高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

ホスホイノシチド(PtdInsPs)は、シグナル伝達、膜輸送、遺伝子発現など、さまざまな細胞機能の調節を助ける重要なシグナル伝達リン脂質であり、細胞分裂、オルガネラ同一性、代謝活性などの高次細胞の振る舞いを調節します^1-3。親リン脂質であるホスファチジルイノシトール(PtdIns)のイノシトールヘッドグループの3、4、および/または5位のリン酸化に由来するPtdInsPには7つの種があります。重要なことに、7つのPtdInsPは不均等に分布しており、各PtdInsP種の局所濃度は、それらが異なるタンパク質エフェクターのセットに結合する特定の細胞内部位で増加または減少する可能性があり、これにより、各PtdInsPがその宿主膜の同一性と機能を制御することができます^3,4。さらに、各PtdInsPのレベルは、PtdInsPによって生成される信号強度に大きな影響を与える可能性があるため、厳密に制御する必要があります。各PtdInsPの局在とレベルは、各PtdInsPの合成と代謝回転を媒介する多数の脂質キナーゼ、ホスファターゼ、およびホスホリパーゼの標的化と活性に依存します^3,4。したがって、PtdInsP調節機構の誤った制御は細胞機能を混乱させ、癌や変性疾患などの疾患につながる可能性があります^2,5,6。PtdInsPとその制御機構の役割と機能を完全に理解するために、PtdInsPを追跡および定量するための顕微鏡ベースおよび生化学ベースの技術が開発されました。

多くの場合、PtdInsPsは特定のタンパク質ドメイン^7-9を介してタンパク質エフェクターに結合します。これらのタンパク質モジュールは、タンパク質全体とは別に発現した場合、多くの場合、適切なフォールドおよび脂質認識特性を保持します。これにより、特定のPtdInsP結合タンパク質ドメインを緑色蛍光タンパク質(GFP)のような蛍光タンパク質(FP)に融合させることにより、顕微鏡によるPtdInsPの細胞内検出が可能になりました。実際、多くの研究がFP融合PtdInsP結合タンパク質モジュールを使用して、生細胞イメージングによって特定のPtdInsP種の局在と動態を同定しています^1,10。例えば、GFPに融合したホスホリパーゼC δ1(PLCδ1)のプレクストリン相同性(PH)ドメインは、原形質膜上のホスファチジルイノシトール-4,5-ビスリン酸[PtdIns(4,5)P₂]を特異的に認識しますが、初期エンドソーム抗原1(EEA1)のFYVEドメインのタンデムコピーは、エンドソーム^10-13上のホスファチジルイノシトール-3-リン酸(PtdIns3P)を追跡するために使用されています.全体として、顕微鏡法に基づく技術は、PtdInsPの局在とダイナミクスを視覚化するのに最適ですが、PtdInsP結合ドメインが標的PtdInsP分子種以外の他の因子とも相互作用する可能性があることや、FPプローブの細胞質蛍光より下の変化を検出できないことなど、いくつかの注意点があります。

各PtdInsP^14-16のレベルを特徴付け、定量化するために、薄層クロマトグラフィー、質量分析、放射性同位元素標識などの生化学的手法も使用することができます。これらの方法では、PtdInsPの細胞レベルを検出するために脂質を単離する必要があります。質量分析は、脂質抽出物からリン脂質を特徴付けるために使用でき、PtdInsPs^14,17のアシル鎖組成を決定するために非常に貴重です。しかし、質量分析はほとんどが半定量的であり、同じ分子量のPtdInsP分子種を分離し、同時に定量することは依然として困難です^14,17。これに対し、PtdInsPsの放射性同位元素標識とそれに続く高速液体クロマトグラフィー(HPLC)結合フローシンチレーションは、PtdInsPs¹⁸の7種すべての分離と同時定量に有用です。強陰イオン交換(SAX)カラムを備えたHPLCを使用すると、分子量、電荷、形状に基づく分離が実現するため、同じ分子量と電荷でも脱アシル化されたPtdInsPs(Gro-InsPs)が分画されます。HPLC溶離液をフローシンチレータに結合すると、元の親グリセロールイノシトール(Gro-Ins)¹⁸に対して、各Gro-InsPs分子種について放射性ベースのシグナルピークが生成されます。これは最終的に、細胞内のPtdInsPsの相対レベルに対応します。

PtdInsPの放射性標識とHPLC結合フローシンチレーションは、PtdIns^16,19,20の~0.1-0.3%しか構成しないPtdInsPであるホスファチジルイノシトール3,5-ビスリン酸[PtdIns(3,5)P₂]の調節と機能を調査するための有用なツールです。PtdIns(3,5)P₂の合成は、酵母ではFab1と呼ばれるPtdIns3P 5-キナーゼによって、哺乳類ではPIKfyveによって行われる²¹。この反応は、酵母ではFig4、哺乳類ではmFig4/Sac3と呼ばれるPtdIns(3,5)P₂ 5-ホスファターゼによって打ち消されます^22-24。興味深いことに、PIKfyve/Fab1とmFig4/Fig4/Sac3はどちらも単一の複合体に存在し、酵母のVac14または哺乳類のmVac14/ArPIKfyveという足場アダプタータンパク質によって制御されています^25,26。VAC14欠失酵母細胞では、Fab1は効率的に機能せず、PtdIns(3,5)P₂レベル^27,28が90%減少します。一方、Atg18は、液胞分裂を制御する可能性のあるPtdIns(3,5)P₂エフェクタータンパク質である²⁹。Atg18は、その遺伝子であるATG18の欠失によりPtdIns(3,5)P₂レベル^29,30が10〜20倍に増加するため、PtdIns(3,5)P₂の負の調節因子でもあります。全体として、PtdIns(3,5)P₂のレベルの変化は、酵母液胞および哺乳類リソソームの機能に深刻な影響を及ぼし、その結果、膜輸送、ファゴソーム成熟、オートファジーおよびイオン輸送などのプロセスに影響を与える^6,19,21,31。

この記事では、野生型、vac14Δ、およびatg18Δ酵母株のPtdIns(3,5)P₂の相対レベルを検出するために、酵母中の³H-ミオイノシトールによるPtdInsPの放射性同位体標識のプロセスについて説明します。これを例にとると、個々のPtdInsPの分離に対するHPLCの分離能と、微量の³H-ミオイノシトールを検出するためのフローシンチレーションの感度を示します。また、哺乳類細胞から³つのH標識PtdInsPを標識して分離するための方法論を最適化する方法についても詳しく説明します。これらの細胞は7つのPtdInsP種すべてを持っているため、サンプルはより複雑になる傾向があります。

注：テキストは、以下に詳細に酵母でPtdInsPsを測定する方法について説明します。これは^、3 H- ミオ -イノシトールの 、脂質を抽出し、脱アシル化及び脱アシル化PtdInsPsを分別し、定量化するためのHPLC溶出プロトコルで標識する酵母細胞のための実験の詳細を提供します。最適化と長いHPLC溶出プロファイルを必要とする哺乳動物細胞におけるPtdInsPsのラベリング、脱アシル化、解像度および定量に注意してください。我々は議論中の側面のいくつかを議論してもこれらの詳細は、他の場所で見つけることができます。全体的に、脂質を抽出しアシル基を除去すると、酵母から水溶性GRO-InsPsを抽出する方法が与えられ、 図1に示されています。

酵母におけるラベル付けとの解析法PtdInsPs 1.プロトコル

1. 細胞培養および放射性標識
   1. 定数は完全に合成で振とうしながら30℃で酵母株SEY6210 20mlの培養液を成長させます対数期中期または約0.6〜0.7の600 nmの（OD _600）での光学密度のメディア。
      注：これは³ H- ミオ -イノシトールの取り込みに影響を与える可能性があるとして、YPDメディアを使用しないでください。この培養サイズは2-3のHPLCの実行のために十分な材料を提供する必要があります。
   2. 12ミリリットル丸底チューブ中で5分間800×gで遠心分離することによって（OD ₆₀₀ = 1で1mlの文化が〜1×10 ^{7個の細胞}が含まれていることに注意してください）酵母細胞の10〜14 ODの合計をペレット化。イノシトールを含まない培地（IFM）の2mlで再懸濁（IFM組成については表1を参照）。
   3. 遠心分離を繰り返し、メディアを吸引除去します。 IFMの440μlのペレットを再懸濁し、室温で15分間インキュベートします。
   4. 各試料に³ H- ミオ -イノシトール（1μL=1μCiの）の60μlを添加して、振盪しながら1〜3時間、30℃の成長温度でインキュベートします。
      注意^：3 H- ミオ -イノシトールのは、放射性メイトであります適切なトレーニングの後に処理されるべきであるリアル。また^、3 H含有材料と接触するすべての消耗品が適切に配置されるべきであり、放射性廃棄物として指定されました。
      注：成長温度を変化させることができる限り、全ての株が、同じ温度で成長され比較されるように、必要に応じ。
   5. 9％過塩素酸500μlのを含むマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液（500μl）を転送し、酸200μlのガラスビーズを洗浄しました。反転によって混合し、5分間氷上でインキュベートします。
   6. 10分間最高速度でサンプルをボルテックスし、ガラスビーズを回避するために、ゲルローディングチップを使用して、新しいマイクロ遠心チューブに溶解物を移します。
   7. 4℃で10分間12,000×gで試料をペレット化し、上清を吸引します。
   8. 氷冷100 mMのEDTA、1mlのバス超音波処理によってペレットを再懸濁。以前のように再びペレット化します。
2. 脱アシル化および抽出 たてのメタノールを2.3ミリリットル、40％のメチルアミンの1.3ミリリットル、1-ブタノールと水の0.80ミリリットルの0.55ミリリットルを組み合わせることにより、脱アシル化試薬5.0mlのを準備します。混合するために反転します。
3. EDTAを吸引し、50μlの水にペレットを超音波処理します。
4. 脱アシル化試薬の500μlを添加して、混合する超音波処理。室温で20分間インキュベートします。
5. ヒートブロック中で53℃で50分間熱脂質。 3時間またはO / Nを介して真空遠心分離によって完全にサンプルを乾燥させます。
   1. 化学トラップは空気が入るの蒸気を防ぐために、真空遠心分離機と真空ポンプとの間に設置されていることを確認します。
6. 風呂超音波処理によって水300μlのペレットを再懸濁し、室温で20分間インキュベートします。 3時間またはO / Nのための真空遠心分離によりサンプルを乾燥させます。もう一度この手順を繰り返します。
7. 水450μlのペレットを超音波処理。これは、抽出時の水相です。
8. たてextractioの10ミリリットルを準備1-ブタノールの8.0 mlの、エチルエーテル、ギ酸エチル0.40 mlの1.6 mlで添加することにより、n個の試薬。混合するために反転します。
9. 水相に抽出試薬を300μlを追加します。 5分間トップスピードでボルテックス混合物を、2分間、最高速度（18,000 XG）で遠心分離して層を分離します。
10. トップ有機層、インターフェース、およびペレットを避けながら、新しいマイクロチューブに底部の水層を収集します。新鮮な抽出試薬で二回以上の水性相の抽出を繰り返します。
11. 完全真空遠心分離によって収集し、水層を乾燥させます。風呂超音波処理によって水50μlにペレットを分散させます。
12. 6ミリリットルのポリエチレンシンチレーションバイアルにシンチレーション液4mlのに各2μlのサンプルを追加します。開いているウィンドウを使用して、液体シンチレーションにより各サンプルにおける（CPM）でカウント数を決定します。
13. HPLCの準備が整うまで-20℃でサンプルを保管してください。

この方法を用いて、酵母PtdInsPsは、代謝的に3 H- ミオ -イノシトールを用いて標識しました。標識後、リン脂質は、リン脂質脱アシル化し、水溶性GRO-InsPs（ 図1）を抽出し、過塩素酸を用いて沈殿させました。この段階では、それはのPtdIns（3,5）P 2のような非常に低存在量PtdInsPsために十分な信号対雑音比を確保するために、液体シンチレーションによって抽出されたGRO-InsPsに関連付けられた総放射活性シグナルを定量化することが重要です。 5から10000000のCPMの合計を注入する必要があります。酵母細胞は、わずか4 PtdInsPsを示すので（ 図2）に記載のように、分解能は1時間の溶出法を用いて達成することができます。

ここでは、野生型、ΔとΔvac14酵母変異体が標識とのPtdInsの変更（3,5）を分析するために加工したatg18 P 2、第E酵母16,19,27におけるPtdInsPsの少なくとも豊富。 図4A-C、3 H-関連する信号のピークを生成し、すべての3つの株の溶出プロファイルで観察されたように。 GRO-、GRO-Ins3P（〜18分）、続いて、親のグロインのピークは（グロインがリン酸化種の信号を影が薄いので、 図3ではなく、 図4に示す8-9分）最初の溶出しますそれぞれアシル化リン脂質のPtdInsに対応しています（00分〜32）、Ins4P（〜20分）、グロアドイン（3,5）、P 2（〜29分）、グロイン（4,5）P 2 PtdIns3P、PtdIns4P、のPtdIns（3,5）P 2とのPtdIns（4,5）P 2。 4分、すぐに親グロイン（10分）に追従する傾向がある1での追加小ピークがいくつかあります。これらは、おそらくイノシトールと非glyceratedリン酸inositide（ 図3）を表します 。溶出パターンは、diffeを採用した場合、正確な時間は変更になる場合がありますが、一貫性の特徴でありますHPLCシステムおよび/または新しい列を借ります。

PtdIns（3,5）P 2（ 図4、赤い矢印）に関連したピークは、ΔとΔvac14酵母株atg18野生型との間に最も劇的な変化を受けます。野生型細胞（A）と比較して、非常に大規模なグロイン（3,5）P 2 atg18の Δ細胞内-関連信号とvac14Δを酵母細胞内での小さいピークがあります。各ピークに関連した総放射性シグナルを定量化するために、カウントがピークの面積（ 図3）の下に統合されました。絶対放射性シグナルがサンプル間で変化するので、また、親のグロイン種は、（1つはまた、総カウントに対して正規化するために選択することができます）それに対して正規化することによって、内部対照として使用しました。これにより、データは、一方のPtdInsのイノシトール（PtdIns（3,5）P 2 は、3,5、野生型酵母細胞でのPtdInsのみの0.07％を構成していることを示唆しています）P 2はatg18の Δ細胞における親のPtdIns、またはのPtdInsの劇的な17倍の増加（3,5）、P野生型細胞（ 図4A、BおよびD）に2相対の1.2％に相当します。比較では、のPtdIns（3,5）P 2レベルがVAC14でのPtdIns信号のわずか0.01％が酵母細胞、のPtdIns（3,5）P 2（ 図4C および D）で85％の損失を-deletedました。全体として、これらの測定値は、のPtdIns（3,5）P 2 は、野生型細胞でのPtdInsの約0.1％、vac14 Dに減少し90％であり、atg18の D細胞において10〜20倍高いことを示す公表された結果と一致しています野生型細胞27,29の相対。

図1.脱アシル化および 3 H-GRO-INSP の抽出 。放射性標識LIPI過塩素酸中のd沈殿物をEDTA水溶液で洗浄しました。次いで、これを吸引し、脱アシル化試薬を添加し、53℃でインキュベートします。脱アシル化反応混合物は、抽出試薬を加え、その後、真空乾燥し、水で2回洗浄されます。これは、その後、ボルテックスし、遠心分離し、水相を回収しています。抽出工程は、有機および不溶性汚染物質を除去するために3回、合計繰り返されます。 3 H-GRO-INSPを含む水溶性画分（青）、次いで乾燥させ、水60μLで再水和真空れます。放射能の量を液体シンチレーション（CPM）によって決定され、サンプル全体で同じ数をHPLCにロードされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

<3 H-GRO-INSP の溶出用リン酸アンモニウム緩衝液の BR /> 図2.グラデーション 。GRO-INSPの解像度強い陰イオン交換クロマトグラフィーによってpHを3.8（緩衝液B）、リン酸アンモニウム、二塩基性の用途に依存します。勾配の選択は、分離のために利用可能なGRO-INSP種の混合物に依存する。 プロトコルAは 4つしかPtdInsPsを保有する酵母サンプルに使用されます。 4つのピークのそれぞれの解像度は急速な増加（NH 4）2 HPO 4濃度で十分である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3. PtdInsPの豊富のデータ分析のための指示をガイド付き。データファイルには、ローラの上にロードされていますoftwareと視覚的にクロマトグラフ（デフォルトで開い）を使用して評価しました。ツール「ズーム」使用する（A）、ピークを拡大する（B）。 「ROIを追加」ツール（C）を使用してクロマトグラフに明瞭なピークを選択します。 「領域テーブル」タブ（D）において、関心の強調表示された領域からのすべての結果の情報は、単一のテーブル（E）として表示されます。各ピークの生のカウントをエクスポート（f）および親のホスファチジルイノシトール（G）に対して、または合計数に対して各PtdInsP種を正規化する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4のPtdIns（3,5）P 野生型および変異体酵母細胞における 2 レベル。代表的クロマトグラフは、抽出物のフローシンチレーションのために示されていますΔ（B）、およびvac14Δ プロトコルAを使用して、（C）酵母株。（3,5）アドインをGROに対応する関心領域からの生のカウントatg18、野生型（A）から3 H-GRO-InsPsエドP 2（矢印）を差し引いクロマトグラフと背景から抽出されます。結果の値は、野生型と比較し、グロイン（3,5）P 2のレベル（D）の倍数変化として表されます。グロインでレベルと変更が（3,5）P 2は、レベルと、元のPtdIns（3,5）P 2の変化を示すように解釈されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ベースメディアは、3 H- ミオ -イノシトールで補充するよう酵母イノシトールを含まない培地。酵母細胞の表1の組成は、IFMで放射性標識されています。示された解決策を使用してIFM 100mlの溶液を調製します、フィルターはRTでボトルトップ0.22μmの真空フィルターとストアを使用して滅菌します。低リン酸塩および硫酸塩メディア（LPSM）を調製するには、示された塩を使用しての100mlの溶液を生成し、フィルターを室温でボトルトップ0.22μmの真空フィルターとストアを使用して滅菌します。微量元素の1 L 1,000倍溶液を調製するために示した塩を溶解します。 -20℃での使用および/またはストアアリコートの前に完全に混合。 1 L 500倍ビタミン溶液を調製するために示されたビタミンを溶かします。 -20℃での使用や店舗のアリコートの前に完全に混合。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。