方法論記事

エレクトロスプレーイオン化質量分析法によるDicysteinylテトラペプチドと水銀（II）の錯体の研究

DOI：

10.3791/53536

⸱

2016年1月8日

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

エレクトロスプレーイオン化Orbitrap質量分析による、水銀(II)とジシステニルテトラペプチドの異なる相対比で形成された複合体の特性評価が提示されます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、エレクトロスプレーイオン化Orbitrap質量分析法により、水銀(II)とジシステニルテトラペプチドの異なる相対比で形成された複合体の特性評価の方法を評価しました。 この戦略は、質量分析などの手法を利用して、トリペプチドが関与する水銀-ジシステニル錯体の特性評価にこれまでに成功したことに基づいています。 塩化水銀(II)とジシステニルテトラペプチドを、脱気緩衝培地中でさまざまな化学量論的比率でインキュベートしました。 形成された錯体は、その後、ハイブリッドリニアイオントラップ質量分析計とオービトラップ質量分析計からなるエレクトロスプレー質量分析計で分析されました。 エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)スペクトルをポジティブモードで取得し、観察されたピークを明確な水銀同位体分布パターンと関連するモノアイソトピックピークについて分析しました。 この研究は、特定のエレクトロスプレーイオン化条件下で形成された錯体中の水銀とペプチドの正確な化学量論が、明確な水銀同位体分布パターンに基づく高分解能ESI MSを使用して決定できることを示しています。

概要

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現在の臨床薬は、水銀中毒1のキレーション療法のために処方されたチオール基を含み、これは水銀イオン2,3の結合と隔離に関与しています。 しかし、これらの小さなチオール化合物[ジメルカプトコハク酸(DMSA)およびジメルカプトプロパン-スルホン酸(DMPS)]は、水銀キレート療法には最適ではないことが研究で示されています4-6。 したがって、水銀キレート化のためのチオール化合物の合理的な薬物設計を強化するために、水銀とチオールとの関連と複雑な形成傾向を理解する必要があります。 最近、我々は、ジチオール基を有するn-アルキルおよびアリールジシステニルトリペプチドが、水銀(II)の配位部位を収容する効果的な「ダブルアンカー」として機能し、1:1の水銀(II):pエプチドおよび1:2の水銀(II):(ペプチド)2複合体を形成することを報告した7。 さらに、システイン残基の増加が複合体型の形成に及ぼす影響を検討しました8。 本研究では、水銀(II)と2つのジシステニルテトラペプチドとの関連について、システイン残基が2つのアミノ酸残基によって分離されていることを確認した。 水銀の補助結合基の影響を評価するために、介在するアミノ酸は、2つのグリシン(非置換)残基または2つのグルタミン酸(γ-カルボキシル化)残基のいずれかです。

システインペプチドと水銀(II)との反応には、システインイルチオール基の酸化がジスルフィド結合を形成するのを防ぐ条件が必要です9。 さらに、水銀(II)とシステインペプチドとの会合がさまざまな種類の水銀-ペプチド複合体を形成することは、反応混合物中の水銀(II):ペプチドの初期比率に依存します7,8。 これらの反応混合物で形成される水銀-ペプチド錯体の種類は、金属イオンとペプチドとの間の種相互作用を決定するための高感度分析ツールである軟イオン化質量分析法で分析できます10-14。 したがって、特定のエレクトロスプレーイオン化条件下で形成されるさまざまなタイプの水銀化ペプチド付加体のプロファイルを提供します。 ここでは、システニルペプチドと塩化水銀(II)溶液を、アルゴンで覆った脱気ギ酸アンモニウム緩衝液で調製して酸化を最小限に抑える方法を示します。 水銀(II)のさまざまなモル当量をジシステニルテトラペプチドと反応させることにより、水銀(II):pエプチドの初期比率が形成される錯体の種類にどのように影響するかを示します。 また、エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析を特性評価ツールとして使用して、形成された複合体中の水銀とペプチドの正確な化学量論を提供する方法も示します。 関連するビデオプロトコルは、水銀錯体を調製するための実験条件、指定されたエレクトロスプレーイオン化条件下での反応混合物を分析する手順、およびChemCalプログラム15を使用して、明確な水銀同位体分布パターンに基づく水銀(II)-ジシステニルテトラペプチド錯体の化学量論の特性評価を示します. ESI orbitrap質量分析を使用して、異なる同位体形態で存在する金属イオンによって形成されるさまざまな錯体を分析することに関心のある方を支援することを目的としています。

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プロトコル

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注：使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。塩化水銀は有毒化学物質です。それと関連するすべてのソリューションを渡す際に個人用保護具（手袋、安全ゴーグル、および白衣）を着用しなければなりません。重金属のために指定された明確に表示化学廃液ボトル内のソリューションを処分。

5 mMの脱気したギ酸アンモニウム緩衝液（pH7.5）の調製

  1. HPLCグレードの水450ミリリットルにギ酸アンモニウム緩衝液の0.1576グラムを溶解します。 1 Mギ酸および7.5から1 M水酸化アンモニウムで上記溶液のpHを調整します。 500ミリリットルのメスフラスコに、このソリューションを移し、5 mMのギ酸アンモニウム溶液を作製するために検量線にHPLC水を追加します。
  2. アルゴンで10分間パージするための真空システムの下で5 mMのギ酸アンモニウム緩衝液を脱気。アルゴン下で二回繰り返して、ストア・ソリューション。使用の日に、血友病0.2ミクロンフィルターを通して緩衝液をフィルタE使用。

水銀（II）塩化物溶液の調製

  1. 0.2375グラムの水銀（II）塩化物を秤量。 0.035 M水銀（II）塩化物溶液を生成するために5mMのギ酸アンモニウム緩衝液25ml中に溶解します。
  2. 7.5×10 -4 Mのソリューションを作成するために、9.785ミリリットルの5mMのギ酸アンモニウムバッファーに0.214ミリリットル0.035 M水銀（II）塩化物溶液を追加します。アルゴンガスを7.5×10 -4 Mの水銀（II）溶液をブランケット。

CGGCストック溶液の調製

  1. HPLCグレードのアセトニトリルの0.118ミリリットルで、dicysteinylテトラペプチド、CGGC 2.0mgのを溶解した後、5 mMのギ酸アンモニウム、5mMのCGGC原液を得アルゴンで脱気されたpHが7.5の緩衝液1.0647ミリリットルを追加します。
  2. 7.5×10 -4 M CGGC溶液を得5mMのアンモニウム形成のpHの1,275μlの7.5バッファに5 mMのCGGC原液の225μLを加えます。

4.準備水銀（II）とCGGCの種々の反応混合物

  1. 水銀の0.5比（II）：CGGC液1の調製
    1. 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を255μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。
    2. 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小に7.5×10 -4 M CGGC溶液を15μlを添加します。 10秒のためのソリューションをVORTEX。ソリューションは、質量分析計に注入前に10分間放置してみましょう。
  2. 水銀の1の比率（II）：CGGC液1の調製
    1. 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を240μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。
    2. 10秒のためのソリューションをVORTEX。そして、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに7.5×10 -4 M CGGC溶液を30μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。
  3. 水銀の2比（II）：CGGC液1の調製
    1. 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を210μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。
    2. 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小管に7.5×10 -4 M CGGC溶液を60μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。

CEEC原液の5準備

  1. ペプチドを溶解させ、HPLCグレードのアセトニトリルの0.145ミリリットルで、dicysteinylテトラペプチド、CEECの3.5 mgの溶解。その後5mMのギ酸アンモニウム、0.5メートルを生成するためにアルゴンで脱ガスされたpHが7.5の緩衝液13.067ミリリットルを加えますM CEECソリューション。
  2. すべてのペプチドが溶解するまで溶液をボルテックス。 7.5×10 -5 M CEEC溶液を得、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに、1.125ミリリットル0.5 mMのをpH7.5のバッファーをCEEC液および5mMのギ酸アンモニウムの0.375ミリリットルを追加します。ボルテックス混合されるまで。

水銀（II）とCEECソリューションの様々な反応混合物の調製6。

  1. 1の調製：水銀（II）の比は0.5：CEEC溶液
    1. 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を255μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。
    2. 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小管に7.5×10 -4 M CEEC溶液を15μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。
  2. 水銀（II）の1：1の比：1の調製CEECソリューション
    1. 240を配置81; 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液のリットル。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。
    2. 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小管に7.5×10 -4 M CEEC溶液を30μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。
  3. 水銀（II）の2比：1の調製CEECソリューション
    1. 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を210μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。
    2. 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小管に7.5×10 -4 M CEEC溶液を60μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。

7. ANALYオービトラップESI質量分析による水銀（II）とCGGCサンプルの反応混合物をシュッ

  1. ESI質量分析計16の準備
    1. 500μlのガラスシリンジに校正標準の100μLを描画します。
    2. 、MSポンプのシリンジクレードルに注射器を置き、チューブを取り付け、質量分光光度計の中に注入します。
    3. ファイルのアイコンを選択し、ファイル名を入力して実行するためのファイル名を設定します。
    4. データ取得モジュールで取得するデータボタンを選択し、150スキャンを収集します。
    5. ソフトウェアのデータ処理モジュールを開くことによって、較正基準を検証するクロマトグラムを分析します。モジュールを開き、メニューをファイルに移動して、「オープン」を選択し、ダイアログボックスでファイルを選択します。クロマトグラムのピークが基準の比率を質量電荷に相関していることを確認します。
    6. 500μlのHPLCグレードのメタノールを描画することにより500μlのガラスシリンジをきれいにして、Mを分配ビーカーにエタノール。
    7. ガラスシリンジにHPLCグレードのメタノール500μlのを描画し、ステップ7.1.2のとおりにシステムをフラッシュします。
    8. パラメータを設定するためのソフトウェアの方法のセットアップ・モジュールを選択します。スキャンモードメニューを選択し、FTMSなどの分析器を特定し、「OK」をクリックしてください。シースガス流量：10、ソース温度：0、キャピラリー電圧：37 V、チューブレンズ：95 V、スプレー電圧：4.20 kVのその後のリアルタイムビュースペクトルページのさまざまなアイコンをクリックすることで、以下のパラメータを設定します、フローは10.00μL/ minで、アナライザを評価：FTMS、スキャン数：150。
  2. ESI質量分析計でCGGCサンプルを実行します
    1. 5 mMのギ酸アンモニウムpH7.5のバッファーを実行します。
      1. 、500μlのガラスシリンジに5 mMのギ酸アンモニウム緩衝液500μlを置き、MSポンプのシリンジクレードルにそれを置き、チューブを取り付けます。
      2. 1-2分間チューブを介してバッファを実行します。
      3. ランのファイル名を設定しますファイルのアイコンを選択し、ファイル名を入力して。
      4. モジュール内の取得データ]ボタンを選択し、150スキャンを収集します。
      5. 150スキャンを収集した後に収集を停止するには[実行]ボタンをクリックします。
      6. データブラウザモジュールを開き、メニューをファイルに移動して、「オープン」を選択し、ダイアログボックスでファイルを選択します。ペプチドまたは水銀（II） - ペプチド複合体に似ていることに何の483、683、1163および1363のピークのm / zが存在しないことを確認します。
    2. 0.5水銀（II）：CGGC比液1を実行します。
      1. 0.5水銀（II）：注射器への試料のCGGC比1の250μLを入れます。
      2. チューブ、および素数装置を取り付け、MSポンプのシリンジクレードルに注射器を置きます。
      3. ファイルのアイコンを選択し、ファイル名を入力して実行するためのファイル名を選択します。
      4. データ取得モジュールで取得するデータボタンを押して、150スキャンを収集し、収集を停止するには[実行]ボタンをクリックします。
      5. モジュールを開き、メニューをファイルに移動して、「オープン」を選択し、ダイアログボックスでファイルを選択します。クロマトグラムは、単独でCGGCペプチドのための1つを含むピークが含まれていることを確認します。
      6. 500μlのギ酸アンモニウム緩衝液で吸引した後、ビーカーにギ酸アンモニウムバッファーを分配することによって、注射器を洗浄します。
      7. MSの廃棄物のボタンを選択し、チューブに500μlのギ酸アンモニウム緩衝液で3回洗浄します。
      8. 500μlのメタノールで吸引した後、ビーカーにメタノールを分配することによって、注射器を洗浄します。
      9. 500μlのメタノールでチューブ1時間をフラッシュします。
      10. MSの負荷検出器のボタンを選択します。
      11. シリンジにギ酸アンモニウム緩衝液500μlを追加します。
      12. チューブ、および素数装置を取り付け、MSポンプのシリンジクレードルに注射器を置きます。
      13. ファイルのアイコンを選択し、ファイル名を入力して実行し、バッファのファイル名を選択します。
      14. 押す取得データボタンと150スキャンを収集した後、停止実行ボタンをクリックします。
      15. データブラウザモジュールを開き、メニューをファイルに移動して、「オープン」を選択し、ダイアログボックスでファイルを選択します。 CGGCラン：クロマトグラムは、前水銀からのピークの空隙であることを確認します。
    3. 1水銀（II）：CGGC比液1を実行します。
      1. シリンジにCGGC比サンプル：1の水銀（II）：1の250μLを入れます。
      2. 7.2.2.15までの流れ7.2.2.2で説明したように、同様に繰り返します。
    4. 2水銀（II）：CGGC比液1を実行します。
      1. シリンジにCGGC濃度サンプル：2水銀（II）：1の250μLを入れます。
      2. 7.2.2.15までの流れ7.2.2.2で説明したように、同様に繰り返します。

8.オービトラップESI質量分析法による水銀およびCEECサンプルの反応混合物の分析

  1. ESI質量分析計でCEECサンプルを実行します
    1. 繰り返し分析手順（ステップ7.1〜7.2）CEECサンプルや様々な化学量論比での水銀（II）とCEECの反応混合物を使用。

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結果

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研究は、ESI質量分析により2テ ​​トラペプチド、CGGC及びCEEC（ 図1）のための可能な水銀-ペプチド複合体組成物を特徴づけるために実施しました。 1：0.5、1：1、及び1：2（水銀（II）：ペプチド）CGGCまたはCEECと水銀の複合体（II）は、三つの異なるモル比での水銀の混合物（II）とペプチド溶液を反応させて調べました。水銀の濃度（II）が7.5×10 -6 Mとに応じて変化させるペプチド濃度でした。

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図1. Dicysteinylペプチド構造。dicysteinylテトラペプチドの化学構造、CGGCとCEEC。

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ディスカッション

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疎水dicysteinylテトラペプチドCGGC（C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; = 338 MW）は、図2 及び表1に示すように（ 図1）は 、水銀（II）と複合体を形成しさらに、ペプチド二量体および三量体を形成します。増分反応混合物中のペプチドの量が増加します。 [+ = 1015（3M + H）]のm / z関連する二量体の値[（2M + H）+ = 677]とトリマーによって示されるように、CGGCのチオール基は、実験条件下でジスルフィドを形成するために酸化されませんでした。これらの関連CGGC種の形成は、このテトラペプチドの疎水性によるものである可能性があります。以前dicysteinylトリペプチド7について報告されているように2水銀（II）:(ペプチド）2

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開示事項

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報告された作品については開示されていません。

謝辞

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MN-Sは全米科学財団からの支援を承認、RUIは、著者は感謝してサーモフィッシャーサイエンティフィックLTQオービトラップXL質量分析計を使用するためにノースカロライナ大学グリーンズボロ校でトライアド質量分析施設を承認CHE 1011859.を付与します。作者はこの作品に関する有用な提案やコメントのためにノースカロライナ大学グリーンズボロ校でダニエル・トッド、ヴィンセントシーカ、およびBrandie Erhmannに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
塩化水銀(II)Sigma-Aldrich429724毒性の高い
ギ酸アンモニウムSigma-Aldrich516961
ギ酸Sigma-AldrichF0507
水酸化アンモニウムフィッシャーA512-P500
HPLC水フィッシャーW5-4
HPLC アセトニトリルフィッシャーBP2405-1
HPLCメタノールフィッシャーA452-4

参考文献

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