COSMICと細胞の薬剤-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング（小分子の架橋は、クロマチンを分離するために）

サマリー

ゲノム標的分子の直接の標的を同定することは、主要な課題です。 DNA結合分子はゲノムを従事する方法を理解するために、我々は、クロマチン（COSMIC）を単離するための小分子の架橋に依存する方法を開発しました。

要約

ゲノムは、最も効果的な化学療法剤のいくつかの標的であるが、これらの薬剤の多くは、用量を制限する毒性および多くの有害な副作用をもたらすDNA配列特異性を欠いています。配列特異的な小分子でゲノムをターゲットに増加し、治療指数、より少ないオフターゲット効果を有する分子を可能にすることができる。N -methylpyrrole / N -methylimidazoleポリアミドは合理的に絶妙な精度で特定のDNA配列を標的とするように設計することができる分子です。そして、最も自然な転写因子とは異なり、ポリアミドは、親和性の損失なしにメチル化及びchromatinized DNAに結合することができます。ポリアミドの配列特異性が広く、同族サイトの識別（CSI）で、伝統的な生化学的および生物物理学的ア ​​プローチを用いてインビトロで研究されているが、細胞内のゲノム標的に結合するポリアミドの研究では、とらえどころのないまま。ここでは、方法、イゾラへの小分子の架橋を報告テクロマチン（COSMIC）が、それは、ゲノム全体のポリアミド結合部位を特定します。 COSMICは、クロマチン免疫沈降（チップ）と同様であるが、2つの重要な点で異なる：（1）光架橋剤は、結合事象ポリアミドの選択的、時間的に制御された取り込みを可能にするために用いられ、（2）ビオチン親和性ハンドルがポリアミドを精製するために使用され非共有結合しているDNAを減少させる半変性条件下-DNA複合体。 COSMICは、ポリアミドおよび他のゲノム標的の化学療法薬のゲノムワイドな結合事象を明らかにするために使用することができる一般的な戦略です。

概要

人体内の各セルを作るための情報は、DNAにコードされています。その情報を選択的に使用することは、細胞の運命を支配します。転写因子（TFS）は、ゲノム中の遺伝子の特定のサブセットを表現するために、特定のDNA配列に結合するタンパク質であり、TFの誤動作を発達障害、癌、および糖尿病を含む、疾患の広い配列の発現に連結されています^。1,2私たちは、選択的ゲノムに結合し、遺伝子調節ネットワークを調節することができる分子の開発に興味を持っていました。

ポリアミドは、N個の -methylpyrroleで構成され、Nライバル天然の転写因子^。3-6これらの分子は、DNAの副溝内の特定の配列に結合特異性および親和性を有するDNAを標的とすることができる分子を-methylimidazole合理的に設計されています^{。4,5,7 -11}ポリアミドは、両方の抑制に用いられ、特定のグラムの発現を活性化されていますエン^。4,12-19また興味深い^20-24抗ウイルス及び抗がん^12,13,25-30特性を有しています。ポリアミドの1つの魅力的な特徴は^、31,32メチル化とヒストンタンパク質^9,10,33に巻き付けているDNA配列にアクセスする能力です。

プロトコル

生きた細胞内の1架橋

1. 〜2.5×10の⁷ H1細胞、または他の培養細胞で始まります。
   注：H1細胞のこの数は、5〜10 cmのディッシュ（約40％の集密度）に相当します。
2. 多能性幹細胞をサポートする表面上にコーティングされた皿上E8培地中で細胞を成長させる（材料リストを参照）、および5％CO ₂の加湿雰囲気中、37℃でそれらをインキュベートします。収穫細胞は酵素的に（材料リストを参照してください）​​。注：H1細胞は、90％の密集度を超えないようにしてください。密集度は、H1細胞の自発的な分化を誘導します。 、細胞をカウントし、細胞の余分な10 cmディッシュに成長し、セクション1.8から1.10に記載されているように、酵素的に細胞を持ち上げ、そして血球計数器でそれらをカウントします。
   1. チェンらに記載されているようにE8培養培地を準備します^。54
3. ポリアミドを追加する前に、真空トラップに取り付けたパスツールピペットで過ごし培養培地を除去します。などで新鮮な培地を追加erologicalピペットピペットディスペンサー（10 cmディッシュあたり8ミリリットル）。
   注：細胞を破壊を避けるために、皿の側にメディアを追加します。この時点から以降早期の光架橋を避けるために、光から細胞を保護します。
4. 直接各皿の....

結果

不均一なゲノム断片化と他の変数を説明するために、精製されたDNAは常にインプットDNAの基準に対して正規化する必要があります。関心対象の遺伝子座に特異的なプライマーを使用することができます。また、陰性対照として、分子が結合すると予想されていない遺伝子座を分析するために有用です。我々は、365 nmの光（ 図2）の照射によりポリアミド占有で> 100倍の増加を参照してください。

濃縮されたDNAはまた、次世代シークエンシングによって分析することができます。 ChIPのDNAが用意されているようなDNAは、（例えば、市販サンプルプレップキットで、材料リストを参照してください）と同じ方法で配列決定のために用意されています。でも次世代シーケンシングで、我々はまだ我々はポリアミドが拘束されることを期待するところの遺伝子座でDNAの濃縮を確認するために、定量PCRを使用しています。一度、配列決定、生DNAは、ゲノムに整列され、密度トレースは、チップ・配列データを分析するように設計された同一のソフトウェア（ 図3）

ディスカッション

従来のChIPの主な課題の1つは、適切な抗体の同定です。ChIPは抗体の品質に大きく依存し、ほとんどの市販抗体はChIPに受け入れられません。実際、Encyclopedia of DNA Elements(ENCODE)コンソーシアムは、市販の抗体のうちChIPアッセイに適しているのはわずか20%であることを発見しました。⁵⁰ COSMICでは、抗体はストレプトアビジンに置き換わります。ポリアミドはビオチンで官能基化されているため、抗体の代わりにストレプトアビジンを使用してポリアミド-DNA架橋を捕捉します。ビオチンとストレプトアビジンの間の相互作用は、自然界で知られている最も強いものの1つであり、抗体とそのリガンドとの相互作用の1000〜100万倍強力です。⁶² この堅牢な相互作用とストレプトアビジンの固有の安定性を利用して、捕捉されたポリアミド-DNA架橋を抗体を変性させる過酷な洗浄にさらします。これらの洗浄により、COSMICのバックグラウンド信号が減少します。さらに、ヒストンなどのビオチン化タンパク質は、これらの過酷な条件下で DNA から展開および解離します。^63,64

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)	任意のソース
、ベンザミジン	、任意のソース
ペプスタチン	、任意のソース
、プロテイナーゼK	、任意のソース
、Dynabeads MyOne、ストレプトアビジン、C1	、ライフテクノロジー	、65001
PBS、pH 7.4	ライフテクノロジー	ズ、10010-023	他のソースは、
StemPro Accutase細胞解離試薬	ライフテクノロジー	A1110501
QIAquick PCR精製キット	Qiagen	28104	我々は、成功したDNAカラムの他のメーカーを試している使用することができます。
TruSeq ChIPサンプル調製キット	イルミナ	IP-202-1012	このキットは、次世代シーケンシング用のCOSMIC DNAの調製に使用できます
マトリゲル基底膜マトリックス	BDバイオサイエンス	356231	H1 ESCの
pH紙	任意のソース
、琥珀色、微量遠心チューブ	、任意のソース
微量遠心チューブを成長させるために、プレートをコーティングするために使用されます	任意のソース
、パイレックスフィルター	、任意のソース		、パイレックス、ベーキングディッシュ、適切な
qPCRマスターミックス	任意のソース
RNase	、任意のソース
、HCl(6 N)、	任意のソース
、10cm、組織培養ディッシュ	、任意のソース
、血清学的ピペット	、任意のソース
パスツールピペット、	任意のソース
、ピペットチップ	、任意のソース
、15mlコニカルチューブ、	任意のソース
遠心分離機	、任意のソース
遠心分離機	、任意のソース
ニューテーター	、任意のソース
磁気セパレーションラック	任意のソース
UVソース	CalSun	B001BH0A1A	他のUVソースを使用できますが、架橋時間は経験的に最適化する必要があります
Misonix Sonicator	Qsonica	S4000 with 431C1カップホー	他のソニケーターを使用できますが、超音波処理条件は経験的に最適化する必要があります
加湿CO2インキュベーター	任意のソース
真空出口付き生物学的安全キャビネット、	任意のソース

、ズ、、、、、、マイクロン