enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

サマリー

特定のゲノム領域に関連する分子の同定は、これらの領域の機能の制御メカニズムを理解するために必要です。このプロトコルは、特定のゲノム領域に関連するタンパク質およびRNAの同定のために、遺伝子操作されたDNA結合分子媒介クロマチンimunoprecipitation(enChIP)を実行する手順を説明しています。

要約

特定のゲノム領域に関連する分子の同定は、これらの領域の機能の制御メカニズムを理解するために必要です。特定のゲノム領域と相互作用する分子を偏りなく同定するために、私たちは最近、遺伝子操作されたDNA結合分子媒介クロマチン免疫沈降(enChIP)技術を開発しました。ここでは、enChIPを使用して特定のゲノム領域を分離し、関連するタンパク質とRNAを同定する方法について説明します。まず、目的のゲノム領域に、転写活性化因子様(TAL)タンパク質、または触媒的に不活性なCas9型とガイドRNAからなるクラスター化された規則的な間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)複合体でタグ付けします。その後、クロマチンは架橋され、超音波処理によって断片化されます。次に、タグ付けされた遺伝子座を免疫沈降させ、架橋を逆にします。最後に、単離されたクロマチンに関連するタンパク質またはRNAを、それぞれ質量分析またはRNAシーケンシング分析にかけます。このアプローチにより、目的のゲノム領域に関連するタンパク質やRNAの同定に成功します。

概要

興味のある特定のゲノム領域に関連する分子の同定は、このような転写およびエピジェネティック制御などのゲノム機能の調節のメカニズムを理解するために必要です。いくつかの技術は、特定のゲノム領域^1-7の生化学的分析のために開発されてきたが、それらは、ため、このような制限されたアプリケーション（例えば、唯一の反復を有する高コピー数の遺伝子座または遺伝子座など）と、それらの本質的な問題のため、この段階では広く使用されていませんあまりにも多くの時間と努力が必要です。

簡単に特定のゲノム領域の生化学的解析を実行するために、我々は2遺伝子座特異的クロマチン免疫沈降（チップ）技術、すなわち挿入チップ^{（iChIP）8-13}と設計のDNA結合分子によって媒介されるチップ^{（enChIP）14-17を開発しました} 。 iChIPでは、関心対象の遺伝子座は、レックスのような外因性のDNA結合タンパク質の認識配列を挿入することによってタグ付けされA.軌跡は、その後、タグ付けされたDNA結合タンパク質を用いたアフィニティー精製によって単離します。 enChIPでは、このようなジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子のような（TAL）タンパク質などのDNA結合分子を、設計、およびクラスタ化された定期的interspaced短い回文繰り返し（CRISPR）錯体は、（ 図1）は、対象の座をタグ付けするために使用されています。続いて、ゲノム領域は、タグ付けされたDNA結合分子の親和性精製によって単離されます。

iChIP enChIP上の利点の一つは、外来性DNA結合タンパク質の認識配列の挿入が必要ないことです。 Cas9の触媒的に不活性な形（dCas9）からなるCRISPR錯体とガイドRNA（gRNA）を使用して遺伝子座の標的化TAL、亜鉛フィンガータンパク質を使用してiChIPまたはenChIPにより、これらの領域の標的よりもはるかに簡単です。ここでは、遺伝子座アソシアを識別するために、（RNA-SEQ）質量分析およびRNAの配列決定と組み合わせenChIPのためのステップバイステップのプロトコルを記述テッドタンパク質およびRNAを、それぞれ。

プロトコル

ターゲット軌跡を認識エンジニアDNA結合分子の1デザイン

1. CRISPR複合体を使用してenChIPについては、以前に¹⁸として記述関心のゲノム領域における候補gRNA標的配列を同定するためにCRISPRdirect Webツール（http://crispr.dbcls.jp）を使用します。このWebツールは、対象領域内に'形式5'-N ₂₀ NGG-3の23 bpのゲノムのサイトを返します。
2. U6プロモーター配列及び5'-N ₂₀の配列商用サービスを使用して、5'-N ₂₀ NGG-3 'を含むgBlock合成^19,20（ 図2参照）。目的をサブクローニングするために、gBlockの外に適切な制限酵素部位を含みます。
3. 以前に^16を説明したように適当なベクターにgBlockを挿入します。 gBlocksためのいくつかのレトロウイルスベクターは、（材料を参照）があります。
4. TALタンパク質を使用してenChIPため、TARGを認識TALタンパク質を設計ら座。商用サービスを使用してTALタンパク質をコードするプラスミドを生成します。先に記載¹⁵のような3×FLAGのような1つ以上のタグと融合したTALタンパク質を含む発現ベクターを生成します。

enChIP解析のための細胞の樹立2。

1. 以前に^14〜17のように分析する細胞に3×FLAG-dCas9とgRNA（CRISPRベースの手順）または3×FLAG-TAL（TALのタンパク質ベースの手順）を発現します。
   1. トランスフェクション効率が高い場合、一過性トランスフェクションを使用してください。 3×FLAG-dCas9とCMVプロモーターを含む発現ベクターは、（材料を参照）が利用可能です。
   2. 一過性のトランスフェクション効率が低い場合、従来の方法を使用して安定した形質転換体を確立考えます。 gBlockする上述のレトロウイルスベクターに加えて、3×FLAG-dCas9のレトロウイルスベクターは、（材料を参照）があります。
2. 以前に^14〜17記載の抗FLAG抗体（AB）を用いたイムノブロット分析により、トランスフェクトされた細胞で3xFLAG-dCas9または3xFLAG-TALタンパク質の発現を確認してください。
   注：これらのタグ化タンパク質の発現は、抗FLAG-FITCおよびその後のFACS分析と細胞内染色によって確認することができます。細胞内染色のためのプロトコルは、弊社ホームページ（http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html）からダウンロードすることができます。
3. 標準的RT-PCR法によりgRNAの発現を確認してください。
4. 興味のあるゲノム領域と相互作用するタンパク質を定量的に同定するために、enChIP（enChIP-SILAC）と組み合わせた細胞培養（SILAC）分析におけるアミノ酸による安定同位体標識の使用を検討してください。
   注：SILAC分析のためのメディアは、市販業者から購入することができます。 SILACは、特異的な相互作用を検出するのに強力です。
   1. SILAC重い培地で細胞を培養します。細胞を準備cultu陰性対照としてSILAC光媒体中の赤。 （重鎖または軽）各SILAC媒体の少なくとも5×10 ^{7個の細胞}を使用してください。効率的な標識のために、両方のL-リジン^2HCl、13 C ₆およびL-アルギニン塩酸、SILAC重い培地で¹³ _C ^6、15 N _{4を追加します} 。注：少なくとも5の細胞分裂は、タンパク質を標識するために必要です。
      1. 例えば、培養ヒト線維肉腫HT1080細胞を安定的に37℃で3xFLAG-dCas9とgRNAを表現し、SILACのためのDMEM培地中で5％のCO ₂およびリジン- 2HClプラスL-アルギニン塩酸（ライト中）とウシ胎児血清を透析または¹³ C ₆ L-リジン-2HClプラス¹³ C ^_6〜15 N ₄ L-アルギニン塩酸（ヘビーミディアム^）16（材料を参照してください ）。培地500mlに光や重いL-リジン-2HClおよびL-アルギニン塩酸50mgを追加します。
      2. 細胞が指数growtを維持するようにトリプシン処理およびreplate細胞は、それらがコンフルエントになる前にH。

ホルムアルデヒドで細胞を3架橋

1. 懸濁培養細胞の場合、転送2×10 ⁷ 3xFLAG-TALタンパク質を発現する細胞または3xFLAG-dCas9プラスgRNA、50mlの遠心管中で、通常の培養液30mlに懸濁します。より多くの細胞が使用される場合、比例的な試薬の容積及び量を増加させます。 SILAC実験のために、重い媒体や光培地で培養した細胞（5×10 ^7細胞ずつ）混合し、2×10 ⁷個の細胞を含む5チューブに1×10 ^{8個の細胞}の合計を分割します。
2. 細胞懸濁液（最終濃度1％）の30 mlの37％ホルムアルデヒドの810マイクロリットルを加え、5分間37℃でインキュベートします。接着細胞については、直接培養培地の30 mlの37％ホルムアルデヒドの810マイクロリットルを添加することにより、培養皿で細胞を固定します。
3. 1.25 Mグリシン溶液（最終濃度127 mM）の3.1mlのを追加することにより、架橋を停止し、室温で10分間インキュベートします。
4. 遠心分離（4℃で5分間、300×g）と細胞を収集します。慎重にホルムアルデヒドを含む上清を破棄し、適切な廃棄ボトルに保管します。
   1. 接着細胞の場合は、50mlチューブ中の細胞スクレーパーと収穫して細胞を剥離し、この手順で説明したように細胞を収集します。
   2. SILAC実験のために、重い媒体や光培地で培養し分離した細胞（5×10 ^7細胞ずつ）混ぜ、2×10 ⁷個の細胞を含む5チューブに1×10 ^{8個の細胞}の合計を分割し、これに記載されているように細胞を採取ステップ。
5. チューブあたり二回のPBS 30mlで細胞ペレットを洗浄します。慎重にホルムアルデヒドを含む上清を破棄し、化学物質の安全性ガイドラインに従ってホルムアルデヒド廃棄物bottle.Handle適切な廃棄物に保管してください。固定した細胞を凍結し、-80℃で保存することができます。

クロマチンの4準備（あたり2×10^7細胞 ）

1. 細胞溶解緩衝液（10mMトリス（pH8.0）、1mMのEDTA、0.5％IGEPAL CA-630、および1×プロテアーゼ阻害剤）の10 mlの固定細胞を懸濁し、氷上で10分間インキュベートします。
2. 遠心分離サンプル（8分間、4℃で830×gで）、慎重に上清を捨てます。
3. 核溶解緩衝液（10mMトリス（pH8.0）、1mMのEDTA、0.5 MのNaCl、1％トリトンX-100、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.5％ラウロイルサルコシン、および1×プロテアーゼ阻害剤）10mlにペレットを懸濁します。 10分間氷上でインキュベートし、2〜3分ごとにボルテックス。
4. 遠心分離サンプル（830× 8分間4℃でグラム）と慎重に上清を捨てます。
5. 10mlのPBSでペレットを洗浄します。ペレット（クロマチンの画分）を液体窒素中で即時凍結した後、-80℃で保存することができます。

クロマチン5.超音波処理（2×10 ⁷個の細胞あたり）

1. 800μlの中でクロマチン画分を一時停止修正された溶解緩衝液3（10mMトリス（pH8.0）、1mMのEDTA、150mMのNaCl、0.1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、及び1×プロテアーゼ阻害剤）、及び1.5 mlチューブに移します。
2. 出力：超音波処理装置を用いて、クロマチン（材料を参照）、以下の条件超音波処理3。デューティ：100％（連続）。時刻：無料。 10秒間の超音波処理の10-18サイクルを実行し、20秒間、氷上で冷却します。過度の加熱を避けるために、2分ごとに5~6サイクルの間、氷上でサンプルをインキュベートします。発泡回避するために、0.5センチメートルチューブの底上記超音波処理プローブの先端の位置をキープ。
3. 遠心分離（4℃で10分間16,000×g）でサンプルを1.5 mlチューブに上清を移します。超音波処理し、クロマチンを液体窒素中で即座に凍結した後、-80℃で保存することができます。

クロマチン断片化の6評価

1. 蒸留水85μlの断片化クロマチンの10μLを混合します。
2. 4μLを追加5 MのNaClと65°のCO / Nでインキュベートします。
3. 10mg / mlのRNase Aの1μl添加し、45分間37℃でインキュベートします。
4. 、0.5 M EDTA（pH8.0）を2μl加え、1Mトリス（pHは6.8）の4μL、および20 mg / mlのプロテ​​イナーゼKを1μl、その後、1.5時間45℃でインキュベートします。
5. 例えば、SYBRグリーンなどの染料を染色含まない1％アガロースゲルで電気泳動による試料の別々の10μlの。
6. 断片化クロマチンの長さの分布を評価するために、ゲルを染色。 0.5〜2 kbpの（0.2-4 kbpの範囲）の平均長を生成する条件が推奨されています。
7. フェノール-クロロホルム抽出により、またはDNA抽出キット（材料を参照）を使用して、残りの試料からDNAを精製します。精製されたDNAは、（8.11を参照）enChIP分析の収率を推定するために、入力DNAとして使用することができます。

抗体によるダイナビーズ共役の7.製造（2×10 ⁷個の細胞あたり）

1. 前抗FLAG抗体とのインキュベーションのために正常マウスIgGおよび他を使用して、2つの1.5ミリリットルチューブ、事前クリアのための1つを削減します。各チューブに（材料を参照）プロテインG結合磁性ビーズ150μlのを追加します。
2. マグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。ピペットで上清を捨てます。
3. 0.01％のTween-20（PBS-T）を含む1mlのPBS中のビーズを一時停止します。磁気スタンドにチューブを置き、2分間待ちます。ピペットで上清を捨て、ステップを繰り返します。
4. 0.1％BSAを含むPBS-T 1ml中のビーズを一時停止します。
5. 正常マウスIgGまたは抗FLAG抗体15μgのを追加し、4°CO / Nで回転します。
6. その後、簡単にスピンダウンマグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。ピペットで上清を捨てます。
7. PBS-T 1ml中のビーズを一時停止します。サンプル数回転倒し、簡単にスピンダウン。その後、ピペットで上清を捨て、マグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。洗濯を繰り返してPBS-T（3回の洗浄工程の合計）でさらに2回。

8.クロマチン免疫沈降（2×10 ⁷個の細胞あたり）

1. ボリュームの五分の一の5％トリトンX-100（1％トリトンX-100の最終濃度）を含む改変溶解バッファー3の（約200μL）と5.3で製造した断片化クロマチン）（約800μl）を混ぜます。
2. 正常マウスIgGと結合させ、プロテインG結合磁性ビーズを準備されたチューブにクロマチン溶液を加えます。 1時間4℃で回転させます。
3. マグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。
4. 抗FLAG抗体とコンジュゲートプロテインG結合磁性ビーズを準備されたチューブに上清を移します。 4°CO / Nで回転します。
5. マグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。ピペットで上清を捨てます。
6. 低塩緩衝液（20mMトリス（pH8.0）を1mlのビーズをサスペンド、2mMのEDTA、150mMのNaCl、1％トリトンX-100、0.1％SDS、及び1×プロテアーゼ阻害剤）、5分間、4℃で回転します。マグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。ピペットで上清を捨て、洗浄ステップを繰り返します。
7. 二倍の高塩緩衝液（20 mMトリス（pHは8.0）、2mMのEDTA、500mMのNaCl、1％トリトンX-100、0.1％SDS、及び1×プロテアーゼ阻害剤）でビーズを洗浄します。
8. 二回（10mMトリス（pH8.0）、1mMのEDTA、250mMの塩化リチウム、0.5％IGEPAL CA-630、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、および1×プロテアーゼ阻害剤）のLiCl緩衝液でビーズを洗浄します。
9. 一度（50 mMトリス（pHは7.5）、150mMのNaCl、0.1％IGEPAL CA-630、および1×プロテアーゼ阻害剤）TBS-IGEPAL CA-630でビーズを洗浄します。
10. 溶出緩衝液200μl（50 mMトリス（pHは7.5）、150mMのNaCl、0.1％IGEPAL CA-630、1×プロテアーゼ阻害剤、および500 / mlの3×FLAGペプチド）中のビーズをサスペンドし、37℃でインキュベート20分。マグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。新しい1.5 mlチューブに上清を移し、ELUTを繰り返しますイオンステップ。
11. フェノール-クロロホルム抽出により、またはDNA抽出キット（材料を参照）を用いて溶出液の小部分（例えば、5％）からのDNAを精製します。精製されたDNAは、enChIPの収率を推定するために、特定のプライマーセットでPCRに使用することができ、入力DNA ^14,16以前説明したように、ステップ6.7で調製と比較することにより分析します。

9. SDS-PAGE、染色、および質量分析

1. 2-プロパノール、1mlの3M酢酸ナトリウム（pHは5.2）、および20 mg / mlのグリコーゲンの5μlと50μlの溶出液（400μl）を混ぜます。 -20°のCO / Nでクロマチンを沈殿させます。
2. 遠心サンプル（4℃で30分間16,000×g）で、上清を捨てます。再び70％エタノールおよび遠心分離機の1ミリリットル（4℃で10分間16,000×g）でペレットを洗浄します。ピペットで完全に上清を捨てます。
3. 2Xサンプルバッファー（125 mMトリス（pHは6.8）40μlの、10％の2-傭兵でペレットを中断aptoethanol、4％SDS、10％スクロース、および0.004％ブロモフェノールブルー）。完全にペレットを溶解するために5分間ボルテックスし、次いで、タンパク質を変性させ、架橋を逆に30分間、100℃でインキュベートします。
4. 色素はよく以下1cmに達するまで、SDS-PAGE、ゲル上でサンプルを40μlを実行します。注：は、通常、4-20％勾配ゲルを使用し、それ以外％ゲルを使用することができます。
5. クマシーブリリアントブルーまたは銀染色でゲルを染色します。
6. 5個（2ミリメートルの高さ）にゲルをカットします。
7. 先に説明したようにゲル^13-16消化および質量分析で行います。
8. 5×10 ^7細胞それぞれ（1×10 ^8細胞の合計）とSILAC実験のために、2倍の試料緩衝液40μlの中で最初の5チューブ（それがスケールアップする必要はありません）からのペレットを一時停止します。

RNAおよびRNA-のSeq解析の10精製

1. enChIP後、RNAを精製するために、RNA分解酵素阻害剤の5 U / mlのを追加（SE緩衝液のすべてに電子材料）は、修正された溶解バッファー3と溶出バッファーを除いたRNアーゼ阻害剤の40 U / mlのを追加します。
2. 5 M NaClを16μlの溶出液（400μl）を混合し、2時間65℃でインキュベートします。
3. サンプルに（材料を参照）は、酸グアニジニウム - フェノール系試薬の1ミリリットルを追加します。 15秒間ボルテックスした後、5〜15分間室温でインキュベートします。 12,000×gで、室温で15分間サンプルを遠心します。
4. 新しい1.5 mlチューブに上清を移し、P-ブロモアニソールの5μlを添加します。 15秒間ボルテックスした後、3〜5分間室温でインキュベートします。 12,000×gで、室温で10分間サンプルを遠心します。
5. 新しい2 mlチューブに上清（約1ml）を転送し、2-プロパノールの1ミリリットルを追加します。チューブを反転し、室温で10分間インキュベートします。 （材料を参照）、RNA精製キットでカラムに混合物をロードします。 12,000×で1分間カラムを遠心 GおよびRT。
6. ウォッシュRNA精製キット中のRNA洗浄緩衝液400μlの有するカラム（材料を参照してください）​​。
7. DNアーゼIカクテルの80μlのDNアーゼの5μlに（混合物I（1 U /μl）を、10×DNアーゼI反応バッファー8μlの、3 DNアーゼ/​​μlのRNaseフリー水、および中のRNA洗浄バッファー64μLを追加カラムへのRNA精製キット（材料）を参照）。 15分間37℃でサンプルをインキュベートした後、12,000×gで、室温で30秒間遠心します。
8. 二回のRNA精製キット中のRNA予洗バッファー400μlの（材料を参照）でカラムを洗浄します。
9. DNアーゼ/​​ RNaseフリー水50μlのRNAを溶出。溶出したRNAは、RNAの配列決定のために使用することができます。

結果

全体的に、対象のゲノム領域1〜30％がenChIPを用いて精製することができる。 図3は、enChIPの収量を示す代表的なデータを含んでテロメアとインターフェロン（IFN）調節因子-1（IRF-1）遺伝子のプロモーターを標的と分析しています。典型的な結果としては、例えば、 表1 enChIP-SILACで識別されるIFNγ特異的にIRF-1プロモーターに関連するタンパク質、 表2質量分析（enChIP-MS）と組み合わせenChIPで識別テロメア結合タンパク質として、 、および表3 enChIP-RNA-、配列番号で識別されるテロメアに関連付けられたRNA。

enChIPの1. 概要図 。 CRISPR（A、B）とTAL（C、D、Eを用い enChIP 強い>）が表示されます。興味の遺伝子座は、TALタンパク質またはCas9（DCAS）の触媒的に不活性な形で構成されるCRISPRシステムとして設計されたDNA結合分子でタグ付けし、（gRNA）のRNAを案内されます。必要に応じて、分子間相互作用は、ホルムアルデヒドまたは他の架橋剤で固定されています。その後、固定クロマチンは、超音波処理または酵素消化により断片化されています。タグ付けされたゲノム領域をアフィニティー精製によって精製されます。最後に、架橋を逆転させている、と相互作用する分子（ゲノム領域、RNAを、およびタンパク質が）、次世代シーケンシングおよび質量分析法を用いて識別されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

gBlockの図2のシーケンス。U6プロモーター（黒）、GヌクレオチドBガイド配列（青）、（赤）ガイド配列（gRNAスペーサー）、（緑色）足場配列、および（オレンジ色）ターミネーター配列EFORE示されています。

代表enChIP 3.収量を分析図 。 （A）対象IRF-1遺伝子座および非標的Sox2の遺伝子座のためのパーセントを入力。ターゲットテロメアと非標的γ-衛星の（B）の割合を入力。数値は適応し、前の出版物^15,16から変更されています。

カテゴリー	タンパク質
転写	DDX1、PARP1、CKAP4、Pescadilloホモログ、PURβ、 活性化されたRNAポリメラーゼII転写活性化P15、 BTF3、のMyb結合タンパク質1A
ヒストン脱アセチル化、 コリプレッサーコンポーネント	RBBP4、PA2G4、TBL3
アセチルトランスフェラーゼ	タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ1のN
DNAトポイソメラーゼ	DNAトポイソメラーゼ2α
ヒストン	ヒストンH2A.Z、ヒストンH3.2

表1：enChIP-SILAC で識別されるIFNγ特異的に人間のIRF-1プロモーター領域に関連するタンパク質の例の表は、以前の出版物^16から適応されています。

カテゴリー	タンパク質
哺乳類テロメア結合タンパク質	PML、RPA、CDK1、PARP1、PCBP1
テロメア-BI酵母におけるndingタンパク質 または他の生物	IMP4
テロメア結合と相互作用するタンパク質 タンパク質【関連テロメア結合タンパク質]	DNAポリメラーゼα（POLA1）[Cdc13p]、 ARMC6【TRF2]、CTBP1 [FOXP2-POT1]、 エクス-5 [TERT]、GNL3L [TRF1]、 エクス-1 [TERT]、14-3-3 [TERT]
ヘテロクロマチンに局在化するタンパク質	BEND3
エピジェネティックなマークを調節するタンパク質	KDM5C
その変異テロメア機能に影響を及ぼすタンパク質	DNAポリメラーゼα（POLA1）、HAT1、Nup133、 CDK7、DPOE1、PRDX1、TYSY、 グルタミン酸システインリガーゼ、グルタレドキシン、SMRC1

表2：enChIP-MS により同定したマウステロメアに関連するタンパク質の例には、表は、adapteされています以前の出版物¹⁵からD。

カテゴリー	RNAを
テロメラーゼコンポーネント	TERC、Rmrp
テロメアのRNA	TERRAs
scaRNAs	Scarna6、Scarna10、Scarna13、Scarna2
H / ACAのsnoRNA	Snora23、Snora74a、Snora73b、Snora73a
C / DのsnoRNA	Snord17、Snord15a、Snord118
lncRNA	Neat1

表3：enChIP-RNA-、 配列番号で識別されるマウスのテロメアと関連するRNAの例の表は、以前の出版物^17から適応されています。

ディスカッション

ここでは、CRISPRシステムやTALタンパク質などの操作されたDNA結合分子を用いて特定のゲノム領域を精製し、これらのゲノム領域に結合したタンパク質やRNAの同定について説明します。CRISPR干渉実験²¹で説明されているように、操作されたDNA結合分子のゲノムへの結合は、ヌクレオソームの位置決めを含むクロマチン構造に影響を与え、ゲノム機能を無効にする可能性があります。これらの潜在的な異常な影響を回避するために、標的ゲノム領域を選択するための具体的なガイドラインを提案します。まず、RNAポリメラーゼと転写因子の動員の潜在的な阻害、および転写開始部位周辺のヌクレオソーム位置の破壊を回避するために、プロモーター領域の分析のターゲット領域は、転写開始部位の上流(5')の数百塩基対である必要があります。対照的に、エンハンサーやサイレンサーなど、境界が異なるゲノム領域を解析する場合、操作されたDNA結合分子の結合がその機能に影響を与える可能性が低いため、これらの領域に直接並置されているゲノム領域を標的にすることができます。さらに、重要なDNA結合分子は進化的に保存された領域に結合することが多く、それらの結合を阻害すると標的ゲノム領域の機能が破壊される可能性があるため、異なる種間で保存されている標的領域の使用は避けるのが最善です。この点で、enChIP解析に用いる確立された細胞において、標的ゲノム領域の機能が維持されていることを常に確認する必要があります。複数のgRNAを簡単にテストでき、異なる標的ゲノム領域を認識するTALまたはジンクフィンガータンパク質の複数のバージョンを生成するのは面倒で費用がかかるため、CRISPRを使用したenChIPは、他のタンパク質を使用するenChIPよりも有利です。

dCas9はオフターゲット部位に結合することが示されていますが、それらの部位への親和性は標的部位への親和性よりも弱い可能性があります^22-25。これらのオフターゲット部位に結合した分子の汚染を管理するには、いくつかの方法があります。まず、いくつか、少なくとも2つの異なるgRNAの使用が推奨されます。異なるgRNAを使用するenChIPで一般的に観察される分子は、真陽性です。第二に、enChIPのさまざまな条件を比較することは、非特異的分子およびオフターゲット部位に結合した分子の汚染をキャンセルするのに効果的です。これらの比較セットの例としては、(i)刺激(-)および(+)、または(ii)T細胞とB細胞などの異なる細胞型があります。最後に、候補分子の結合の定量分析を実行して、標的部位への特異的な結合を確認する必要があります。陰性対照として、dCas9のみを発現し、gRNAを発現しない細胞を調製することが好ましい。

enChIP分析を使用して、特定のゲノム領域と相互作用する多くの既知および新規の分子を同定することに成功しました(表1-3)^14-17。しかし、この技術は、これらの領域と相互作用する他のいくつかの既知のタンパク質を検出できませんでした。たとえば、STAT1はIFNγ^刺激8でIRF-1プロモーターと結合すると報告されていますが、enChIP-SILAC分析では、このゲノム領域¹⁶と相互作用するように誘導されたタンパク質としてSTAT1は検出されませんでした。また、テロメアのenChIP-MS分析では、テロメアと相互作用することが示されているTRF-1とTRF-2からなるシェルテリンタンパク質は検出されませんでした²⁶。これらの不一致には、いくつかの理由が考えられます。まず、Stat1のIRF-1プロモーターへの結合の化学量論は非常に低い可能性があります。enChIP-SILACを含むenChIP-MSは、標的ゲノム領域とより豊富に関連するタンパク質を検出することは合理的です。したがって、これらのタンパク質を検出するには、より多くの細胞の分析が必要になる場合があります。MS装置の感度の向上は、化学量論的結合の低いタンパク質の効率的な検出にも貢献します。第二に、Stat1やシェルテリンを含む可能性のある一部のタンパク質は、MS分析の標的としては難しい可能性があります。第三に、テロメア結合タンパク質¹⁵の分析では、テロメアを認識する3×FLAG-TALタンパク質(3×FN-Tel-TAL)が、シェルテリンとテロメアの結合を競合的にブロックした可能性があります。

enChIPを用いて特定のゲノム領域に結合する転写因子を検出することが相対的に難しいのに対し、enChIP解析を用いてヒストン修飾酵素などのエピジェネティックな調節因子を同定することに成功しました。この技術の成功は、エピジェネティックな調節因子が広範囲のゲノム領域に結合するという事実によるものと考えられます。したがって、ゲノム領域ごとにより多くのタンパク質がMSに利用できます。エピジェネティックな調節因子は、がんなどの難病に対する薬剤の重要な標的としてますます認識されているため、enChIPはエピジェネティックな薬物標的の同定に役立つツールとなるでしょう。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
gBlock合成サービス	Life Technologies	GeneArt
gBlock合成サービス	IDT(Integrated DNA Technologies)	gBlocks Gene Fragments
pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2	Addgene	51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
TAL合成サービス	Life Technologies GeneArt	Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3×FLAG-dCas9 / pMXs-puro	Addgene	51240
3回;FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3回;FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3回;FLAG-dCas9/pMXs-neo	Addgene	51260
抗FLAG M2 Ab	Sigma-Aldrich	F1804
FITC-conjugated anti-FLAG M2	Sigma-Aldrich	F4049
DMEM medium for SILAC	Life Technologies	89985	その他の培地はLife Technologiesから購入できます
Dialyzed FBS for SILAC	Life Technologies	89986
L-リジン-2HCl SILAC	ライフテクノロジー	89987	ライトミディアム用
L-アルギニン-HCl SILAC	ライフテクノロジー	ズ 89989	ライトミディアム用
L-リジン-2HCl、13C6 サイラック	ライフテクノロジー	89988	ヘビーミディアム用
L-アルギニン-HCl、13C6、15N4 サイラック	ライフテクノロジー	89990	ヘビーミディアム用
コンプリート、ミニ、EDTAフリー	ロシュ・ダイアグノスティック	4693159
超音波ディスラプター UD-201	タカラトミー セイコー
ChIP DNA Clean &濃縮器	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gene	311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		MS分析用nanoLC-MS/MSシステムのコンポーネント
nanoLC	Advance, Michrom Bioresources		MS分析用nanoLC-MS/MSシステムのコンポーネント
HTC-PALオートサンプラー	CTC Analytics		MS分析用nanoLC-MS/MSシステムのコンポーネント