用いた機能クローニングアフリカツメガエル卵母細胞発現システム

Summary

私たちは、有能な外胚葉で応答を誘発することができる遺伝子の発現クローニングのためのXenopus卵子と動物キャップシステムについて説明し、そのような遺伝子のその後の解析技術について議論します。このシステムは、幅広い遺伝子産物の機能同定に役立ちます。

Abstract

胚の誘導に関与する遺伝子の同定は、多くの課題を提起します。いくつか例を挙げると、目的の分泌された分子は存在量が少ないか、分泌されずにシグナル伝達細胞につながれているかもしれません、または結合パートナーや上流の調節分子の存在を必要とするかもしれません。したがって、コンピテントエクトダームにおける初期のレンズ誘導応答を誘発できる遺伝子産物の探索において、パラクリン因子またはジャクスタクリン因子、ならびに転写タンパク質またはその他の調節タンパク質の同定を可能にする発現クローニングシステムを利用しました。mRNAのプールをXenopus卵子に注入し、応答組織を卵子に直接配置して共培養しました。レンズコンピテント動物キャップ外胚葉における初期のレンズプラコードマーカーfoxe3の発現を誘発する能力に基づいて、神経プレートステージのcDNAライブラリーからldb1の機能的クローニングを行った後、mRNA発現パターンを特徴付け、ldb1の過剰発現またはノックダウン後の発生進行を分析しました.このシステムは、コンピテント組織における機能的応答を用いてインデューサーまたはその上流の調節分子の同定が求められる非常に幅広い状況に適しています。

Introduction

機能喪失を通じて関心のある遺伝子を特定するための前方遺伝学的^{アプローチは、発生}における複雑なパターン形成イベントを理解するための不可欠な部分です。 ますます拡大するシステムや研究者^3-5が利用できる強力なリバースジェネティック技術と組み合わせることで、パスウェイで重要な機能的役割を果たす遺伝子を特定し、その機能を細胞レベルで、また他の遺伝子産物と相互作用して解明することが可能になりました。 過去に多くの重要な発見をもたらした目的の遺伝子を機能的に同定するための1つのアプローチは、発現クローニング^6,7です。

私たちの最近の目的⁸は、脊椎動物の水晶体誘導プロセスの最初のステップが原腸期の早い段階で発生することが実証されているため、初期の水晶体誘導因子を特定することでした。 そのために、Xenopus胚の一過性のレンズコンピテント⁹動物キャップ外胚葉(ステージ11-11.5¹⁰)を誘導の応答組織として使用し、ステージVIのXenopus卵子を誘導因子の産生源として使用しました。

次のプロトコルは、Smith and Harland^6,7の発現クローニングとsib選択プロトコルに基づいており、他の^11-13でも成功裏に使用されています。 私たちの卵子発現システム(LustigとKirschnerによる誘導因子の産生に最初に利用された¹⁴)では、直接的または間接的に卵子に動物キャップ外胚葉のレンズ誘導応答を誘発する因子を産生させることができる注入された転写産物のプールが選択され、同定されます。 このシステムは、分泌誘導分子を直接発現するのに有用であるため(卵子注入されたINHBB mRNAは、中胚葉コンピテント動物外胚葉8で中胚葉誘導^{を引き起こします)、当初}、スクリーニング手順は主にパラクリン因子の同定に役立つと期待していました。 しかし、私たちのスクリーニングで核因子を同定した(ldb1⁸)ことから、転写または翻訳調節因子、miRNA、補因子、ジャクスタクリン因子など、さまざまな分子を同定するためにこのシステムを使用できることが明らかになりました。

Protocol

全ての実験手順は、バージニア州制度動物実験委員会の大学によって承認されました。

注： 図1は、実験手順の概略を示しています。

卵母細胞の調製

1. 事前プライムX.卵母細胞の単離の前に妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG）の150 Uと女性約1週間をアフリカツメガエル 。 29 G針と1ccの無菌注射器と背側リンパ嚢に1 mlの150 U / mLのPMSGを注入。
2. 卵母細胞注入と卵母細胞アニマルキャップアッセイのためのソリューションを準備します。
   1. 準備のCa ⁺⁺ / ^Mg ++を含まないOR 2（OR2-）：82のNaCl、2.5mMのKClを、1.5mMの_の Na 2 HPO _4、50mMのHEPES pHは7.2。
   2. OR2-プラス1 mMの_CaCl 2および1mM MgCl 2：OR 2 _を準備します。
   3. 60％リーボビッツL15、0.4 mg / mlのBSA、100μg/ mlのゲンタマイシン、pHが7.8：OCMを準備します。
   4. 前1X MBS削減する：88のNaCl、1 mMの塩化カリウムを、0.7 mMの_CaCl 2を、1mMの_MgSO 4を、5 mMのHEPES（pHは7.8）、2.5 mMの炭酸水素ナトリウム_3。
   5. 1X MBSで3％フィコールを準備します。
   6. 110のNaCl、2 mMの塩化カリウム、1mMのカルシウム（NO _3）2、1mMの_MgSO 4を、0.1mMのEDTA、1 mMの_炭酸水素ナトリウム、2 mMののNa ₃ PO _4、pHが7.4：1×NAMを準備します。
3. 用溶液中カエルを配置することによって、0.1×MBSにおけるエチル3-アミノベンゾエートメタンスルホン酸塩（MS222）（第1 Lの0.1×MBSで希釈し、次いで、10 mlの95％エタノール中に0.3グラムのMS222を溶解）の0.03％溶液中で雌を麻酔10から15分、または応答しなくなるまで。
   1. その麻酔を確認することは、（不完全麻酔下のカエルは、手足を動かしたり身体を裏返し）応答しない保証するために、その背面に麻酔をかけたカエルを回して完了です。
4. 外科鉗子で卵巣組織を単離し、メスの刃で肌と体壁を通って腹部切開を行うことによって、卵巣断片を単離はさみ。 OR2-に卵巣の断片を置きます。 24ミリメートル湾曲した針に3-0絹縫合糸で体​​壁を閉じて、同じ縫合で別々に皮膚を閉じます。水に1グラム/ Lの水族館塩中の女性の回復を許可します。
5. （ - 20卵母細胞10）個、新鮮なOR2-への転送細かい鉗子を使用して、小さなに卵巣組織を引き裂きます。
6. 、1時間シェーカー上で穏やかに攪拌新鮮なコラゲナーゼに転送し、さらに1時間攪拌することによりOR2-で2.0 mg / mlのコラゲナーゼAのDefolliculate卵巣断片。
7. ウォッシュは、より小さな卵母細胞を捨てるOR2での[Ca ⁺⁺ / ^Mg ++を^を含む ] 10回、卵母細胞。
8. OCMで卵母細胞を2回洗浄し、新鮮なOCMへの転送。目視検査時に大きさによって第6期の卵母細胞を分離し、未成熟な（小さい）卵母細胞を捨てる：第6期の卵母細胞は、動物半球であっても色素沈着と未成熟卵母細胞よりも大きく、直径が約1.2〜1.4ミリメートルです。
9. 20℃のI - 18に卵母細胞を維持nは注射前にOCM。注：アガロースでコーティングされたペトリ皿を皿に卵母細胞の付着を最小限にするために使用されてもよいです。

図書館転写物の2注入

1. （例えば、神経板ステージ14 ^10）開発の適切な段階で抽出したRNAを用いた指向性cDNAライブラリー^{15を準備します。} cDNAライブラリーを購入するか、以下の4つのステップで概要につき市販のキットを使用して1つを構築します。
   1. ポリ（A）+ RNA（材料の表を参照）を濃縮するために製品を使用し、製造業者の指示に従って、約5μgのmRNAを分離してください。注：cDNAライブラリーを作製するために使用される転写物が（所望の組織の顕微解剖以下のような神経板など）の誘導組織に限定することができる、または特定の段階で胚全体からのものであってもよいです。
   2. 製造業者の指示に従って、市販のキットを用いてcDNAを生成します。
   3. vectoに約20 ngのcDNAをを連結rは、市販のキットまたは他の適当なベクターに含まれています。適当なプラスミドベクターは、5 'βグロビンおよび3のポリ（A）配列（PCS2 +、pTnT、pCS105）などのmRNA安定性のための配列を含みます。
   4. 熱ショック形質転換のために、供給業者の推奨するプロトコルを使用して有能な細菌細胞へのライゲーションを変換します。
      注：また、オープンリーディングフレーム（ORFeome）クローンの回収は、商業的に入手可能であり、注射のための転写物を生成するために使用することができます。
2. 10 ⁴複雑^{（4月10日から5月10}日までの総複雑さ）に10 ³のプラスミドの10のプールを準備します。万コロニー各 - これは、千と10のプレートを表しています。
   1. 37℃で18時間、および7ミリリットルLBのガラススプレッダーと穏やかな圧力によってそれぞれのコロニーを収集 - プレートライブラリ文化10 15 cmのLB-アンピシリンプレート上に、12を成長させます
   2. 0.5ミリリットルからグリセロールストックを準備します（-20＆で0.2 mlの滅菌グリセロールおよびストアに追加＃730; C）、製造者の指示に従って、標準的な市販のDNAミニプレップキットを用いてDNAを調製するために、残りの6.5ミリリットルを使用しています。
3. 1.5時間-酵素1 37℃で^{16を消化し} ​​、適切な制限付き- （2.0μgの1.0）プールされたプラスミドDNAを線形化。使用されるRNAポリメラーゼキットの仕様に水にエタノール沈殿および再懸濁が続くフェノール/クロロホルム抽出と直線化DNAを単離します。製造業者の指示以下の市販のRNAポリメラーゼキットとセンスRNAを合成します。
4. 約20μmの直径の（ガラスキャピラリーチューブと針プラーを使用して）マイクロインジェクション用の針を準備します。較正済み接眼マイクロメータとの複合顕微鏡の針の先端を測定します。注：ニードルプラーの設定が細かい鉗子で壊れたときに所望のチップサイズを生成するように細かいチップで針を製造するために経験的に決定されなければなりません。
5. 準備（に粘土を押してくださいマイクロインジェクションの間に所定の位置に卵母細胞を保持するための平行溝と皿の底に均一な層）粘土で内張り35×10ミリメートルペトリ皿。炎で先端に融合したショッピングモールプローブまたはパスツールピペットで溝を作ります。粘土の代替として、エラストマー金型¹⁷とのくぼみを作 ​​るアガロース料理を準備します。粘土が並ぶ料理の行で1X MBSで3％フィコール（約2ミリリットル）に広口径ピペットで転送卵母細胞。
6. マイクロインジェクターを用いて、1 ngの/ NL RNAと針を記入し、（卵母細胞の細胞質のアップ描画防ぐために）わずかな正の圧力を生成するためにバランスを調整します。
7. 赤道域で約20 NL RNAを卵母細胞に注入します。その後、フィコール-MBSに残る1X MBSに優しく転送するために注入した卵母細胞のための1時間を許可します。アニマルキャップアッセイの前に20℃で24時間 - 8インキュベートします。

3.アニマルキャップアッセイ

1. 3/4倍NAMを準備し、細かい鉗子、ヘアループ、湾曲したカバースリップフラグメント、粘土ライニングDISを得ます卵母細胞を保持するカップ状のくぼみとHES。 （ - 2ミリメートル×2 - 約1〜4 mm）の小さな断片にカバーガラスを離れて壊すことにより、湾曲したカバースリップフラグメントを作成し、エッジポリッシュまで炎を通過すると垂れ、湾曲した部分を生成します。
2. Xを肥やしますアフリカツメガエルの卵のin vitroまたは自然交配やステージ原腸する培養による¹⁸ -前段階でソートするに0.1X MBS中（10室温で11時間後に受精を）。 ¹⁰の胚-ミッド原腸胚（11.5ステージ11）を収集。
3. NAM 3/4倍で、ハーフ、フル約ペトリ皿に胚を移します。細かい鉗子の二組を使用して、原腸胚から受精（卵黄）膜を除去します。
4. 粘土が並ぶ皿でNAM（約2ミリリットル）3/4倍に転送する卵母細胞との溝は上述したように、個々の胚に対応するために、感想を生産、粘土の個々の印象に固定化します。
5. 移植胚粘土が並ぶお料理にとgオフアニマルキャップをカット微細鉗子の二組を使用してastrulae。だけではなく、赤道組織¹⁸アニマルキャップ外胚葉を分離するように注意してください。
6. 卵母細胞を接触させることをアニマルキャップの内面と各卵母細胞の動物半球上のアニマルキャップを置きます。 8時間以上 - 6のための卵母細胞の表面に露出した内部層に開いたままにすることができます（カバースリップの連絡先などの動物のキャップを粘土を外胚葉を平坦化、湾曲したガラスカバースリップフラグメントを塗布し、ガラスに下向きの圧力を加えることによって組換え体を一緒にホールド）。
   注意：別の方法として、その内面を上に向けて、粘土のインデントにアニマルキャップを配置し、キャップに卵母細胞を置きます。粘土の小さな拡張子の組換え体を固定します。
7. 20℃での培養制御胚がアッセイに所望の段階に達するまで。
8. カバーガラス/粘土を除去し、鉗子とヘアループと外胚葉を単離することにより、組換えセパレート。
9. MEMFAで1時間（3.8％のため、外胚葉断片を修正MEM中のホルムアルデヒド[0.1 M MOPS pHは7.4、2 mMのEGTA、および1mMのMgSO _4]）。
10. -20℃でエタノールとストアにMEMFAからの断片（およびコントロール胚）を転送します。

in situハイブリダイゼーション （ISH） ではにより外胚葉における応答の解析4。

1. ISHのためのソリューションを準備します。
   1. 準備し、1×PBS：0.01Mのリン酸緩衝生理食塩水、塩化ナトリウム0.138 M、pH7.4の
   2. 準備をPBS-Tweenで（PTW）：1×PBS、0.1％のTween-20
   3. 2％BSA、2％のポリビニルピロリドン、2％フィコール：100×デンハルト溶液を調製します
   4. ハイブリダイゼーションバッファーを準備します：50％ホルムアミド、5×SSC、1 mg / mlのトルラ酵母RNA、1 / mlのヘパリン、1×デンハルト液、0.1％Tween-20を、0.1％CHAPS、10mMのEDTA、DEPC-H _{2 O}を
   5. 100 mMのマレイン酸、150mMのNaCl、pHが7.5：マレイン酸バッファー（MAB）を準備
   6. 準備MAB +ブロック：MAB、2％ブロッキング試薬（溶解する60℃の熱）
   7. 準備アルカリホスファターゼ（AP）緩衝液：100mMトリスpHは9.5、50のMgCl _2、100mMのNaCl、0.1％トゥイーン、のdH _{2 O}
2. RNAプローブを準備します。
   1. 1.5mlチューブ（50μlの反応）に追加、商業RNAポリメラーゼキットを使用し、ミックスのNTP掘る：25.5μlのDEPC-H _{2 O、10μl}の5X転写バッファー、2.5μlの10倍DIG-NTPミックス、5μlの100 mMのDTT、2μLのRNAsin、2μlの直線化DNAテンプレート（〜を1μg/μl）を、3μlのRNAポリメラーゼと90分間37℃でインキュベートします。
   2. 2μlのRNAポリメラーゼを加え、60分間37℃でインキュベートします。
   3. 1％アガロースゲル上での反応の2μLを確認してください。
   4. 1μlのRQ1 RNaseフリーのDNaseを追加し、20分間37℃でインキュベートします。
   5. 50μlのDEPC-H _{2 O、25μl}の10 M酢酸アンモニウムおよび313μlのエタノールを添加することによって、プローブを沈殿させます。 -20℃で一晩（O / N）で保存し、その後20分間13,800×gで遠心分離することによりRNAを回収します。簡単にスピンし、500μlの75％エタノールで洗浄し、削除しますエタノール、空気乾燥さペレットを許します。 50μlの_DEPC-H 2 Oを追加
   6. 〜0.5μgの/μlの最終濃度になるようにハイブリダイゼーションバッファーを追加します。
3. ハイブリダイゼーションのために組織を準備します。特に断りのない限り、説明した各溶液交換（約4ml）でトップにバイアルを埋めます。
   1. 水平ロッカー上、10分ごとに75％エタノール/ PTW、その後、50％エタノール/ PTWにバイアルおよび移植胚からエタノールを除去します。
   2. ロッカーに各5分間PTWで3回洗浄します。
   3. 10μgのPTWで/μlのプロテ​​イナーゼK処理に移します。垂直ロックチューブ15分。
   4. 垂直ロックチューブ - 0.1 MトリエタノールアミンpHは7.8で10分間2回ずつ洗浄します。
   5. チューブに12.5μLに無水酢酸を加え、垂直方向に5分を揺すります。 5分間の追加の12.5μlの無水酢酸で繰り返します。
   6. ロッカーに縦PTW 5分で洗浄します。
   7. ロッカーに4％パラホルムアルデヒド20分でREFIX。ヒートハイブリダイゼーションバッファー60℃に。
   8. ロッカーに各5分間PTWで3回洗浄します。
   9. 各チューブからPTWのすべてが、〜1ミリリットルを削除し、250μlのHybをバッファに追加します。穏やかに混合する管を渦巻きます。垂直ロックチューブ5分。
   10. 60℃Hybをバッファー（0.5ml）で交換し、60℃10分で静かに攪拌します。新鮮なHybを緩衝液で交換して、60℃2〜4時間で攪拌します。
   11. 60℃（3分）にヒートプローブ（Hybをバッファー中の0.5μg/μlので1ミリリットル）。 Hybを緩衝液を除去し、チューブにプローブを追加します。 O / Nは、60℃で穏やかに撹拌します。
4. 抗体のための組織を準備します。
   1. 暖かいHybをバッファと、2×SSC + 0.1％Tween-20を60℃にソリューションを提供しています。
   2. Hybをバッファ（ - 3X再利用2、-20℃のプローブを保存）とプローブ溶液を交換してください。 10分間60℃で洗浄します。
   3. 2X SSC-Tween中60℃（20分攪拌しながら、それぞれ）で3回洗浄します。
   4. 0.2X SSC-Tween中60℃（20分攪拌しながら、それぞれ）で3回洗浄します。
   5. ロッカーにそれぞれ水平に15分間（RT）MABで2回洗浄します。
   6. 1ミリリットルのMAB +ブロックを追加します。ロッカーの上に縦に2時間を洗ってください。
   7. 1ミリリットルのMAB + 1 / 2,000の抗ジゴキシゲニンAPを含むブロックに転送します。 4 CO / Nで垂直方向にロック。
5. 色試薬のために組織を準備します。
   1. MABと抗体溶液を交換してください。ロッカーにそれぞれ水平にMAB 5分間で3回洗浄します。
   2. ロッカーにそれぞれ水平にMAB 1時間で3回洗浄します。
   3. ロッカー上の各水平APバッファ10分間で2回洗浄します。
   4. 複数のウェルプラスチックトレーに組織を転送し、APのバッファを削除し、BMパープル試薬（〜1ミリリットル）を追加します。反応は、O / Nに暗い5分で進行させます。
   5. 適切な染色が達成されると、PTWのバイアルに組織を移します。ロッカー上PTWで2回各々10分間洗浄します。
   6. ロッカーの4 CO / Nでブアン液中で固定してください。
   7. RTで3 70％エタノール/ 30％PTW洗浄でブアンを洗浄します。トンを続行Oイメージ落射顕微鏡に取り付けられたカメラを使用してキャプチャ、漂白に必要な¹⁸の場合。

5.兄妹の選択およびクローニング

1. 最も高い活性（外胚葉組織の最大の応答）とプールを選択します。
2. （上記のプロトコルにセクション2を使用して）前のステップからのコロニーを、最も高い活性を有するプールのグリセロールストックを（適切な密度にLBで希釈）と、10分の1程度で新たに10のプレートをプレートアウト滴定します。
3. 活動が単一コロニーにトレースされるまで、プールのサイズを減らします。
4. ベクター標準プライマーを用いてDNA配列を得ます。

Results

mRNAの発現に応答して、卵母細胞に注入し、応答動物キャップ組織は、in situハイブリダイゼーション （ 図2および表1）によってOTX2の発現についてアッセイした。OTX2、レンズプラコードを介して神経管閉鎖の推定レンズ外胚葉（PLE）で表され肥厚^19。 OTX2も PLE外側前方神経外胚葉ならびに非神経外胚葉ヘッドで表現されているのでしかし、それは神経とplacodal応答の両方に関連付けられています。 foxe3は神経板からPLEで発現されるのでfoxe3の使用は、発現クローニングの目的に、より具体的なアプローチを可能にしたレンズコンピテント動物キャップ外胚葉におけるレンズ誘導応答を産生することができる遺伝子産物のためのライブラリーをスクリーニングします隣接placodal領域に存在するが、neuroectoder欠席ステージとレンズの小胞形成²⁰を通して、メートル。 （

Discussion

コンピテント外胚葉における応答を誘導することができる遺伝子の機能的クローニングのためにここに記載された方法は、遺伝子産物の広い範囲を同定することができます。この方法は、発現クローニング技術と組織誘導のアッセイを組み合わせることにより、過去の作品を発展させ。我々は、RNA注入後、直接的または間接的に、誘導因子の産生の供給源としてアフリカツメガエル卵母細胞の代謝経路を利用します。これ、cDNAライブラリーまたはクローンの他のコレクションから生成された転写物の発現を用いて目的^6,7の遺伝子をクローニングするための確立された方法の使用と組み合わせて、胚に関わる新たな関心の遺伝子を同定するために求める人々のための貴重なアプローチを提供誘導。新しい遺伝子の機能同定にこの方法の広範な適用は、エキサイティングな新しい逆遺伝学的アプローチに便利な補完であり、また高THRを使用して同定された試験転写物を機能的にするために使用することができます（例えば、RNA-seqのような）oughput法^21。

コントロールは、キャップアッセイで使用した...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 抗体	開発研究 ハイブリドーマバンク	12/101	モノクローナル抗体 筋肉組織検出用
20x SSC バッファー	Sigma	S6639	ISH
水酢酸	Sigma	A6404	ISH
Anti-Dig-AP	ロシュ	11093274910 ISH
Aurum プラスミド ミニキット	Bio-Rad	732-6400	プラスミドDNA精製
試薬	ロシュ	11096176001	ISH
BM パープル	ロシュ	11442074001	ISH
Boekel ハイブリダイゼーション オーブン	フィッシャー サイエンティフィック	13-245-121	ISH
ブインの溶液	用 シグマ	HT10132	ISH
BSA	シグマ	A9647	OCM
CHAPS	シグマ	C3023	ISHの場合
コラゲナーゼ A	ロシュ	10103578001	卵母細胞の脱毛
システイン	シグマ	C121800	デゼリー胚
DEPC-H2O	フィッシャーサイエンティフィック	BP5611	ISH
Dig-RNA ラベリングミックス	ロシュ	11277073910	ISH プローブ用
デュモン #5 鉗子	ワールド プレシジョン	500233	ビテリン エンベロープ用除去
エチル 3-アミノ安息香酸	シグマ	A5040	MS222 麻酔薬
フィコール PM 400	シグマ	F4375	注射剤用
ホルムアミド	シグマ	F9037	用
ゲンタマイシン硫酸塩	シグマ	G1914	OCM
用 ガラス毛細血管	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ	4878	3.5インチ 長さ、I,D、0.530 mm
ガラスサンプルバイアル	フィッシャーサイエンティフィック	06-408B	ISH
用 ヘアループ			パスツールピペットに貼られた髪 組織操作用
ヘパリンナトリウム塩	シグマ	H4784	ISH
インジェクター用 ナノリットル 2010	ワールド精密機器	ナノリットル 2010	マイクロプロセッサ制御マイクロインジェクター
インスタントオーシャン	カロライナ	972433	水族館 カエルの回復のための塩
IRBG XGC Xenopus 検証済み 全長カム cDNA	ソース バイオサイエンス	989_IRBG	cDNA ライブラリ
LB寒天プレート、100&マイクロ;g/ml アンピシリン	テクノバ	L5004	150 mm 注入済み LB-Amp プレート シブ選択用
LB ルリアブロス	テクノバ	L8650	LB シブのコロニーを採取するためのプレート選択と培養液の希釈
磁気 mRNA アイソキット	ニューイングランド バイオラボ	S1550S	ポリ(A)濃縮 RNA の単離用
マレイン酸	シグマ	M0375	ISH用
手動マイクロフィルマイクロマニピュレーター	ワールド精密機器	M3310R	手動マイクロマニピュレーター
ニューティングミキサー	フィッシャーサイエンティフィック	22-363-152	ISH用ロッカー
パーモプラスト	ナスコ	SB33495M	注射および解剖皿用粘土
リン酸緩衝生理食塩水		P5368	ISH
PMSG	用シグマ	G4877	卵子の発達を刺激する
ポリビニルピロリドン	ΣPVP40	ISH
プログラマブルプーラー	ワールド精密機器用	PUL-1000	マイクロピペット ニードルプーラー
プロテイナーゼ K	Σ	P6556	ISH
pTnT用 ベクター	Promega	L5610	cDNA ライブラリ構築
リボプローブ コンビネーションシステム	Promega	P1450	in vitro転写
上付き文字 全長cDNAライブラリ構築キット	Life Technologies	18248013	キット cDNAライブラリ構築用
縫合糸、3-0シルク	フィッシャーサイエンティフィック	19-037-516	卵子除去後のための縫合糸と針
トルラ RNA	Sigma	R3629	ISH用
トリエタノールアミン		ΣT1502	用
Tween 20	Sigma	P9416	for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cells for transformation of cDNA図書館