検出」、「検出設定の下の「ダークコントラスト」のためのより多くの「153」に設定します。
21. "：検出設定1検知設定」ダイアログボックスの右下にある「変更を保存」をクリックしてください。 「再生コントロール」ダイアログボックス上の再生ボタンをクリックして、影やゴミとは対照的に、そのソフトウェアが正常に動物を追跡​​していることを確認します。 「ダークコントラの数値を調整します必要に応じて、トン」。
22. "：検出設定1検知設定」ダイアログボックス追跡が適切になったら、右下の「変更を保存」をクリックします。画面左側の「実験エクスプローラ」ツールバーから「設定」オプションの下に「取得」を選択します。
23. 「取得設定」ダイアログボックスで「トラックの次の計画の試行」をクリックしてください。正しい裁判を確認し、ビデオや舞台設定が「取得設定」ダイアログボックスの「設定」の下に表示されます。
24. 「取得制御」ダイアログボックスの「検出は速度を決定する」オプションをチェックしてください。取得プロセスを開始するために白い四角で囲まれた緑の円の付いたボタンをクリックします。すべての試験が追跡されるまで繰り返して、4.22から4.23までを繰り返します。
25. O「ネスト」の下screen.Chooseの左「時間」の「実験エクスプローラ」ツールバーから「データ・プロファイル」「分析」の下のオプションをクリックします「コンポーネント」ツールバーのption。 「時間」ダイアログボックスで見出し「トラック時間間隔を選択」の下に「0時02分00秒」「へ」を調整してください。 「OK」をクリックします。
26. 画面右側の「データ・プロファイル」領域で「スタート」ボックスと「結果1」のボックス間の「巣」のボックスをドラッグします。画面左側の「実験エクスプローラ」ツールバーから「分析」オプションで「分析プロファイル」をクリックしてください。表示された「従属変数」ツールバーの見出し「距離と時間」の「ベロシティ」をクリックしてください。
27. 「ベロシティ」ダイアログボックスの「追加」をクリックします。 「従属変数」ツールバーの見出し「距離と時間」の「距離を移動」をクリックします。 「距離を移動」ダイアログボックスの「追加」をクリックします。 「個人の行動」「従属変数」に向かっトンの下に「運動」をクリックしてくださいoolbar。
28. 「運動」ダイアログボックスで見出し「外れ値フィルタ」の下の「平均化区間」から「1」を調整します。 「運動」ダイアログボックスで見出し「しきい値」の下に「2.00」と「停止速度」を「速度を起動」を「1.75」を調整してください。
29. 「移動」と「運動」ダイアログボックスで見出し "のための統計の計算」の下に「移動しない」の両方のチェックボックスをオン。 「運動」ダイアログボックスの下部にある「追加」をクリックします。画面左側の「実験エクスプローラ」ツールバーの「結果」オプションで「解析出力」をクリックしてください。画面の上部にある「計算」をクリックしてください。
30. 従属変数が計算されると、画面の上部にある「エクスポート」をクリックします。 「エクスポート解析出力」ダイアログボックスで保存先のフォルダを選択してください。 「エクスポート分析Outpuで「ファイルの種類」ドロップダウンメニューから「エクセル」を選択トン」ダイアログボックス。クリックして "" OK。
31. 画面上部の「ファイル」タブで「保存実験」をクリックしてください。デジタル追跡ソフトウェアを閉じます。スプレッドシートファイルにデータをインポートして、商業統計解析ソフトウェアパッケージを使用して分析します。

結果

手動で処理する視覚観測データは、2日後に孵化（DPH）チョウザメ（ 図2）で開始曝露のわずか72時間後に増加銅濃度とともに増加パーセントの異常を示しました。ビデオサンプルは、チョウザメの遊泳行動（動画2）上の銅暴露の極端な影響を文書化し、その結果としての行動障害を定義する際に支援します。別の例では、30 DPHでのチョウザメは、死亡率のみに基づいて40.3μg/ Lを96時間半数致死影響濃度（LC50）と銅の露出に敏感であることが判明しました。しかし、平衡および固定化の損失の亜致死行動エンドポイントは、死亡率と一緒に含まれている場合2.4〜5.0μgの/ Lの範囲の推定96時間中央値は影響濃度（EC50）での感度が高くなります。記録された行動異常のビデオドキュメントこれらの亜致死影響を捕獲し、さらに検証人間観察露光中。水泳活動を分析する場合、デジタルトラッキングソフトウェアの使用は、後処理時間を減少させました。魚の遊泳速度は、時間が動いて過ごした、との距離はすべて大幅に増加銅濃度で（ 図3）減少し 、トリップアドバイザー。水泳経路も増加銅濃度（ 図4）で還元しました。

図1：試験原液濃度目標濃度に基づいて、スプレッドシートのテンプレートを使用して決定した希釈毒性試験のための化学の株式の準備を決定するために使用されるスプレッドシートのテンプレートのコンピュータのスクリーンショット この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：希釈のセットアップと実験デザイン白チョウザメのさまざまなライフステージが銅に曝露しました。露光のために使用される希釈のサイズは、魚の大きさに基づいて選択しました。 （a）は初期ライフステージのチョウザメは、大きな希釈のセットアップを使用して露光した小希釈のセットアップおよび（b）は 、古いライフステージのチョウザメを用いて露光しました。

図3：初期生活段階の白チョウザメ（ シロチョウザメ ）72時間の銅暴露（[DPH]魚30日の孵化後から始まる ） から 、 行動結果をスイミング 。白チョウザメDPH 30の間での移動の水泳活動のエンドポイントは、（a）の期間; （b）は、水泳のスピード。そして（c 移動strong>の）距離は96時間さらさ白チョウザメの中銅濃度の増加に伴って減少しました。アスタリスクは対照からの有意差を示し、エラーバーは標準偏差を表します。

図4：初期生活段階の白チョウザメ（シロチョウザメ）の結果96時間の銅暴露（2日目の孵化後[DPH]魚で始まる）の72時間後の平衡および固定化の損失を示す2 DPHで白チョウザメを存続。銅濃度の増加に伴って96時間暴露。アスタリスクは対照からの有意差を示し、エラーバーは標準偏差を表します。

図5：初期生活段階の白チョウザメ（チョウザメ属transmoから例水泳パス結果ntanus）96時間銅暴露（30日の孵化後[DPH]魚）と凝視。チョウザメの水泳経路が（N = 5魚）と（b）高い治療から（50（a）の制御の反復からのデジタルトラッキングソフトウェアを使用してデジタル化96時間曝露後μgの/ L）の反復（n = 3の魚）。不活性であったため、いくつかの魚の遊泳経路の数は、チャンバ内の魚の存在の数を表すものではありません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

定量化可能なパラメータ	観測パラメータ
速度	無気力/多動
距離移動	均衡の喪失
ゾーンで過ごした時間の長さ	痙攣/振戦/逆さまダウン
選択したゾーン間の時間生物の移動のゾーン遷移数	水柱内の位置
見出し興味のある点に向かって、動物のパスの偏差をポイント計算	呼吸（速い/遅いです）
見出しは、選択されたボディポイントの見出しを算出し、	着色
2サンプル間の見出しに角度差を回し	隠蔽
角速度計算サンプル間隔によって回転角度を分割することにより
移動距離によって旋回角度を分割することにより蛇行計算しました。異なる速度で移動する動物で回し比較するために使用されます
時間が動いて過ごしました
モビリティでもセントた場合、動物のように検出された完全なエリアが変更されている期間を状態は、計算しますER点は同じまま
選択されたボディポイントが360°の累積回転角を有するとき、回転一回転が終了します。無視される閾値未満の反対方向に回転。
移動度は、中心点が同じであっても、検出された動物の完全な領域の移動度の割合を連続計算します。
間の距離全ての関係者と選択した受信機との間の距離を被験者は、計算します
俳優であるか、または受信機に近接していないする期間を近接は、計算します
相対運動
ネット加重移動-（ポジティブ）に俳優の動きとそれらの間の距離によって重み付け（負の）受信機、から
加重移動から、movemeそれらの間の距離によって重み付け受信機から俳優のntは、。
それらの間の距離によって重み付け受信機に俳優の動き対加重移動、
2試用コントロール要素のイベント、または1つの要素内の間の試用制御state-期間
あなたが裁判コントロールに定義されている要素内のイベントが発生した裁判制御イベントモーメント。

表1：デジタル追跡ソフトウェアを介して定量化行動のエンドポイントは、これらのエンドポイントは、個人またはグループで使用され、また、露光時の行動障害を視覚的に観察チェックのリストとして機能することができます。

/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi "> ビデオ1：影響を受けた白チョウザメが示す異常行動のビジュアル定義（右クリックしてダウンロード）毎日観察チェックリストは、異常を文書化するために使用されたザ^・。。平衡および固定化の損失は、曝露の間に観察された最も一般的な異常であった。Calfee らから変更された^。7

ビデオ2：白チョウザメの遊泳行動の例を強調ビジュアルドキュメント。 （右クリックしてダウンロード）白チョウザメ水泳活性が大幅に増加銅濃度への暴露で還元しました。このビデオに描かチョウザメは、コントロール、中低、および96時間銅水溶液の終わりに高い治療からのものです暴露。 白チョウザメはまだ生きていたが、魚が大幅にコントロールと比較して治療が損なわれた明白です。 Calfee らから変更^。7

ディスカッション

汚染物質への暴露に行動の変化は、多くの場合、サブ致死毒性のエンドポイントとして使用されるが、測定することが困難な場合があります。一般的に、行動応答は、目視観察し、処理するために多くの時間を必要とする手動によるデータ分析により測定されています。技術を進めるとともにしかし、水泳の活動を定量化するための方法は、ビデオ撮影¹⁸および運動解析や処理および分析時間を短縮し、デジタルトラッキングソフトウェアを使用することに焦点を当てています。ビデオの分析の間ので、チョウザメの遊泳行動を分析するためのより効果的かつ効率的な方法を提供し、映像データの記録や魚のトラッキングソフトウェアの使用を消費手動で非常に時間があったであろう水泳変数を定量化、データを捕獲しました。手順は、魚の遊泳行動を強調したが、このような両生類や水生無脊椎動物のような他の生物のためにカスタマイズすることは簡単な変更を必要とするであろう。どのような行動endpoinに応じて、TSは、実験的なデザインとカメラシステムは、ちょうど約あらゆる市販の追跡ソフトウェアパッケージで使用するために開発することができ、アドレス指定されています。

この方法は、溶解した銅を用いて実証するが、他の水性汚染物質又は温度又は酸素含有量等の特性に適用可能です。本論文で開発し、提示されたプロトコルは、記録装置のような単純なデジタルビデオカメラを利用しました。デジタルファイルは、容易にコンピュータに転送し、運動解析ソフトウェアにアップロードされます。方法は絶えず変更され、定量化プロセスを合理化するために洗練されています。ビデオ品質を追跡するために、各個々の魚を識別するために解析ソフトウェアために高解像度であることが不可欠です。データファイルを処理しようとすると魚とのコントラストしない任意の背景には、問題が発生します。 2次元ビデオトラッキングと別の一般的な問題は、個人を識別しています水泳のパスが渡ります。これは、パスの横断中に各魚を識別し、ソフトウェア内経路セグメントを連結することによって、手動で補正することができます。あるいは、総活性は、グループの平均として各反復室から決定することができます。 1魚をそれぞれ含むものといくつかの個々のチャンバは、個々の魚の動きを計算するために、同じ視野で撮影することができます。

現在、我々は、高精細デジタルビデオ記録装置（HD-DVR）にリンクされている露光室以上のオーバーヘッドの監視カメラのシリーズを使用してアップグレードしました。しかし、高解像度のMPEG-4ビデオを録画することができます任意のカメラシステムの使用が動作します。 HD-DVRは、指定した時刻に記録するように設定し、7日間までプログラムすることができます。この手オフの自動化のアプローチは、魚の行動を損なう可能性外乱を最小限に抑えながら、一貫性を維持するために、同時に複数のビデオのキャプチャを可能にします。 HD-DVRのsysteMSは、そのようにファイルの転送は比較的簡単である内部ネットワークに接続されています。自動化されたカメラシステムは、遊泳行動を定量化するためのはるかに改善された技術ですが、まだ毒性試験中に行動障害を文書化するためなどの追加支援情報を提供するために視覚的な観察を行うことが有益です。

1960年代初頭^19,20,21にさかのぼる金属への暴露に起因する文献の文書化変更された魚の行動の長い歴史があります。銅はブルーギル²²でこのような活動低下などの活動レベルの変化（ ブルーギル属macrochirus rafinesque）とカワマス^23（ イワナ fontinalis）の運動と摂食活動の変化を引き起こすことが示されています。少なくともいくつかの稚魚の捕食者を検出し、回避するために、匂いの感覚に頼る、および銅誘導性の化学感覚の剥奪は、アラーム化学物質^24,25,26の検出に関連した行動に影響を与える可能性があります。嗅上皮は、それによって、見当識障害につながる可能性があり感覚のメカニズム、行動の回避、低減し供給および嗅覚²⁷に案内され、他の行動に影響を与えることにより、銅暴露に破損しています。これらの変更された行動は、エクスポージャーの間に観察されたものと一致しました。

白チョウザメの遊泳行動が大幅に銅水溶液濃度に致死量以下の露光時に影響を受けました。これらの結果は、動作が銅の亜致死濃度で影響を受け、毒性ストレスの指標として使用することができる方法を示しています。ビデオベースの分析では、遊泳行動を定量化するのに有効証明し、また銅にさらさチョウザメに深刻な影響の定性的な視覚的なドキュメントを務めていました。解析ソフトウェアは、他の様々な行動のエンドポイントを定量化することが可能です。リストについては、 表1を参照してください。露光システムは、各エンドポイントに対処するために変更することができますリアルタイムモードと関心のさまざまな汚染物質への曝露に関連した動作の違いを定量化するために使用することができます。

水生毒性学的研究における行動のエンドポイントの使用がますます採用されており、適応行動機能は、環境傷害⁹の決意に重要であるため、汚染物質の影響を評価する際に考慮すべきです。魚の行動への環境汚染物質の影響は、標準的な方法の不在下で亜致死エンドポイントを扱う場合は特に、多くの場合、主観的かつ挑戦的です..

厳密に監視することができ、これらの方法を使用して定量化活性を水泳、生物に最小限のストレスで非破壊的であり、繰り返すことができます。水泳の動作は、標準的な毒性試験⁵の感度を拡大するテストプロトコルに組み込まれるべきである亜致死毒性の有効かつ一貫性の指標です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
銅II硫酸塩五水和物	Sigma-Aldrich		懸念
リンジディスペンサー	ミルトンMicroLab600シリーズ		スパイクする装置
溶液を保持するための	2リットル容量フラスコ
24-1.5Lガラス瓶			2dphチョウザメビデオカメラ用テストチャンバー
	ハンディカムHDR-CX550V
デジタルトラッキングソフトウェア	Noldus Ethovision
3-17インチフラットスクリーンモニター24
台の監視カメラ	モデルCL101
3-16チャンネルデジタル記録デバイス
DOメーターYSI
pH	メーターOrion 940
phプローブ	Orion
アンモニアメーター
アンモニアプローブ	Orion
チラーユニット
再循環ウォーターポンプ