方法論記事

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

DOI：

10.3791/53529

⸱

2016年1月6日

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1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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ホスホイノシチドは、その相対的存在量急速に様々な刺激に応答して変化するシグナル伝達脂質ています。この記事では、代謝的に抽出し、脱アシル化に続いて3 H- ミオ -イノシトールの 、で細胞を標識することによりホスホイノシチドの豊かさを測定する方法について説明します。抽出グリセロinositidesは次に高速液体クロマトグラフィーにより分離し、フローシンチレーションによって定量化されます。

要約

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ホスホイノシチド(PtdInsPs)は、特定のエフェクターを動員し、分子の同一性と機能を持つオルガネラを付与する重要なシグナル伝達脂質です。7つのPtdInsPはそれぞれ、その分布と存在量が異なり、特定のキナーゼとホスファターゼによって厳密に制御されています。PtdInsPの存在量は、さまざまなシグナル伝達イベントや調節機構の擾乱に応じて急激に変化する可能性があります。これらのイベントがどのようにPtdInsPの量の変化につながり、その結果としての影響をもたらすかを理解するには、シグナル伝達イベントの前後、または制御状態と異常状態の間のPtdInsPレベルを定量化することが重要です。しかし、存在量と類似性が低いため、各PtdInsPの相対的な量を定量化することは困難な場合があります。この記事では、PtdInsPに組み込まれている3つのH-ミオイノシトールで細胞を代謝的に標識することにより、PtdInsPレベルを定量化する方法について説明します。その後、リン脂質を沈殿させ、脱アシル化します。得られた可溶性の3H-グリセロ-イノシチドをさらに抽出し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分離し、フローシンチレーションによって検出します。酵母サンプルの標識と処理、およびHPLCとフローシンチレータの機器のセットアップについて詳しく説明します。アシル鎖含量に関する構造情報は失われますが、この分析法は感度が高く、細胞内の7つのPtdInsPすべてを同時に定量するように最適化できます。

概要

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ホスホイノシチド(PtdInsPs)は、シグナル伝達、膜輸送、遺伝子発現など、さまざまな細胞機能の調節を助ける重要なシグナル伝達リン脂質であり、細胞分裂、オルガネラ同一性、代謝活性などの高次細胞の振る舞いを調節します1-3。親リン脂質であるホスファチジルイノシトール(PtdIns)のイノシトールヘッドグループの3、4、および/または5位のリン酸化に由来するPtdInsPには7つの種があります。重要なことに、7つのPtdInsPは不均等に分布しており、各PtdInsP種の局所濃度は、それらが異なるタンパク質エフェクターのセットに結合する特定の細胞内部位で増加または減少する可能性があり、これにより、各PtdInsPがその宿主膜の同一性と機能を制御することができます3,4。さらに、各PtdInsPのレベルは、PtdInsPによって生成される信号強度に大きな影響を与える可能性があるため、厳密に制御する必要があります。各PtdInsPの局在とレベルは、各PtdInsPの合成と代謝回転を媒介する多数の脂質キナーゼ、ホスファターゼ、およびホスホリパーゼの標的化と活性に依存します3,4。したがって、PtdInsP調節機構の誤った制御は細胞機能を混乱させ、癌や変性疾患などの疾患につながる可能性があります2,5,6。PtdInsPとその制御機構の役割と機能を完全に理解するために、PtdInsPを追跡および定量するための顕微鏡ベースおよび生化学ベースの技術が開発されました。

多くの場合、PtdInsPsは特定のタンパク質ドメイン7-9を介してタンパク質エフェクターに結合します。これらのタンパク質モジュールは、タンパク質全体とは別に発現した場合、多くの場合、適切なフォールドおよび脂質認識特性を保持します。これにより、特定のPtdInsP結合タンパク質ドメインを緑色蛍光タンパク質(GFP)のような蛍光タンパク質(FP)に融合させることにより、顕微鏡によるPtdInsPの細胞内検出が可能になりました。実際、多くの研究がFP融合PtdInsP結合タンパク質モジュールを使用して、生細胞イメージングによって特定のPtdInsP種の局在と動態を同定しています1,10。例えば、GFPに融合したホスホリパーゼC δ1(PLCδ1)のプレクストリン相同性(PH)ドメインは、原形質膜上のホスファチジルイノシトール-4,5-ビスリン酸[PtdIns(4,5)P2]を特異的に認識しますが、初期エンドソーム抗原1(EEA1)のFYVEドメインのタンデムコピーは、エンドソーム10-13上のホスファチジルイノシトール-3-リン酸(PtdIns3P)を追跡するために使用されています.全体として、顕微鏡法に基づく技術は、PtdInsPの局在とダイナミクスを視覚化するのに最適ですが、PtdInsP結合ドメインが標的PtdInsP分子種以外の他の因子とも相互作用する可能性があることや、FPプローブの細胞質蛍光より下の変化を検出できないことなど、いくつかの注意点があります。

各PtdInsP14-16のレベルを特徴付け、定量化するために、薄層クロマトグラフィー、質量分析、放射性同位元素標識などの生化学的手法も使用することができます。これらの方法では、PtdInsPの細胞レベルを検出するために脂質を単離する必要があります。質量分析は、脂質抽出物からリン脂質を特徴付けるために使用でき、PtdInsPs14,17のアシル鎖組成を決定するために非常に貴重です。しかし、質量分析はほとんどが半定量的であり、同じ分子量のPtdInsP分子種を分離し、同時に定量することは依然として困難です14,17。これに対し、PtdInsPsの放射性同位元素標識とそれに続く高速液体クロマトグラフィー(HPLC)結合フローシンチレーションは、PtdInsPs18の7種すべての分離と同時定量に有用です。強陰イオン交換(SAX)カラムを備えたHPLCを使用すると、分子量、電荷、形状に基づく分離が実現するため、同じ分子量と電荷でも脱アシル化されたPtdInsPs(Gro-InsPs)が分画されます。HPLC溶離液をフローシンチレータに結合すると、元の親グリセロールイノシトール(Gro-Ins)18に対して、各Gro-InsPs分子種について放射性ベースのシグナルピークが生成されます。これは最終的に、細胞内のPtdInsPsの相対レベルに対応します。

PtdInsPの放射性標識とHPLC結合フローシンチレーションは、PtdIns16,19,20の~0.1-0.3%しか構成しないPtdInsPであるホスファチジルイノシトール3,5-ビスリン酸[PtdIns(3,5)P2]の調節と機能を調査するための有用なツールです。PtdIns(3,5)P2の合成は、酵母ではFab1と呼ばれるPtdIns3P 5-キナーゼによって、哺乳類ではPIKfyveによって行われる21。この反応は、酵母ではFig4、哺乳類ではmFig4/Sac3と呼ばれるPtdIns(3,5)P2 5-ホスファターゼによって打ち消されます22-24。興味深いことに、PIKfyve/Fab1とmFig4/Fig4/Sac3はどちらも単一の複合体に存在し、酵母のVac14または哺乳類のmVac14/ArPIKfyveという足場アダプタータンパク質によって制御されています25,26。VAC14欠失酵母細胞では、Fab1は効率的に機能せず、PtdIns(3,5)P2レベル27,28が90%減少します。一方、Atg18は、液胞分裂を制御する可能性のあるPtdIns(3,5)P2エフェクタータンパク質である29。Atg18は、その遺伝子であるATG18の欠失によりPtdIns(3,5)P2レベル29,30が10〜20倍に増加するため、PtdIns(3,5)P2の負の調節因子でもあります。全体として、PtdIns(3,5)P2のレベルの変化は、酵母液胞および哺乳類リソソームの機能に深刻な影響を及ぼし、その結果、膜輸送、ファゴソーム成熟、オートファジーおよびイオン輸送などのプロセスに影響を与える6,19,21,31。

この記事では、野生型、vac14Δ、およびatg18Δ酵母株のPtdIns(3,5)P2の相対レベルを検出するために、酵母中の3H-ミオイノシトールによるPtdInsPの放射性同位体標識のプロセスについて説明します。これを例にとると、個々のPtdInsPの分離に対するHPLCの分離能と、微量の3H-ミオイノシトールを検出するためのフローシンチレーションの感度を示します。また、哺乳類細胞から3つのH標識PtdInsPを標識して分離するための方法論を最適化する方法についても詳しく説明します。これらの細胞は7つのPtdInsP種すべてを持っているため、サンプルはより複雑になる傾向があります。

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プロトコル

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注：テキストは、以下に詳細に酵母でPtdInsPsを測定する方法について説明します。これは、3 H- ミオ -イノシトールの 、脂質を抽出し、脱アシル化及び脱アシル化PtdInsPsを分別し、定量化するためのHPLC溶出プロトコルで標識する酵母細胞のための実験の詳細を提供します。最適化と長いHPLC溶出プロファイルを必要とする哺乳動物細胞におけるPtdInsPsのラベリング、脱アシル化、解像度および定量に注意してください。我々は議論中の側面のいくつかを議論してもこれらの詳細は、他の場所で見つけることができます。全体的に、脂質を抽出しアシル基を除去すると、酵母から水溶性GRO-InsPsを抽出する方法が与えられ、 図1に示されています。

酵母におけるラベル付けとの解析法PtdInsPs 1.プロトコル

  1. 細胞培養および放射性標識
    1. 定数は完全に合成で振とうしながら30℃で酵母株SEY6210 20mlの培養液を成長させます対数期中期または約0.6〜0.7の600 nmの（OD 600）での光学密度のメディア。
      注：これは3 H- ミオ -イノシトールの取り込みに影響を与える可能性があるとして、YPDメディアを使用しないでください。この培養サイズは2-3のHPLCの実行のために十分な材料を提供する必要があります。
    2. 12ミリリットル丸底チューブ中で5分間800×gで遠心分離することによって（OD 600 = 1で1mlの文化が〜1×10 7個の細胞が含まれていることに注意してください）酵母細胞の10〜14 ODの合計をペレット化。イノシトールを含まない培地（IFM）の2mlで再懸濁（IFM組成については表1を参照）。
    3. 遠心分離を繰り返し、メディアを吸引除去します。 IFMの440μlのペレットを再懸濁し、室温で15分間インキュベートします。
    4. 各試料に3 H- ミオ -イノシトール（1μL=1μCiの）の60μlを添加して、振盪しながら1〜3時間、30℃の成長温度でインキュベートします。
      注意：3 H- ミオ -イノシトールのは、放射性メイトであります適切なトレーニングの後に処理されるべきであるリアル。また、3 H含有材料と接触するすべての消耗品が適切に配置されるべきであり、放射性廃棄物として指定されました。
      注：成長温度を変化させることができる限り、全ての株が、同じ温度で成長され比較されるように、必要に応じ。
    5. 9％過塩素酸500μlのを含むマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液（500μl）を転送し、酸200μlのガラスビーズを洗浄しました。反転によって混合し、5分間氷上でインキュベートします。
    6. 10分間最高速度でサンプルをボルテックスし、ガラスビーズを回避するために、ゲルローディングチップを使用して、新しいマイクロ遠心チューブに溶解物を移します。
    7. 4℃で10分間12,000×gで試料をペレット化し、上清を吸引します。
    8. 氷冷100 mMのEDTA、1mlのバス超音波処理によってペレットを再懸濁。以前のように再びペレット化します。
  2. 脱アシル化および抽出
    1. たてのメタノールを2.3ミリリットル、40％のメチルアミンの1.3ミリリットル、1-ブタノールと水の0.80ミリリットルの0.55ミリリットルを組み合わせることにより、脱アシル化試薬5.0mlのを準備します。混合するために反転します。
    2. EDTAを吸引し、50μlの水にペレットを超音波処理します。
    3. 脱アシル化試薬の500μlを添加して、混合する超音波処理。室温で20分間インキュベートします。
    4. ヒートブロック中で53℃で50分間熱脂質。 3時間またはO / Nを介して真空遠心分離によって完全にサンプルを乾燥させます。
      1. 化学トラップは空気が入るの蒸気を防ぐために、真空遠心分離機と真空ポンプとの間に設置されていることを確認します。
    5. 風呂超音波処理によって水300μlのペレットを再懸濁し、室温で20分間インキュベートします。 3時間またはO / Nのための真空遠心分離によりサンプルを乾燥させます。もう一度この手順を繰り返します。
    6. 水450μlのペレットを超音波処理。これは、抽出時の水相です。
    7. たてextractioの10ミリリットルを準備1-ブタノールの8.0 mlの、エチルエーテル、ギ酸エチル0.40 mlの1.6 mlで添加することにより、n個の試薬。混合するために反転します。
    8. 水相に抽出試薬を300μlを追加します。 5分間トップスピードでボルテックス混合物を、2分間、最高速度（18,000 XG）で遠心分離して層を分離します。
    9. トップ有機層、インターフェース、およびペレットを避けながら、新しいマイクロチューブに底部の水層を収集します。新鮮な抽出試薬で二回以上の水性相の抽出を繰り返します。
    10. 完全真空遠心分離によって収集し、水層を乾燥させます。風呂超音波処理によって水50μlにペレットを分散させます。
    11. 6ミリリットルのポリエチレンシンチレーションバイアルにシンチレーション液4mlのに各2μlのサンプルを追加します。開いているウィンドウを使用して、液体シンチレーションにより各サンプルにおける（CPM）でカウント数を決定します。
    12. HPLCの準備が整うまで-20℃でサンプルを保管してください。
  3. の分離HPLCによる3 H-グリセロinositides
    1. 脱気に続いて、ボトル上部0.22μmの真空フィルター、と超純水1Lをフィルタリングすることにより、緩衝液Aを準備します。
    2. 水に、1Mリン酸アンモニウム二塩基（APS、MW 132.06）の1 L溶液を作ることによってバッファBを準備し、リン酸でpHを3.8に調整します。脱気に続いて、ボトル上部0.22μmの真空フィルター、とリン酸アンモニウムをフィルタリングします。
    3. バネ付き250μlの小容量インサートを2ミリリットルバイアルを艤装によって注射バイアルを組み立てます。千万インプレッションをロードし、55μlの総体積のために水を追加します。水55μlのブランクバイアルを準備します。
    4. PTFE /シリコンセプタムを装備し、スクリューキャップ付きバイアルに蓋（バイアルの内側に面した赤側）。ブランクバイアルから始まる、HPLCの自動サンプリングトレイに各バイアルを置きます。
    5. 、バッファの流れを制御し、HPLCと関連ソフトウェアを使用して、バッファおよびコントロールサンプルinjectiを脱ガスに。シンチラント流量を調節するために、オンラインフローシンチレータおよびその関連ソフトウェアを使用して、3 H-減衰信号を監視します。
      1. X 4.6ミリメートル250ミリメートルの寸法のSAX液体クロマトグラフィーカラムを使用し、HPLCに5μmのシリカ樹脂を含みます。汚染物質の注入を防止するために、カラムガードカラムを装い。
      2. フローシンチレータに3 H-互換500μlのフローセルをインストールします。
        注：分画はChemStationソフトウェアによって、または他の市販のHPLCシステムを用いて制御のAgilent 1200無限シリーズHPLCシステムを用いて行うことができます。 HPLCの溶離液の流れシンチレーションは、ローラ・ソフトウェアまたは他の市販の流れシンチレータまたは互換性のあるソフトウェアによって制御β-RAMフローシンチレータで行うことができます。
    6. 100％緩衝液Aと1.0 ml /分の流速で四級ポンプを初期化します
    7. HPLCで平衡プロファイルを設定5分間の1％緩衝液B、5分間の1-100％のB、5分間100％B、5用100-1％のB：緩衝液AおよびBの勾配（この「プロトコル平衡」と呼ぶ ）を制御します分で、20分間、1％B。 400バール、1.0 ml /分の流速、および30分の実行時の圧力限界を設定します。
    8. 緩衝液AおよびBの勾配を制御するために、HPLCで溶出プロフィール（ 図2）を設定し （この「プロトコルA」と呼ぶ ）：5分間1％のB、40分間の1〜20％のB、20〜100％ 10分、5分間100％B、20分100-1％のB、10分間で1％BのB。 400バール、1.0 ml /分の流速、および90分の実行時に圧力限界を設定します。
    9. 2.5ミリリットル/分、8.57秒の滞留時間のシンチレーション液の流速で、60分間実行する（この「プロトコル検出」と呼ぶ ）の流れシンチレータで検出プロトコルを設定します。
    10. プログラムEに続いて「プロトコル平衡 」に水を空白で開始するHPLCで自動注入シーケンス、「プロトコルA」の放射性標識サンプルをACH。準備ができたらシーケンスを初期化します。
    11. ランが平衡プロトコルに入れたまま、と全てのサンプルを測定するためのフローシンチレータのバッチを作成する「プロトコル検出を 。」開始するフローシンチレータをトリガしながら、それぞれの新しい試料の注入は、HPLC の 「プロトコルA」を初期化する」 を検出プロトコル 。 "
    12. すべてのランの完了時、HPLC、カラムをフラッシュし、1.0 ml /分の流速で30分間、100％緩衝液Aを用いてシンチレータを流します。
  4. データ分析
    1. ローラ・ソフトウェアまたはクロマトグラフィースペクトルを定量化することができる任意の他のソフトウェアを使用してください。このセクションで説明する手順は、図3に示されています。
    2. 「ファイル」、「開く」をクリックしてファイルを開いて、各サンプルの生データファイルを選択します。
    3. 「クロマトグラム」タブで、ZO時間分解能を維持しながら、より小さなピーク（約1000カウント[Y軸]）のそれぞれを伸ばすことでOM。必要に応じて、それぞれの個々のピークに拡大します。
    4. 「ROIを追加」ツールを使用して、分析のための各ピークを強調表示します。 18分にGRO-Ins3P、10分で親グロイン、29分とグロインでのGRO-Ins4P 20分で、グロイン（3,5）P 2（4,5：溶出時間によってピークを同定32分で）、P 2。
    5. 「地域・テーブル」タブで、各ピークの「面積（カウント）」を記録します。時間と「終了（MM：SS）」は、各ピークの時間：「（SS mm）の起動」を注意してください。
    6. バックグラウンド除去のために、同じ時間に及ぶピークに隣接する領域を強調表示します。対応するピークからのカウント数を減算します。
    7. （「合計のPtdInsの％」と表記）親グロインに対する各ピークの面積を正規化します。その後、N」として表現（制御条件に対して、各実験条件での各ピークを正規化倍増加）」を制御するために比較されます。
      注：各ピークの正規化は、全カウントに対しても行うことができますが、親のグロインは、結果が似ている傾向にある他のすべてのPtdInsPsよりもはるかに豊富であるため。
    8. 「CSV（カンマ区切り） "ファイル形式を" ...として保存」、「ファイル」を押して、クロマトグラフ用のデータをエクスポートし、選択します。スプレッドシート上のデータをプロットし、必要に応じて提示します。

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結果

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この方法を用いて、酵母PtdInsPsは、代謝的に3 H- ミオ -イノシトールを用いて標識しました。標識後、リン脂質は、リン脂質脱アシル化し、水溶性GRO-InsPs（ 図1）を抽出し、過塩素酸を用いて沈殿させました。この段階では、それはのPtdIns（3,5）P 2のような非常に低存在量PtdInsPsために十分な信号対雑音比を確保するために、液体シンチレーションによって抽出されたGRO-InsPsに関連付けられた総放射活性シグナルを定量化することが重要です。 5から10000000のCPMの合計を注入する必要があります。酵母細胞は、わずか4 PtdInsPsを示すので（ 図2）に記載のように、分解能は1時間の溶出法を用いて達成することができます。

ここでは、野生型、ΔとΔvac14酵...

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ディスカッション

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この記事では、酵母からHPLC結合フローシンチレーションによりPtdnsPsの細胞レベルを定量化するために必要な実験プロトコルの詳細について説明します。方法論は、脂質処理、水溶性3 H-GRO-InsPs、HPLC分画と分析を抽出した3 H- ミオ -イノシトールとPtdInsPsの代謝標識を可能にします。 PtdInsについて示されているように、この方法を用いて、種々の条件下での細胞におけるPtdInsPsの相対的レベルは、定量することができる（3,5）は、野生型、vac14の D及びD atg18酵母細胞におけるP 2（ 図4）。

結果を最適化および/またはトラブルシューティングするために行うことができます重要なステップや修正がいくつかあります。 PtdInsPsの信頼できる定量化を達成するための最も重要なパラメータの一つは、全放射能の信号レベルです。一般的に、HPLCに3から5000000カウントを注入することは、多くの場合...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

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C.Y.H. は、オンタリオ州政府からのオンタリオ大学院奨学金によって支援されました。この記事は、R.J.B.がNatural Sciences and Engineering Research Council、Canada Research Chairs Program、およびRyerson Universityから資金提供を受けて作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1-ブタノールバイオベーシックBC1800試薬グレード
リン酸アンモニウム 二塩基性バイオショップAPD001ACS グレード
硫酸アンモニウムバイオベーシック ADB0060ウルトラピュアグレード
オートサンプラーアジレントG1329Bアジレント 1260 インフィニティ シリーズ
ビオチンシグマB4501
ホウ酸BiobasicBB0044分子生物学グレード
塩化カルシウムBiobasicCT1330無水、工業グレード
パントテン酸カルシウムΣC8731
硫酸銅(II)Σ451657 無水
D-グルコースBiobasicGB0219無水、バイオテクノロジーグレードの
ダルベッコの改造イーグルのミディアムライフ11995-0654.5 g / Lグルコース、110 mg / Lピル酸、L-グルタミン
ダルベッコのイーグルズミディアMPバイオメディカル0916429 4.5 g / Lグルコース、L-グルアットミンなし、イノシトールなし
EDTABiobasicEB0107アシッドフリー、超高純度グレードの
エチルエーテルCaledon labs1/10/4700無水、試薬グレード
ギ酸エチルグマ112682試薬グレード
シ胎児血清Wisent080-450米国原産、プレミアム品質、熱不活化
ウシ胎児血清、透析寿命26400044US起源
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05フローシンチレーション用シンチレーション液 
葉酸バイオベーシックFB0466USP グレード
HEPES 緩衝液寿命156300801 M 溶液
イノシトール、Myo-[2-3H(N)]パーキン エルマーNET114005MC9:1 エタノールから水へ
インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン寿命51500056100x 溶液
塩化鉄(III)シグマ157740試薬グレード
ローラ - クロマトグラフィーデータ収集および分析ソフトウェアLabLogic Systems Ltdバージョン 4.2.1.18フローシンチレータソフトウェア
L-グルタミンSigmaG7513200 mM、溶液、滅菌ろ過、BioXtra、細胞培養に適しています
塩化マグネシウムSigmaM8266無水
硫酸マンガンBiobasicMB0334一水和物、ACSグレード
メタノールCaledon labs6701-7-40HPLCグレード
メチルアミン溶液Sigma42646640% (v/v)
リン酸一カリウムBiobasicPB0445無水、ACS グレード
ニコチン酸BiobasicNB0660試薬グレード
OpenLAB CSD ChemStation アジレントRev. C.01.03 HPLCソフトウェア
p-アミノ安息香酸(PABA)BioshopPAB001.100遊離酸
ペニシリン-ストレプトマイシンSigmaP4333100X、液体、安定化、滅菌ろ過、細胞培養試験
過塩素酸シグマ244252ACS試薬、70%
PhenoSpher SAXカラムPhenomenex00G-315-E05 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
リン酸Caledon labs1/29/8425試薬グレード
塩化カリウムバイオベーシックPB0440ACSグレード
ヨウ化カリウムバイオベーシックPB0443ACSグレード
塩酸ピリドキシンシグマP9755
クオータナリーポンプアジレントG1311Cアジレント 1260インフィニティシリーズ
リボフラビンバイオショップRIB333.100USPグレード
塩化ナトリウムバイオベーシックDB0483バイオテクノロジーグレード
モリブデン酸ナトリウムシグマ243655
サーモスタット付きカラムコンパートメントアジレントG1316Aアジレント 1260 インフィニティシリーズ
チアミン塩酸塩シグマT4625試薬グレード;0.02%(W / V)の溶液を作り、懸濁液を形成します。アリコートを混ぜて凍結
ウルティマゴールドパーキンエルマー6013321数える液体シンチレーション用シンチレーションコクテール
バイオベーシックZB2906水和物、試薬グレード
&ベータ;-RAM 4IN/USシステムモデル4フローシンチレータ - 500 & マイクロ;lフローセル;代替ラジオマティックフローシンチレータアナライザー パーキン・エルマー 
ムの修正 シ ウ済み する 硫酸亜鉛を七

参考文献

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