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方法論記事

同時2光子

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DOI：

10.3791/53528

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2016年3月13日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Neuroscience, Nencki Institute of Experimental Biology, 2Department of Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, 3Neurobiology Centre, Nencki Institute of Experimental Biology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このビデオは、Thy1-GFPトランスジェニックラインのin vivo 2光子顕微鏡を使用して、マウス後脾皮質のニューロンの慢性イメージングを可能にする開頭術の手順を示しています。このアプローチは、mCherry発現アデノ随伴ウイルスの背側海馬への注射と組み合わされます。これらの技術により、RSCの経験依存性の構造可塑性を長期的にモニタリングすることができます。

要約

このビデオは、Thy1-GFPトランスジェニックマウス系統のin vivo二光子顕微鏡を用いて、マウス後脾皮質（RSC）のニューロンの慢性イメージングを可能にする開頭術の手順を示しています。このアプローチは、行動操作とin vivoでのニューロン形態の変化との相関関係を調査する可能性を生み出します。

頭蓋窓移植術は、バレルフィールドのような容易にアクセスできる皮質領域のみに限定されると考えられていました。私たちのアプローチにより、高度に血管新生されたRSCのニューロンを可視化することができます。RSCは、これまでin vivoの2光子イメージングでは問題視されてきた空間記憶を担う脳回路の重要な要素です。

RSC上の頭蓋窓移植は、mCherry発現組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVmCherry）の背側海馬への注射と組み合わされます。発現したmCherryは、海馬からRSCまでの軸索突起に広がり、皮質のシナプス前軸索ブートンとシナプス後樹状突起スパインの両方の変化を可視化することができます。

この技術は、RSCにおける経験依存的な構造可塑性の長期的なモニタリングを可能にします。

概要

二光子顕微鏡は、生きている動物を振る舞うで脳活動の観察に革命をもたらしました。 1990年に導入されて以来、それはすぐに人気を博し、現在は生体内 1,2 における脳活動の多くの側面の検討に向けた最も興味深く、革新的なアプローチの一つとして実装されています。これらのアプリケーションは、（ 例えば 、カルシウムレベルのインジケータまたは即時初期遺伝子の発現を使用して）ニューロンの活性化を血流測定を含み、神経細胞の形態。研究室の増加数は、in vivo脳イメージングのための新しい標準として科学の世界全体の技術を実装し、2光子顕微鏡を使用しています。

標準的なアプローチは、マウス脳3のバレルまたは視覚皮質の上に頭蓋窓（カバーガラスで覆われた頭蓋内の丸い穴）の移植を必要とします。次に、実験プロトコルに応じて、畝SEは、時間4,5を介して脳の活動と神経細胞の形態の変化を監視することができ、可視化と行動訓練の一連のセッションを受けます。両方の場合において、開頭術は縫合糸を交差させず、頭頂骨に影響を与えます。主に技術の主な欠点は、バレルまたは視覚野など簡単にアクセス皮質への限られたアプリケーションであると考えられています。他の地域以上の頭蓋窓の移植は、過度の出血および/または空間的障害のために、多くの困難をもたらします。

本論文では、 生体顕微鏡 6 の 2光子のための目的の別の可能な領域として脳梁膨大後部皮質（RSC）上記の頭蓋窓の移植を提案します。 RSCは、空間記憶の形成に関与する脳回路の重要な要素です。解剖学的に、RSCは、皮質、海馬、および視床領域7を接続する神経ネットワークの一部です。それはそのような空間学習や絶滅だけでなく、空間ナビゲーション6として振る舞い、の範囲で深く関わっ。

我々は、THY1プロモーター下の緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するトランスジェニックマウス系統を使用し、ニューロンの形態学的変化を視覚化するためです。これらのマウスでは、GFPは、二光子顕微鏡法8を用いて、皮質の軸索と樹状突起の明確な可視化を可能にする脳内のニューロンの約10％で発現されます。我々が提案するもう1つの技術革新は、RSCに突出した脳のより深い構造にニューロン特異的CaMKIIのプロモーター 9の下に赤色蛍光タンパク質（mCherryを）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス血清型2/1（rAAV2を/ 1）の注射であります、海馬など。 Thy1-GFPマウスの海馬におけるrAAV2を/ 1 mCherryをの発現がhippocampo-corticaの前およびシナプス後要素の同時可視化を可能にしますlは10をシナプス。 mCherryをののrAAV駆動発現は、軸索の端末で十分なレベルに到達するために、タンパク質のための2〜3週間を必要とします。この期間は、開頭手術からの回復のために必要な通常の時間と一致しています。

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プロトコル

以下に記載されている全ての実験手順は実験生物学のNencki研究所、ポーランド科学アカデミーの地方倫理委員会によって承認されました。

注：関連したビデオ内のシーンの一部が加速されます。速度係数は、これらのシーンで示されています。

1.手術の準備

  1. オートクレーブ内の液体や綿棒のためのすべてのツール、ガラス容器を滅菌します。不要手袋を使用してください。手術台、定位フレーム、70％エタノールを持つすべての周辺エリアを清掃してください。すべての滅菌機器の滅菌のスペースを作成するために、無菌手術用パッドを使用してください。小片にゲルフォームをカットし、滅菌生理食塩水でそれらを浸します。
    注意：実験動物の管理と使用に関する指針によれば、エタノールが滅菌剤でも高レベルの消毒剤でもありません。それだけで、以前に滅菌表面上の洗浄/脱脂剤として使用されるべきです。
  2. 目に動物を入れて電子導入室/分2 Lを5％と酸素流にイソフルランレベルを設定します。この手順は、約3分を取る必要があります。
  3. 誘導室から動物を取ります。動物が完全に鎮静剤を投与されていることを確認するために、尾や足指ピンチを使用してください。
  4. 正確なトリマーを使用すると、目まで（耳の間の）頭の後ろから髪を剃ります。
  5. 定位フレームに動物を置き、耳棒で頭を安定させます。
  6. 1.5から2パーセントイソフルランおよび0.3リットル/分の酸素に麻酔のレベルを設定します。
  7. 眼軟膏を適用します。
  8. それぞれ、炎症、疼痛および感染を防止するためにTolfedine（4ミリグラム/ kg）を、Butomidor（2ミリグラム/ kg）およびバイトリル（5ミリグラム/ kg）を動物の皮下に注入します。
  9. 脳が腫れ防止するために、デキサメタゾン（0.2ミリグラム/ kg）を筋肉内に動物を注入します。
    注：デキサメタゾンを皮下に注入するか、腹腔内に、筋肉の損傷を防止することができます。
  10. Sを使用して、肌をきれいに70％エタノールに続いてベタジンとterile綿棒。
  11. 手袋を変更し、70％エタノールでそれらをスプレー。
    注意：滅菌野に触れないでください使い捨て手袋を使用している間。唯一の無菌手術器具や滅菌綿棒の先端で動物をタッチします。

2.頭蓋窓手術

  1. 鉗子で皮膚を持ち上げ、マイクロはさみを使用して、斜めの目の間のフロントポイントへのその後のヘッドのベースに沿って水平に皮膚を切開し、。皮弁を削除します。
  2. 過度の出血や痛みを防ぐために骨膜に滅菌綿棒でリドカイン軟膏を適用します。
  3. 骨膜を除去するために滅菌綿棒やメスを使用してください。滅菌綿棒で頭蓋骨を乾燥させます。
  4. 滅菌針を使用すると、それらを固定化すると、歯科用セメントとの接触を防止するために、皮膚の縁に密なシアノアクリレート接着剤を適用します。接着剤が乾燥するのを待ちます。
  5. トン以上の滅菌3ミリメートルのカバーガラスを置きラムダ縫合の前方彼は頭蓋骨。 RSCでカバースリップを中心座標：AP、ブレグマ-2.8; MLは、滅菌針で頭蓋骨の表面を引っ掻くことにより、0マークカバースリップのエッジをブレグマ。 70％エタノールで滅菌容器に戻しカバーガラスを置きます。
  6. 直径3mmの円の輪郭を小径バリでの高速歯科用ドリルを使用してください。滅菌生理食塩水に浸漬綿棒で骨ほこりから掘削現場を清掃してください。時折出血を止めると骨をきれいにするためにゲルフォームと綿棒を使用してください。
  7. 掘削の間で静かに骨の円をタッチし、その機動性をチェックすることにより、微細な鉗子で骨の厚さを確認してください。骨が縫合糸の領域に厚くなることに注意してください。骨円はモバイルで、骨のだけでも、薄層は円周上に放置した場合の掘削を停止します。生理食塩水を浸した綿棒で、残りのすべての骨ダストの運用フィールドを清掃してください。
  8. 掘削CIRをカバーし、掘削領域に滅菌生理食塩水をドロップCLE。慎重に微細な鉗子で骨円を詮索してから慎重にしっかりと上向きにそれを持ち上げて骨を取り除きます。硬膜への損傷を防ぐためにそれを持ち上げながら骨円を歪曲しないように注意してください。
  9. 静かに出血を止める助けるために硬膜に滅菌生理食塩水に浸したゲルフォームを適用します。すべての出血が完全に停止するまで待ちます。慎重に凝固プロセスを乱さないゲルフォームを削除します。
    注：この時点で出血深遠であることを証明するかもしれないので、縫合領域は、高度に血管新生です。出血が完全に停止するのに十分な時間を待つことが不可欠です。氷の上に置くことによって冷却された生理食塩水に浸したゲルフォームを維持するために有用です。

3.ウイルス注入

  1. 定位塔に注入ポンプを取り付け、コントローラを接続します。
  2. 注射器に35G針を挿入します。それを滅菌するためにエタノールで注射器を10回フラッシュし、滅菌生理食塩水で10倍電子の痕跡を除去しますthanol。シリンジから気泡を除去。ポンプ内に注射器を挿入します。
    注：他の消毒剤を使用することを検討してください。
  3. （10 12 PFUが推奨されます）rAAV2を/ 1 mCherryを製剤の単回投与を解凍し、氷上で保管してください。ウイルス溶液で注射器を埋めます。
  4. ブレグマに針を中心にした後、静かに次の座標を用いて海馬に挿入：AP -2、ML +/- 1.0、DVを-1。これらの座標は開頭の​​縁の近くに配置されます。組織が安定するのを5分間待ちます。
  5. 50 NL / minの速度でrAAV2を/ 1 mCherryを溶液の0.7μLを注入します。ウイルスが完全に吸着するために10分を待ちます。そっと針を取り除きます。出血が発生した場合、ゲルフォームで吸い取ります。反対側のサイトで繰り返します。

4.頭蓋窓の移植

  1. 掘削サークルフレームにおける硬膜の上に滅菌、乾燥したカバーガラスを置きます。 FORCとカバーガラスを保持しますEPSは優しく硬膜を平らにし、カバーガラスをもたらすために「頭蓋骨の表面に近い縁。
    注：カバーガラスは、血餅と出血が再開を妨害することが可能です。その場合は、カバーガラスを持ち上げアルコールに置き、乾燥と2.9のステップに戻ります。
  2. 滅菌針を使用すると、頭蓋骨にそれらを添付するカバーガラスの縁に緻密なシアノアクリレート接着剤を適用します。接着剤が乾燥するのを待ちます。
  3. 頭蓋骨の前部に固定バー（M2ナットまたはカスタムメイドのデザイン）を配置します。バーの端の上にシアノアクリレート接着剤を適用します。接着剤が乾燥するのを待ちます。
    1. イメージングセッション中に頭蓋窓の水平位置を可能にする位置に固定バーを配置します。窓からできるだけ遠くに配置します。それは窓に近づきすぎに配置されている場合は、カスタムメイドのホルダーとそれを連結バーとネジは、撮像プロセス中に目的のための障害物としてもたらす可能性があります。
  4. は、歯科用アクリルを準備し、ガラスの周りの頭蓋骨の表面にそれを適用します。ウィンドウの周りにクレーター状の形状を形成することが有用です。それは水の目的にイメージングのために、後に適用される水の空洞を作成します。
  5. 頭蓋窓周りのクレーターを強化、操作領域、皮膚のエッジ、固定バーの残りの部分をカバーする、歯科用アクリルでキャップを作成します。歯科用セメントが硬化するのを待ちます。
  6. 定位フレームから動物を削除し、回収室に入れて。
  7. 生理機能を観察しながら、動物が手術から回復するのを待ちます。
  8. 48時間術後鎮痛（カルプロフェン、10mg / kgの）および抗生物質治療（バイトリル、5ミリグラム/キログラム）を適用します。

5.イメージング

  1. チタンを起動：サファイアレーザー、パワーアップ顕微鏡。この実験で使用されるシステムは、二光子レーザー、OPOシステムとデュアルのGaAsP PMTを備えています。
  2. inducに動物を入れてションチャンバーと麻酔を誘導します。
  3. 誘導チャンバーから動物を削除し、顕微鏡下でガス麻酔マスクに配置します。 0.3 L /分、百分の1.5から2にイソフルラン濃度に酸素流量を減少させます。
  4. M2ネジ（または他のカスタム・システム）を使用してカスタム顕微鏡フレームに動物を修正しました。頭蓋窓を水平に。
    注記：特定のカスタムフレームは、より良い結果（改善されたヘッド安定性、慢性実験の間、複数のセッションに一定位置決め）を与えるが、顕微鏡メーカーの頭部固定システムを使用することが可能です。
  5. 脳梁膨大後部皮質の側面の一方に広視野顕微鏡の設定と低倍対物センタービューを使用し、カバーガラス表面上に焦点を当てます。
  6. クレーター状のアクリルウェルに水の液滴を適用します。長距離水浸対物レンズに切り替えます。水のメニスカス詐欺まで、頭蓋窓に向かって目的を移動試料と目的をnects。
  7. 2光子の設定に切り替え、最低のズームを使用して、底部に試料上部のスキャンを開始。硬膜の交差は高い非特異的シグナルのグレアとして表示されます。
  8. ダイナミックレンジ全体をカバーするために、蛍光細胞からの信号強度に応じて両方のチャンネル（GFPとmCherryを）における顕微鏡取得設定を調整します。
  9. （他の細胞から分離された樹状突起付き）適切なニューロンを発見した後、最も低いズームと5ミクロンのz距離を持つ唯一のGFPフィルターセットを使用して初期スキャンを実行します。
  10. スキャンされたスタックの最大投影を取得し、注釈（反転色を使用）のためにそれを印刷してください。
  11. 画像に対して所望の形態学的な詳細を可能にする値にズームを設定します。画像ガイドとして最大投影を使用して、GFPとmCherryをチャンネル全体の樹状ツリー。

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結果

Thy1-GFPレポーターマウスにおけるニューロンのサブセットにおけるGFPの発現皮質樹状突起とRSCの地方軸索投射のin vivoイメージングにできます。 図1Aは、目に見える複数のGFP陽性樹状突起の画像のスタックの最大投影を示しています。細胞体は、動脈によって隠されている。 図1Bは、図1Aに示された樹状分岐の単一の平面ズーム画像（デジタルズーム3倍）を示しています。樹状形態（棘、糸状仮足）の詳細がはっきりと見えます。 GFPチャネルは、バンドパス放射フィルタ500〜550ナノメートルを使用して取得されます。

背側海馬にrAAV2を/ 1 mCherryを注入は、RSCで終端海馬軸索とシナプス終末の可視化を可能にします。これらの端子は、mCherryをチャネル（バンドパス放射フィルタ570から610 nm）を検出すること...

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ディスカッション

現在の論文では、頭蓋窓からRSCにおけるシナプス入力とシナプス後ターゲットのin vivoイメージングでの同時2光子のためのプロトコルを提示します。移植手順は、いくつかの重要なステップで構成されています。まず、動物が深く麻酔し、定位フレームに固定され、その後、RSC以上の頭蓋骨は、マークされた円形の線に沿ってドリルと円形の骨が除去されて薄くされます。出血が停止した後、rAAV2を1 / mCherryを海馬に注入され、そしてカバーガラスは、掘削領域の上の頭蓋骨に固定されています。最後に、固定バーは、ヘッドに固定され、動物は、48時間回収チャンバ内に配置されています。ウイルス発現のために必要な約2〜3週間後に、RSCを可視化することができます。イメージングプロトコルは、以下のステップを含みます。まず、動物を顕微鏡下で麻酔し、固定されています。フォーカスは、その後、広視野顕微鏡を使用して設定され、システムがSWIであります二光子モードにtchedおよび利息（GFPとmCherryを）のチャネルが可視化されます。

提示された技術は...

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開示事項

著者（KL、MR、KR）は、この記事で使用ホルダーフレームのための特許出願中（PL410001）の権限を持っています。

謝辞

著者は、撮影の支援のための音声録音、図面のためのM. Borczyk、ウイルス産生のためのA.Trąbczyńska、遺伝子型決定のためのM.ZiókowskaとA. MirgosのためのM. Steczkowskiに感謝したいと思います。 KRはK. DeisserothからのCaMKプロモーターの制御下で蛍光タンパク質mCherryをを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の寄贈を認めています。このプロジェクトは、欧州連合（EU）によって賄わCEPTインフラストラクチャを使用して、組織の構造と機能、神経生物学、実験生物学のNencki研究所のセンターの動物モデルおよび研究室の研究室の中核施設で行われた - 欧州地域開発基金の中を2007-2013のためのオペレーションプログラム「革新的な経済」。この作品は、国立科学センターからの助成金によってサポートされていました：ソナタビス2012/05 / E / NZ4 / 0299​​6、ハルモニア2013/08 / M / NZ3 / 00861、Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 KRとソナタビス2014年に/ 14 / E / NZ4 / 00172 RCへ

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Drug
イソフルランバクスターAErrane 8DG96235-2% 術前
イソフルランBaxterAErrane 8DG9623手術中 1.5-2%
デキサメタゾンスキャン獣医デキサゾン 2mg/ml0.2 mg/kg バイト
ルバイエル2.50%5 mg/kg 皮下
トルフェジンベトキノール4%4 mg/kg 皮下投与
ブトミドールリヒター ファーマ10 mg/ml2 mg/kg 皮下
カルプロフェンKRKA-PolskaRycarfa 50mg/ml10 mg/kg 皮下投与
リドカインジェルファノカイナム局所投与
リドカインジェルファ20 mg/g局所投与
Surgery
GelfoamEthiconSpongostan dental;REF MS0005
眼軟膏DedraLubrithal局所
CA 接着剤Pelikan Daniel20G Huste
Dental アクリルSpofaDentalDuracryl Plus
Stereotaxic FrameStoelting51500D
Tool
CoverglassHarvard装置HSE-64-07203ミリメートル直径
歯科用ドリルSigmedKeystone KVet
固定バーカスタムメイドN / AM2またはM3ネジナットは、
鉗子RenexPN-7B-SA
マイクロはさみファルコンBM.183.180
剖顕微鏡KOZOXTL6445T
Imaging
HolderフレームカスタムメイドN/A
二光子顕微鏡ツァイス直立型 Axio Examiner Z1レーザーユニット:コヒーレントカメレオン 690-1040nm 光パラメトリック発振器 1050-1300nm。対物レンズ:EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1およびLD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0。検出:ZeissバンドパスフィルターBP 500-550(GFP)とBP 570-610(mCherry)をビームスプリッターで560nmで分離し、2つのGaAsP光検出器に結合
ReagentCaMK
プロモーターの制御下で蛍光タンパク質mCherryを発現するK.Deisseroth組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)からの贈り物
リ投与 リグ解。

参考文献

  1. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
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