同時2光子インビボイメージング

Summary

このビデオは、Thy1-GFPトランスジェニックラインのin vivo 2光子顕微鏡を使用して、マウス後脾皮質のニューロンの慢性イメージングを可能にする開頭術の手順を示しています。このアプローチは、mCherry発現アデノ随伴ウイルスの背側海馬への注射と組み合わされます。これらの技術により、RSCの経験依存性の構造可塑性を長期的にモニタリングすることができます。

Abstract

このビデオは、Thy1-GFPトランスジェニックマウス系統のin vivo二光子顕微鏡を用いて、マウス後脾皮質（RSC）のニューロンの慢性イメージングを可能にする開頭術の手順を示しています。このアプローチは、行動操作とin vivoでのニューロン形態の変化との相関関係を調査する可能性を生み出します。

頭蓋窓移植術は、バレルフィールドのような容易にアクセスできる皮質領域のみに限定されると考えられていました。私たちのアプローチにより、高度に血管新生されたRSCのニューロンを可視化することができます。RSCは、これまでin vivoの2光子イメージングでは問題視されてきた空間記憶を担う脳回路の重要な要素です。

RSC上の頭蓋窓移植は、mCherry発現組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV^mCherry）の背側海馬への注射と組み合わされます。発現したmCherryは、海馬からRSCまでの軸索突起に広がり、皮質のシナプス前軸索ブートンとシナプス後樹状突起スパインの両方の変化を可視化することができます。

この技術は、RSCにおける経験依存的な構造可塑性の長期的なモニタリングを可能にします。

Introduction

二光子顕微鏡は、生きている動物を振る舞うで脳活動の観察に革命をもたらしました。 1990年に導入されて以来、それはすぐに人気を博し、現在は生体内 ^1,2 における脳活動の多くの側面の検討に向けた最も興味深く、革新的なアプローチの一つとして実装されています。これらのアプリケーションは、（ 例えば 、カルシウムレベルのインジケータまたは即時初期遺伝子の発現を使用して）ニューロンの活性化を血流測定を含み、神経細胞の形態。研究室の増加数は、in vivo脳イメージングのための新しい標準として科学の世界全体の技術を実装し、2光子顕微鏡を使用しています。

標準的なアプローチは、マウス脳³のバレルまたは視覚皮質の上に頭蓋窓（カバーガラスで覆われた頭蓋内の丸い穴）の移植を必要とします。次に、実験プロトコルに応じて、畝SEは、時間^4,5を介して脳の活動と神経細胞の形態の変化を監視することができ、可視化と行動訓練の一連のセッションを受けます。両方の場合において、開頭術は縫合糸を交差させず、頭頂骨に影響を与えます。主に技術の主な欠点は、バレルまたは視覚野など簡単にアクセス皮質への限られたアプリケーションであると考えられています。他の地域以上の頭蓋窓の移植は、過度の出血および/または空間的障害のために、多くの困難をもたらします。

Protocol

以下に記載されている全ての実験手順は実験生物学のNencki研究所、ポーランド科学アカデミーの地方倫理委員会によって承認されました。

注：関連したビデオ内のシーンの一部が加速されます。速度係数は、これらのシーンで示されています。

1.手術の準備

1. オートクレーブ内の液体や綿棒のためのすべてのツール、ガラス容器を滅菌します。不要手袋を使用してください。手術台、定位フレーム、70％エタノールを持つすべての周辺エリアを清掃してください。すべての滅菌機器の滅菌のスペースを作成するために、無菌手術用パッドを使用してください。小片にゲルフォームをカットし、滅菌生理食塩水でそれらを浸します。
   注意：実験動物の管理と使用に関する指針によれば、エタノールが滅菌剤でも高レベルの消毒剤でもありません。それだけで、以前に滅菌表面上の洗浄/脱脂剤として使用されるべきです。
2. 目に動物を入れて電子導入室/分2 Lを5％と酸素流にイソフルランレベルを設定します。この手順は、約3分を取る必要があります。
3. 誘導室から動物を取ります。動物が完全に鎮静剤を投与されていることを確認するために、尾や足指ピンチを使用してください。
4. 正確なトリマーを使用すると、目まで（耳の間の）頭の後ろから髪を剃ります。
5. 定位フレームに動物を置き、耳棒で頭を安定させます。
....

Results

Thy1-GFPレポーターマウスにおけるニューロンのサブセットにおけるGFPの発現皮質樹状突起とRSCの地方軸索投射のin vivoイメージングにできます。 図1Aは、目に見える複数のGFP陽性樹状突起の画像のスタックの最大投影を示しています。細胞体は、動脈によって隠されている。 図1Bは、図1Aに示された樹状分岐の単一の平面ズーム画像（デジタルズーム3倍）を示しています。樹状形態（棘、糸状仮足）の詳細がはっきりと見えます。 GFPチャネルは、バンドパス放射フィルタ500〜550ナノメートルを使用して取得されます。

背側海馬にrAAV2を/ 1 ^mCherryを注入は、RSCで終端海馬軸索とシナプス終末の可視化を可能にします。これらの端子は、mCherryをチャネル（バンドパス放射フィルタ570から610 nm）を検出すること.......

Discussion

現在の論文では、頭蓋窓からRSCにおけるシナプス入力とシナプス後ターゲットのin vivoイメージングでの同時2光子のためのプロトコルを提示します。移植手順は、いくつかの重要なステップで構成されています。まず、動物が深く麻酔し、定位フレームに固定され、その後、RSC以上の頭蓋骨は、マークされた円形の線に沿ってドリルと円形の骨が除去されて薄くされます。出血が停止した後、rAAV2を1 / ^{mCherryを海馬}に注入され、そしてカバーガラスは、掘削領域の上の頭蓋骨に固定されています。最後に、固定バーは、ヘッドに固定され、動物は、48時間回収チャンバ内に配置されています。ウイルス発現のために必要な約2〜3週間後に、RSCを可視化することができます。イメージングプロトコルは、以下のステップを含みます。まず、動物を顕微鏡下で麻酔し、固定されています。フォーカスは、その後、広視野顕微鏡を使用して設定され、システムがSWIであります二光子モードにtchedおよび利息（GFPとmCherryを）のチャネルが可視化されます。

提示された技術は.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drug
イソフルラン	バクスター	AErrane 8DG9623	5-2% 術前
イソフルラン	Baxter	AErrane 8DG9623	手術中 1.5-2%
デキサメタゾン	スキャン獣医	デキサゾン 2mg/ml	0.2 mg/kg バイト
ル	バイエル	2.50%	5 mg/kg 皮下
トルフェジン	ベトキノール	4%	4 mg/kg 皮下投与
ブトミドール	リヒター ファーマ	10 mg/ml	2 mg/kg 皮下
カルプロフェン	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg 皮下投与
リドカイン	ジェルファ	ノカイナム	局所投与
リドカイン	ジェルファ	20 mg/g	局所投与
Surgery
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental;REF MS0005
眼軟膏	Dedra	Lubrithal	局所
CA 接着剤	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental アクリル	SpofaDental	Duracryl Plus
Stereotaxic Frame	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard装置	HSE-64-0720	3ミリメートル直径
歯科用ドリル	Sigmed	Keystone KVet
固定バー	カスタムメイド	N / A	M2またはM3ネジナットは、
鉗子	Renex	PN-7B-SA
マイクロはさみ	ファルコン	BM.183.180
剖顕微鏡	KOZO	XTL6445T
Imaging
Holderフレーム	カスタムメイド	N/A
二光子顕微鏡	ツァイス	直立型 Axio Examiner Z1	レーザーユニット:コヒーレントカメレオン 690-1040nm 光パラメトリック発振器 1050-1300nm。対物レンズ:EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1およびLD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0。検出:ZeissバンドパスフィルターBP 500-550(GFP)とBP 570-610(mCherry)をビームスプリッターで560nmで分離し、2つのGaAsP光検出器に結合
ReagentCaMK
	プロモーターの制御下で蛍光タンパク質mCherryを発現するK.Deisseroth組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)	からの贈り物