Method Article

Imaging-とフローサイトメトリーベースのセル位置の解析と3Dメラノーマスフェロイドにおける細胞周期

DOI:

10.3791/53486

⸱

December 28th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Centenary Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3The University of Queensland Diamantina Institute, Translational Research Institute, The University of Queensland, 4Department of Dermatology, Royal Prince Alfred Hospital, 5Discipline of Dermatology, University of Sydney

In This Article

Summary

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蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)と画像解析またはフローサイトメトリーを使用した2つの補完的な方法について説明し、3Dスフェロイドの内側のG1停止領域と外側の増殖領域の細胞を特定し、単離します。

Abstract

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3次元(3D)腫瘍スフェロイドは、従来の2次元(2D)細胞培養と比較して、生体内の腫瘍微小環境のより正確なモデルとして癌研究に利用されています。スフェロイドモデルは、細胞間相互作用、低酸素症と栄養不足、薬物浸透の影響を模倣することができます。このモデルの特徴の一つは、G1停止細胞のリングに囲まれた壊死性コアの発達であり、スフェロイドの外層に増殖する細胞があります。がん分野で興味深いのは、スフェロイドのさまざまな領域が薬物療法や遺伝子操作、環境操作にどのように反応するかです。ここでは、蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)システムの使用、および市販のソフトウェアを使用したサイトメトリーおよび画像解析を使用して、メラノーマスフェロイド内の細胞周期状態に対する細胞の細胞周期状態を特徴付ける方法について説明します。これらの方法は、腫瘍スフェロイドのさまざまなサブ領域における細胞周期の状態、遺伝子/タンパク質の発現、または細胞生存率の変化を経時的に、さまざまな条件下で追跡するために使用できます。

Introduction

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多3Dスフェロイドが数十年のための腫瘍モデルとして知られている、しかし、それは彼らが多くの固形癌のためのin vitroモデルとして、より一般的に使用されるようになったことはごく最近です。彼らはますます複雑、高価で時間のかかる生体内モデルで 、シンプルで低コストの2D単層モデル1-6との間の中間のような高スループットの薬物発見スクリーニングにおいて使用されています。 2D培養における研究は、多くの場合、 生体内で複製することができません。癌の多くの種類の回転楕円体モデルは、増殖特性、薬剤感受性、薬剤の浸透、細胞-細胞相互作用、固形腫瘍6-11 においてインビボで見られる酸素や栄養素および壊死の開発の制限された利用可能性を模倣することができます。スフェロイドは、回転楕円体7の周囲に壊死性コア、コアを取り囲む逮捕静止またはG1領域、および増殖細胞を開発しています。これらの領域の開発細胞密度、増殖速度および回転楕円体12の大きさに応じて変えることができます。これらの異なるサブ領域で見られる細胞の異質性は、癌治療抵抗13,14に寄与し得ると仮定されています。したがって、これらの領域内の細胞を分析する能力は、個別の腫瘍薬物応答を理解するために重要です。

緑（あざみグリーン- AG）は、細胞周期15....

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Protocol

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1. FUCCI伝達および細胞培養

  1. FUCCI伝達
    1. 安定以前に7に記載されているように同時形質導入レンチウイルスを使用してFUCCIはmKO2-hCdt1（30〜120）を構築し、MAG-hGem（1-100）15を発現する細胞株を作成します。
      注：FUCCIシステムは、現在市販されています。
    2. 単一細胞選別によって明るい蛍光を有するサブクローンを生成します。以前に7,16に記載されているように 96ウェルプレートに蛍光活性化細胞選別によってAGおよびKO（黄色）の両方に陽性ソート単一細胞。
  2. メラノーマ細胞培養
    1. 文化C8161ヒトメラノーマ細胞は、以前に7,17を説明しました。

2. 3Dスフェロイドの形成（以前に3,9を説明したように）

  1. アガロースプレートの準備
    1. ハンクス平衡塩溶液（HBSS）またはリン酸buffere 100mlの1.5％アガロース（または希寒天）を溶解旋回で3~5分間電子レンジで煮沸することによってDの生理食塩水（PBS）。アガロースが完全に溶解していることを確認します。
    2. すぐにマルチチャンネルピペットを使用して、平底96ウェル組織培養プレートにウ....

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Results

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腫瘍スフェロイドを生成するいくつかの方法は、このプロトコルは、細胞は、寒天またはアガロース3,7,9上で培養された非接着性成長法を使用して、存在する。 図1は、寒天上の3日後、C8161メラノーマ回転楕円体の一例を示す図です。 C8161スフェロイドは500の直径との定期的なサイズのスフェロイド形成 - 600μmで3日後（= 565、SD = 19、n = 3の平均値）。スフェロイドを形成する他のメラノーマ細胞株が含まれます：WM793、WM983C、WM983B、WM164、1205lu（この細胞株を用いて形成されたスフェロイドが不規則であり、密度の低い19）。

3Dスフェロイドモデル内の個々の細胞の細胞周期を可視化するために、C8161黒色腫細胞はFUCCIシステム7,15で形質導入しました。原因（アガロースの3日後に直径1mmとC8161のためのコラーゲンで24時間成長まで）スフェロイドのサイズが大きいため、切片は、回転楕円体の中心に細胞を可視化するための最良の選択肢です.......

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Discussion

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半自動画像解析は、回転楕円体の内側G1逮捕領域を同定し、そして外層の増殖。この方法は、これらの異なる領域で（免疫蛍光により）、細胞周期が、マーカー発現しないだけの変化を識別するために、光学部を使用して、ライブスフェロイドに、または一定の回転楕円体のセクションで使用され、細胞死、または細胞の形態であってもよいです。異なる回転楕円体領域内の細胞の運動性も定量化することができる - 細胞追跡画像解析ステップと一緒にライブ共焦点タイムラプスイメージングが追加された場合。画像解析には重要では高品質Z-切片の共焦点画像は、高解像度画像は、細胞のより良好な同定を可能にする、得られることです。画像解析の一つの制限は、核があまりに密集している場合、または赤色および緑色強度のあまり変化があった場合に正しくすべてのセルを見つけることができないことです。 （G1初期における）FUCCI陰性細胞は、この画像解析法、赤のみ（G1）で発見することができません黄色の（初期のS期）と緑（S / G2 / M）。ここで説明する画像ベースの分析法のもう一つの欠点は、アカウントにスフェロイドのフル3Dの性質を取らないということです。 Volocityソフトウェアは、zスタック.......

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Disclosures

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パーキンエルマーは出版費用を負担しました。

Acknowledgements

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技術支援を提供してくださったDanae SharpさんとSheena Daignaultさんに感謝します。FUCCIコンストラクトを提供してくださった理化学研究所の宮脇淳先生、細胞株を提供してくださったフィラデルフィアのウィスター研究所のMeenhard Herlyn博士とPatricia Braffordさん、センテナリー研究所のイメージング&フローサイトメトリー施設の素晴らしい技術サポートに感謝いたします。Volocityソフトウェアの技術サポートを提供してくださったChris Johnson氏とAndrew Barlow博士に感謝します。N.K.H.は、オーストラリアのメラノーマ・皮膚がん研究所のキャメロン・フェローです。K.A.B.は、ニューサウスウェールズ州がん研究所(13/ECF/1-39)のフェローです。W.W.は、ニューサウスウェールズ州がん研究所(11/CDF/3-39)のフェローです。この研究は、プロジェクト助成金RG 09-08およびRG 13-06(Cancer Council New South Wales)、570778および1051996(Priority-driven cooperative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation)、08/RFG/1-27(Cancer Institute New South Wales)、およびAPP1003637およびAPP1084893(National ....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
アガロース低融点Life Technologies16520-050の切片化用
 シグマA5431
スフェロイド用アガローフィッシャーサイエンティフィックBP1356-100スフェロイドを作るために
0.05% トリプシン/EDTAライフテクノロジーズ 25300-054
HBSSライフテクノロジーズ 14175-103
10% ホルマリンシグマHT5014-1CS注意:有害で腐食性があります。個人用保護具を使用する、 息の煙ではありません(煙の食器棚で開きます)。
IRLife TechnologiesL10119
ビブラトームTechnical Products International, Inc
コールチャーカップサーモフィッシャーサイエンティフィックSIE936スフェロイド切片用鋳型
血球計算盤SigmaZ359629
96ウェル組織培養プレートInvitroFAL353072
コラゲナーゼSigmaC5138 
共焦点顕微鏡ライカTCS SP5
フローサイトメーター アナライザーベクトン・ディキンソンLSRFortessa
volocityパーキンエルマーイメージングソフトウェア
flowjoTree スターフローサイトメトリーソフトウェア
バキュームグリースシグマZ273554
封入剤ベクター研究所H1000
FUCCI(商業コンストラクト)Life TechnologiesP36238一過性トランスフェクションのみ
細胞ストレーナー 70 μmIn VitroFAL352350
丸底 5 ml チューブ (滅菌)In VitroFAL352003
丸底 5 ml チューブ (非滅菌)In VitroFAL352008
貴族寒天スを作るため

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
  2. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Health....

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Tags

3D Melanoma SpheroidsCell Cycle AnalysisFlow CytometryFUCCI SystemConfocal ImagingImage AnalysisCell Position TrackingSpheroid SectioningNecrotic CoreProliferating Cells

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