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方法論記事

でMARCMベースのクローンのMechanosensationための行動アッセイ

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DOI:

10.3791/53537

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2015年12月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, College of the Holy Cross, 2School of Medicine, Georgetown University, 3Department of Biochemistry, Giesel School of Medicine, Dartmouth College, 4School of Medicine, Tufts University, 5Transgenomic Inc., 6Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMass Medical School

この記事について

サマリー

機械感覚に影響を与える新たな突然変異を特定するために、MARCM法によって生成された突然変異クローンのハエの剛毛の触覚刺激に対する行動反応を測定するアッセイを設計しました。これらの技術の組み合わせにより、他の方法では致命的となる機械感受性変異の同定が可能になります。

要約

そのため哺乳類の内耳の有毛細胞への構造的および機能的相同性のため、 ショウジョウバエの外部感覚器官を神経支配するニューロンはmechanosensationの研究のための優れたモデルシステムを提供します。このプロトコルは、mechanosensationを妨害する変異を同定するために使用することができショウジョウバエでシンプルなタッチの動作について説明します。 macrochaeteの触覚刺激は、ハエの胸郭に毛のいずれかの第1または第3の脚からグルーミング反射を誘発します。 （例えばNOMPCなど）メカノと、または反射弓の他の側面に干渉する突然変異は、グルーミング応答を阻害することができます。大人の行動の伝統的な画面は開発中の重要な役割を持っている変異体を逃したであろう。代わりに、このプロトコルは、exprで生成され、マークされたホモ接合変異体の細胞の限られた領域を可能にするために、抑制性細胞マーカー（MARCM）でモザイク解析でタッチスクリーンを組み合わせました緑色蛍光タンパク質（GFP）のession。異常行動応答についてMARCMクローンを試験することにより、より伝統的な方法では見逃されたであろうmechanosensationに関与する新しい遺伝子を検索するために致死P因子突然変異のコレクションをスクリーニングすることが可能です。

概要

人間は、触覚、圧力、振動、音波などの環境からの機械的な刺激を、神経系が処理できる感覚情報に変換する能力に依存しています。ヒトと無脊椎動物との間のメカノトランスダクションの全体的なメカニズムの特徴の多くは同じであり1、ショウジョウバエはメカノトランスダクションの分子メカニズムを研究するための有用なモデルとなっています。ショウジョウバエメラノガスターには、機械的刺激を活動電位に変換することができる2組の特殊な感覚器官(タイプIとII)が含まれています。I型機械受容器は、3つの支持細胞2に囲まれた単一の樹状突起または感覚突起を持つニューロンを有する。I型機械受容器には、剛毛機械受容器、聴覚敏感な脊索性器官(ジョンストン器官)、および翼の鼓動に関する情報を伝えるカンパニフォームセンシラが含まれます3。フライの背側を覆う剛毛は、I型器官の中で最も豊富で、簡単にアクセスできます。脊椎動物の聴覚とバランスに関連する有毛細胞の細胞外環境と同様に、ハエの機械感受性ニューロンを取り巻く支持細胞は、カリウム1の異常な濃度勾配を作り出す高カリウム内リンパを分泌します。哺乳類とハエの両方のシステムである機械感受性ニューロンは、この高い細胞外カリウムを利用して細胞を脱分極させます。体壁に向かって大毛が機械的に刺激されると、感覚ニューロンは、この細胞膜のカリウム脱分極によって駆動される活動電位のバーストで応答します4。剛毛を神経支配するショウジョウバエの感覚ニューロンは、構造と機能の両方で、脊椎動物の有毛細胞を含む他の生物の機械感受性細胞に似ています1,5。ショウジョウバエの外部感覚器官が実験的操作にアクセスできること、および研究者が利用できる豊富な遺伝的手法により、ショウジョウバエは機械感覚の分子基盤を調査するための優れたモデルシステムとなっています。

ハエでは、剛毛を神経支配する単一の感覚ニューロンの刺激が観察可能な行動反応につながります。異なる剛毛を刺激すると、刺激される剛毛に応じて、特異的で再現可能な行動反応が引き起こされます。触覚刺激を受けると、首を切られた野生型のハエは複雑なグルーミング反射を示し、刺激された剛毛の近くの領域をパターン化された脚の動きのセットで掃除します5-7。学習7または協調および自発運動活動5を妨げる既知の単一遺伝子変異に対してホモ接合性がある場合、ハエは機械的刺激に対して異常に反応する。したがって、このグルーミング反射は、特定の複製可能な行動に対する単一遺伝子変異の影響を研究するための有用なツールです。

単一のマクロヘータの剛毛の刺激に対する強固な行動反応は、メカノトランスダクションに関与する新しい遺伝子の同定を助ける可能性を秘めています。このプロトコルは、突然変異が機械感覚に干渉することを示す行動応答がないかどうか、突然変異ハエのコレクションをテストするために使用されています。スクリーニング用に選択された突然変異体コレクションでは、突然変異は成人期前に致死性を引き起こすため、従来の成人行動スクリーニングを使用してテストすることは不可能です。もともと、この致死的なpエレメントのコレクションは、クローンの細胞増殖欠陥をテストするためにFRT組換え部位と組み合わされていました。クローンは、成虫のハエが機能的な視力がなくても実験室で生き残ることができるため、特に目で作られました8。しかし、すべての機械感覚を取り除くと、成体が重度の協調性を失ったり、脱落前に死亡したりする可能性があります5。このプロトコルは、モザイクアプローチを使用して突然変異の致死性を回避し、成体期の試験を可能にします。Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker(MARCM)9と呼ばれる遺伝学的手法を用いて、限られた数の成虫のハエ感覚器官にホモ接合型変異体細胞を作製し、残りの生物はヘテロ接合体のままである。これらのMARCMハエは成虫になるまで容易に生存しますが、剛毛は目的の致死遺伝子に対してホモ接合体です。

MARCMは、ホモ接合変異細胞の領域が生成され、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現によってマークされることを可能にしますが、残りの生物はその特定の遺伝子座でヘテロ接合性のままであり、マークされていません9。MARCMは、個々のpエレメント変異を5つの一般的な遺伝要素と組み合わせます:上流活性化配列(UAS-GFP)の制御下にあるGFP、一般的なプロモーターの制御下にあるGal80リプレッサータンパク質(tub-Gal80)、一般的なプロモーターの制御下にあるGal4転写因子(tub-Gal4)、熱ショック制御プロモーターを介して発現するFRT組換え酵素、およびFRT組換え部位10.熱ショック活性化リコンビナーゼを介して有糸分裂組換えを駆動することにより、限られた数の細胞が突然変異に対してホモ接合体にされ、GFPでマークされます。GFPの発現は、染色体の野生型コピー上のGal80の存在により、ヘテロ接合細胞で抑制されます。

MARCMの熱ショックプロトコルは、ハエの剛毛の外部感覚器官で組換えを誘導するように最適化されましたが、生物の多くはヘテロ接合性のままであり、したがってGFPでマークされていません。このプロトコルを使用して生成されたモザイクフライは、鼻翼の表面のポスト鼻翼または背側の中央剛に最も頻繁にホモ接合性の突然変異を含んでいました。

この組み合わせの有用性を、既知の機械感受性変異体であるNOMPCとのグルーミング行動画面でテストしました。イオンチャネルである機械受容器電位なしC(NOMPC)は、ショウジョウバエ5,11-13の機械伝達経路の必須成分です。NOMPCは、陽イオンチャネル5の一過性受容体電位(TRP)スーパーファミリーに属し、ショウジョウバエ14,15の機械感受性チャネルとしての資格を得るためのすべての基準を満たしています:1)NOMPCはショウジョウバエ13,16-18のタイプ1の繊毛虫の先端で発現され、2)NOMPCヌル幼虫は触覚刺激に対して電気的反応を示さない13、3)触覚非感受性細胞におけるNOMPCの異所性発現は、機械的刺激に対する感受性を誘導することができる13、4)シュナイダー2細胞におけるNOMPCの異種発現は、機械感受性チャネル13を生じさせる、5)NOMPC成体変異体は、機械的刺激に対する応答に欠陥を示す5。この証拠から、NOMPC変異体クローンは、剛毛の機械的刺激に反応して、グルーミング反応の変化または抑制を示すと予測しました。

NOMPC変異を含むMARCMストックは、グルーミングアッセイの原理証明実験で使用するために開発されました。モザイクフライは、ホモ接合性のNOMPC変異細胞を含む大毛類の剛毛で刺激されました。我々は、マクロ毛の剛毛の刺激に続くグルーミング反応の抑制を期待した。その結果、試験した14匹の突然変異型剛毛バエのうち、反復刺激に対して1回の反応を示したのは2匹だけだったことがわかりました。ほとんどの人は、ホモ接合体変異体剛毛の刺激に反応しなかった。このMARCMベースの行動アッセイが、既知の機械感受性モザイク変異体において異常なグルーミング反射を生じることを確認したので、この技術は、追加の機械感受性変異のスクリーニングに使用することができます。

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プロトコル

1.十字MARCMのハエを生成するには

  1. 22℃で、または標準のショウジョウバエメディアコーンミール糖蜜培地（0.13％Tegosept; 23.5グラム/ Lの酵母; 60グラム/ Lのコーンミール、60ミリリットル/ Lの糖蜜; 4ミリリットル/ Lの酸ミックス6.5グラム/ Lの寒天）上のハエを維持12時間の明/暗サイクルです。
    注：標準温度よりも低い、健康MARCM-株を維持するために使用されます。これは14日に卵と成人期の間の発達の時間を延長します。
  2. 上流活性化配列（UAS-GFP）、GAL80リプレッサータンパク質、GAL4転写因子の制御下（GFPを必要な遺伝的要素を含むMARCM対応在庫から - （8日齢約1）処女雌を使用してくださいリコンビナーゼ、およびFRT組換え部位を駆動する熱ショック）。
    注：私たちのMARCMすぐ銘柄は以下の遺伝子型含まれていますelavGal4、UAS-CD8-GFP、HS-flipaseを。 FRT40A、tubGal80 / CYO。 tubGal4 / TM3Sb。
    注：特定のFRT部位は、突然変異の位置に依存しますゲノムインチ例えば、FRT40Aは、NOMPC（MARCMプロトコルの詳細については10を参照のこと）などの第2染色体の左腕、上の変異をテストするために使用されます。
  3. 目的の変異とそれに対応するFRT部位含ま男性にクロスMARCM対応の処女雌（; NOMPC3、FRT40A / CYO;例えば、W-を+ / +）。効果的なMARCM誘導に制御するために、同じFRT部位を含む男性のハエを使用して第2のクロスを設定したが、突然変異のありません。十字架で1男性：女性5のおおよその比率を使用してください。

2.時限産卵

  1. ハエは、少なくとも一晩交配させた後、新鮮な培地で新しいバイアルに大人を移動します。ハエが再び新しいバイアルに十字架を転送する前に、約4時間、暗い環境で卵を産むようにします。産卵期間の開始時間と終了時間に注意してください。
    注意：4時間のintervaの終了前に、メディア上の卵の数が多いがあるように表示されたときに短い間隔が許容されますリットル。
    1. 熱が後で衝撃を与えたことを摂氏22度で12時間の明/暗サイクルで十分な卵の数（約20以上）とストアでバイアルを保管してください。
      注：メディア上の卵の数が少ないバイアル（約20未満）は行動試験のために飛ぶと効率の利益のためにそれは彼らがさらなる試験のために保持されないことをお勧めします大人の十分な数が得られることはほとんどありません。
      注意：私たちのハエは、午前8時から午後8時までにライトで発生します。午後8時と午後8時 - 午前零時 - したがって、我々は、通常4〜時限交配を行い、夕方の時間点が高い卵密度につながる発見しました。ハエが暗いキャビネット内に室温で産卵した後、インキュベーター中で、通常の明暗サイクルを乱さないように、次の日にインキュベーターに戻します。

3.有糸分裂組換えを誘導するために熱ショックを実行します

  1. 約85 - 産卵後100時間、場所のV1時間37℃で水浴にIALS。水位がバイアル内のメディアの高さの上に達したが、完全に溺れてから幼虫を防ぐためにバイアルを水没しないことを確認してください。
  2. 水浴からバイアルを取り出し、室温で1時間の回復期間を可能にします。
  3. バック1時間、摂氏37度の水浴中にバイアルを置きます。
  4. 羽化するまで22℃で12時間の明/暗サイクルでインキュベーターで水浴とストアからバイアルを取り外します。

行動試験のための準備4。

  1. 羽化後、氷上でハエを麻酔。 MARCMのためのすべての遺伝的要素を含み、GFP発現マーキングされたクローンは、おそらく親銘柄で使用観察可能な表現型マーカーに基づいて観察される示す遺伝子型を有するハエを選択します。虹彩切除術ハサミでハエを斬ります。
    注：例えば、私たちは遺伝子マーカーなしでハエのためCYO（カーリー翼）及びSb（無精ひげ毛）同定するために、選択されまし​​たモザイク領域を作成するために必要なすべての遺伝的要素を含むことになる年度ハエは、GFPでマークされました。
    注意：斬首が刺激されると飛んから大人を防止する必要があります。
  2. 閉じられた、湿った環境でのヘッドレスハエを置き、約10可能に - 回復の20時間を。右自身さらなる試験のため乱さハエをのみを使​​用します。テストは断頭の30時間以内に飛びます。

5.行動試験

  1. 蛍光解剖顕微鏡下で断頭ハエを観察することによって、毛外部感覚器官のGFPでマークされたホモ接合クローンを同定します。剛毛名および左側または右側を記録します。任意の潜在的なバイアスを排除するために、毛刺激を行うラボメンバーは毛、野生型または変異体の遺伝子型に盲目でなければなりません。
  2. 硬い髪や細かい鉗子でフライ本体に向かって毛と脚の再を観察マークされたGFPを偏向させることによりグルーミング反射を引き出しますsponse。彼らの足を移動しないハエに刺激し、ゼロのスコアを毛に応じて自分の足を持ち上げハエに1のスコアを与えます。
    注：以前の研究6,7は、特定の毛を刺激することによって誘発された足の応答を特徴としています。これは、各剛毛に応答足とその特定の毛の刺激に反応するハエの割合が含まれています。私たちは私たちがVandervorstの分類6に基づいて対応することが期待足の動きを記録しました。
  3. 離れて2分間隔の5件の試験を実施します。

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結果

このプロトコルの成功は、主にテスト可能なハエの全収率に依存して、熱ショックの効果は、有糸分裂組換え、2分間隔で刺激されたハエにおける強固な行動反応を得る能力を誘導します。胚の推定12.5％が必要MARCM要素およびG​​FP発現の可能性を有する孵化する成人の推定16.67％を含有することを考えると、それは時限中の卵の高い数を得ることが重要である産みます。成功したタイミングの例を図1Aに示されているプロトコールの残りの部分に使用される4時間の間隔にわたって置きます。

ヒートショックを85に行われた場合 - 産卵後100時間を、GFP標識された外部感覚器官の収率が最もハエ標識macrochaetaeのうちの1つを有するとともに、最高です。関心の多くの領域がtestablの拠点でホモ接合細胞を含んでいてもよいです熱ショックを背中心とポスト鼻翼と、この期間内に実行された電子の毛が（

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ディスカッション

このプロトコルは 、ショウジョウバエでmechanosensationに影響を与える変異をスクリーニングするために、大人の行動アッセイを利用しています。突然変異体のコレクションは、成人としてのスクリーニング不可能に致死P因子の変異が含まれているため、このプロトコルは最初のリーと羅によって記述複雑な遺伝的手法を利用しています、（1999）、成人の致死性を回避するための呉とルオプロトコル、（2006）などの詳細。 MARCMは、ホモ接合細胞のクローン領域を生成するために、相同染色体間有糸分裂組換えを誘導します。これらの領域があるため、有糸分裂組換え時に発生するリプレッサータンパク質、浴槽-GAL80の損失のGFPでマークされています。特定の遺伝子座でホモ接合性である細胞を生成するためにMARCMを使用することにより、遺伝子機能は、このホワイトペーパーで説明した行動アッセイを含む種々の方法を使用して成虫に研究することができます。

数とBのできる特定の遺伝子の両方を制限する主な要因Eテストは、ハエのゲノム内のFRT部位の存在です。フライ株式は、目的の変異...

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開示事項

著者は全く競合する金融利害関係はありません。

謝辞

著者らは、ハエの株式の寛大な共有のためのブルーミントンストックセンター、Liqun羅、チャールズZuker、とリリーとユウ農月に感謝し、資金調達のために、以下の希望：（JDとSW）はSOMAの-URM、学士フォード学部夏フェローシップを、レニーとアンソニー・M・マーロン、MD '63夏の研究フェローシップ（CLおよびDLに）（SW）は、BD社サマー研究員を経て（TO）ジェームズ・C. '75とジェーンColihan夏の研究フェローシップ（DLに） （TO）にホーリークロス、ストランスキー財団サマー研究員の大学の卒業生/親サマー研究基金。ラボですべての作業をサポートするためのホーリークロスカレッジで生物学科と学部長のオフィスに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ブリューワーズイースト(25ポンド)MPバイオメディカル ICN90331225 フライフード
トウモロコシ(25ポンド)MPバイオメディカル ICN90141125 フライフード
寒天 (1 lb)MoorAgar Inc.41004フライフード
テゴセプト (5 kg)ジェネシー20-259フライフード
糖蜜 (1 ガロン)シュガーミル ブランド - トムセン フード サービス0 2625フライフード
プロピオン酸フィッシャーA258-500フライフード
リン酸フィッシャーA260-500フライフード
ショウジョウバエ バイアル、ナロー (PS)ジェネシー32-109フライカルチャー
6オンススクエアボトムボトル(PP)ジェネシー32-130フライカルチャーフラ
ッグ - プラスチックフライボトルジェネシー49-100フライカルチャーレー
ヨンボール、ラージジェネシー51-100フライカルチャー
ショウソフィラー、ナロージェネシー59-168フライフードプレパレーション
ショウソフィラー、ボトルジェネシー59-170フライフード準備
8A-C /ギア駆動ラボスターラー、cクランプマウント付き  1/15 HP、700 rpm可変速、115 V、50/60 Hzクリーブランドミキサー8A-Cフライフード準備
ウォータージャケットケトルフライフード準備
日周成長チャンバーForma 科学的な温度と光/暗いサイクル制御
ウォーターバスVWR熱用ショック
マイクロシザーズ ファインサイエンスツール 15000-08ヘッド取り外し用
Fluroscence 解剖顕微鏡ZeissSteREO Discovery V8 GFPキューブ(KSC295-814D)バンドパスフィルター付
Fluroscence光源ZeissX-Cite 120光ファイバーライトパイプは、これを簡単に構成することができます 
スコープ用カメラツァイスAxioCam ICc1
画像取得ソフトウェアツァイス
冷たいアンテシア用アイスバケツ
自家製の冷たいアンテシアトレイ冷たいアンテシアの斬首用
湿気の多い環境での脱孝ハエの回復のためのプラスチックボックス
トレー

参考文献

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