方法論記事

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

DOI：

10.3791/53547

⸱

2016年2月18日

 ,  ,  , 
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Advanced Imaging Core, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ポストエンベッドイムノゴールド法は、特定の分子の細胞内局在を高解像度で分析するための最も効果的な方法の一つです。ここでは、網膜リボンシナプスにおけるグルタミン酸受容体を定量的に解析するためのプロトコールについて述べます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

網膜神経節細胞(RGC)は、双極細胞から興奮性グルタミン酸作動性入力を受け取ります。RGCのシナプス興奮は、NMDA受容体(NMDAR)およびAMPA受容体(AMPAR)によってシナプス後に媒介されます。生理学的データは、RGCのグルタミン酸受容体がシナプス後だけでなく、シナプス周囲またはシナプス外膜コンパートメントでも発現することを示しています。しかし、RGCシナプスにおけるグルタミン酸受容体の正確な解剖学的位置は決定されていません。中央シナプスにおけるグルタミン酸受容体の高分解能定量分析は広く採用されていますが、このアプローチは網膜での成功は限られています。私たちは、膜受容体の分析のためのポストエンベッドイムノゴールド法を開発し、網膜リボンシナプスにおけるこれらの受容体の数、密度、および変動性を推定することを可能にしました。ここでは、1)網膜固定の調製の成功、2)凍結置換、3)埋め込み後の免疫金電子顕微鏡(EM)免疫細胞化学、および4)リボンシナプスにおけるグルタミン酸受容体の定量的可視化に必要なツール、試薬、および実践的な手順について説明します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

グルタミン酸は網膜1における主要な興奮性神経伝達物質です。双極細胞2からのグルタミン酸作動性シナプス入力を受けた網膜神経節細胞（RGCを）は、脳に視覚情報を送信する網膜の出力ニューロンです。生理学的研究は、RGCのシナプスの励起がNMDA受容体（NMDARを）およびAMPA受容体（AMPA受容体）3,4,5によってシナプス後部媒介されることを示しました。網膜神経節細胞における興奮性シナプス後電流（EPSCs）はAMPA受容体とNMDARを3,5,6,7,8によって媒介されるが、RGCを上の自発的なミニチュアEPSCs（mEPSCs）が唯一のAMPA受容体媒介成分4,5,9を示します 。しかし、グルタミン酸の取り込みを低減することがRGCの樹状突起上のNMDARをが興奮性シナプスの外側に位置することができることを示唆し、自発EPSCs 5 NMDAR成分を明らかにしました。膜関連グアニル酸キナーゼなどPSD-95など（MAGUKs）はグルタミン酸受容体およびイオンチャネルを含むクラスタの神経伝達物質受容体、シナプス部位でのsが、また明確なシナプス下発現パターン10,11,12,13,14を示します 。

最近の数十年にわたって、共焦点免疫組織化学およびプレ埋め込み電子顕微鏡（EM）免疫組織化学は、膜受容体の発現を研究するために使用されてきました。共焦点免疫染色は、受容体の発現の幅広いパターンを明らかにしているが、その低解像度は、それが不可能な細胞内位置を区別するために使用することができます。哺乳動物の網膜の前埋め込 ​​むEM研究は、NMDARサブユニットはコーン双極細胞のリボンシナプス15,16,17でのシナプス後要素に存在していることを示しています。これは、生理学的証拠には明らかとは対照的です。しかしながら、反応生成物の拡散は、プレ埋め込み免疫法における周知のアーチファクトです。したがって、このアプローチは、通常、統計的に信頼性の高いデータが得られていないとシナプス外膜18,19,20,21対シナプス膜への局在化との間の区別を除外することができます。に一方、生理学的および解剖学的データは、RGCを3,5,7,9,22上のAMPA受容体のシナプス局在と一致しています。したがって、網膜リボンシナプスにおけるグルタミン酸受容体とMAGUKsは、シナプス後にもperisynapticまたはシナプス外膜区画にだけでなく、ローカライズされています。しかし、網膜リボンシナプスにおけるこれらの膜タンパク質の高分解能定量分析が依然として必要とされています。

ここでは、NMDARサブユニットのシナプス下局在を調べるために、包埋後のEMの免疫技術を開発し、ラットのRGCにシナプスでのこれらのタンパク質の数、密度および変動性を推定することによって、続いAMPARサブユニットとPSD-95は、コレラ毒素サブユニットB（CTB）を用いて標識逆行性トレーシング方法。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

お手入れと動物の取り扱いは、NIH動物実験委員会のガイドラインに従いました。 12時間の明：暗サイクル上丘を介して、左右1から1.2パーセントCTBを注射生後日（P）15-21 Sprague-Dawleyラットは、12で維持しました。

1.網膜組織固定

  1. 解剖顕微鏡、非常に微細な先端、はさみ、セルロース濾紙、プラスチックピペットと顕微鏡スライドと2鉗子：以下の材料と道具を組み立てます。
  2. 2.0ミリリットルハロタン（吸入麻酔薬）との密室でラットを麻酔。つま先のピンチの後に後足の撤退の欠如、または瞬目反射の欠如：これらの方法で十分な麻酔を決定します。そして、ギロチンですぐに首を切ります。 pH7.4の0.1Mリン酸緩衝液（PB）に4％パラホルムアルデヒドを含有するガラス皿の中アイリスハサミと場所で目を削除します。
  3. 解剖顕微鏡を使用して、コーンを除去眼球の前部を切断することにより、EA。鉗子で内網膜面からレンズと硝子体を除去します。
  4. 網膜は、眼杯から特定されるまで2鉗子で強膜を剥離。
  5. カミソリで厚さ200μmのストリップ、およびpHシフト固定の対象に - 100にすぐに網膜をカット。
  6. 室温で20分 - 10のためのpH 10.5で30分間、その後、4％パラホルムアルデヒドを加えた0.01％のグルタルアルデヒド - 20のためのpH6.0の0.1 M PB中4％パラホルムアルデヒドで網膜ストリップを修正しました。
  7. （4℃でpH7.4）に0.15 mMのCaCl 2をPBで数回洗浄した後、0.1で（30％でO / N、次に、10％、20％、30％、各60分）Mグリセロール網膜ストリップcryoprotect PB置換を凍結する前に。

2.凍結置換

注：この凍結置換法は、以前公開されたプロトコル19,20から変更されています。また、機器が（手袋を着用）非常に冷たいことが重要です。 O楽器で触れたときtherwise、組織が部分的に解凍することがあります。これらの工程の全ては、AFSチャンバー内で行われ、器具は、チャンバの縁の上に移動することができることはありません。同様に、AFSで使用されるすべての化学物質の適切な冷却が必要です。

  1. EMの凍結保存器（CPC）で-184℃の液体プロパンにおける網膜ストリップをプランジ凍結。細かいブラシを使用して、（ブラシを使用して、余分なバッファをオフに吸い上げる）急落棒の端に行く金属スタブに取り付けられた両面テープの小片にサンプルを置きます。
  2. 液体プロパンにロッドを急落し、約5秒間そこに保持し、その後、液体窒素で満たされている小型の搬送室を使用した自動凍結置換楽器（AFS）に転送（ 'LN 2は、クライオ移送容器を冷却しました'）。
  3. AFSに凍結サンプルおよび器具（鉗子やメス）を配置した後、それ自体のためにチャンバ内の機器を冷却しますveral組織に触れる前に、分、または（液体窒素を充填（） 'LN 2は、クライオ移送容器を冷却'）小搬送チャンバ内に数秒間器具の先端を配置することによって、それらを冷却します。
  4. AFSでたら、細かいメスを使用して、スタブからのサンプルとテープを取り外します。また、窒素ガス流量制御を維持し、TFこれらの手順の間オープン（TFは「LN 2蒸発器のためのレギュレータ制御」と記載されています）。
  5. （AFSを設定する前に、 すなわち ）フラット埋め込 ​​みホルダーに凍結組織を配置する前に、透明なプラスチックシートから薄い円をカットし、各ウェルの底部を裏打ちするようにホルダーの底部に配置します。これが終わっ重合試料ブロックの比較的容易に除去することができます。
    注：以前、私たちはフラット埋め込み所有者に別の方法を使用し、二重ライヘルト+ゼラチンカプセルを採用（ペトラリーアとWenthold、1999を参照してください）​​。 20。
  6. = 4°C /時間（11.3時間）、T2によって32時間、S1は=上昇温度のためにT1 = -90°C〜-45°Cで50時間、S2のために：AFS（楽器の用語を使用して）で、次の自動シーケンスを使用します。 =、5°C /時間（9時間）で40時間（合計= 142.3時間）のためのT3 = 0°Cの温度を上昇させます。前時限シーケンスを開始する（-90℃で）AFS内のサンプルを配置するために4時間 - それは2を取ることができます。
  7. AFSで> 32時間、-90℃でメタノール中1.5％酢酸ウラニルで凍結切片を浸し。フラット埋め込みアルミホルダー（AFSに3フィット）で7ウェルのそれぞれに組織の2個（一般的に）を配置します。
    1. ウェル中の酢酸ウラニル/メタノールへの組織+テープを置き、テープから組織を除去することが非常に困難である場合、直前に浸潤（例えばLowicryl HM20など）先頭包埋媒体に、後でテープを取り外します。
  8. 次いで、時間当たり-45℃（+ 4℃の温度を段階的に増加させます;自動シーケンスで）。
  9. 各フラット埋め込むホルダーから古い溶液を除去するために先の細いプラスチックピペットを使用して、その後、予備冷却新鮮なメタノールを追加するために、別の標準的なプラスチックピペットを使用することにより、予冷メタノール中のサンプルを3回洗浄します。
  10. 1および2：次に、同じ方法を使用して、例えば1で培地（HM20は/メタノールを埋め込むように、低温埋め込み樹脂と徐々にサンプルを浸透2時間、純粋な樹脂に続く2時間、1、それぞれ、その後樹脂を変更しますそして、）O / Nを保ちます。
  11. ただ、ウェルの上端に到達するために、樹脂のレベルを調整し、翌日再び樹脂を変更します。
  12. サンプルを重合（-45°C自動シーケンスで0℃まで、時間当たり+ 5℃）40時間、UV光で。
  13. その後、AFSからのサンプルを削除します。一般的に、サンプルブロックは、まだ色でいくつかのピンク色を示しています。 RT Oでの化学ヒュームフード内の蛍光灯に近いサンプルを、置き/ N以上彼らまでアプリ耳完全にクリア。

3.包埋後のEMイムノゴールド免疫細胞化学

注：23,24,25 に記載のように包埋後の免疫細胞化学を行います。

  1. 1％トルイジンブルーで1μmのウルトラミクロトームを持つセクション、染色切片を切断し、断面の向きのためにそれらを検討します。切片の最適な横断面を達成するために組織ブロックを向けます。
  2. ウルトラミクロトームで厚さ70nmの超薄切片をカットし、ホルムバール炭素でコーティングされたニッケルスロットグリッド上にそれらを収集。
  3. ウォッシュは、トリス緩衝食塩水3回（TBS、0.05 Mトリス緩衝液、0.7％のNaCl、pHは7.6）洗浄した蒸留H 2 Oで1時間をグリッド。
  4. 30分間、TBS中の5％BSAの20μlの滴でグリッドをインキュベートし、次いでヤギ抗CTB（1：3000）を含む混合物の20μlの滴内の1つのNMDARサブユニット（抗ウサギGluN2A 1時50分にし、抗体を、GluN2B 1：30）、または抗ウサギGluA2 / 3（1：30）2％BSAおよび0.02 MのNaN 3 O / NをRTで有するTBS-トリトン（TBST、0.01％トリトンX-100、pHが7.6）です。
  5. 5分間TBS（pHは8.2）、続いて10、10、および20分、のためのTBS（pHは7.6）の3つの別々の滴（20μlの）上のウォッシュグリッド。
  6. TBSTで18 nmの金粒子に結合された10 nmの金粒子とロバ抗ヤギIgG（1:20）に結合されたロバ抗ウサギIgG（1:20）を含有する混合物の液滴に2時間（20μL）のためのグリッドをインキュベート2％BSAおよび0.02 MのNaN 3で（pHは8.2）。
  7. 超純水で、その後、5、5、および10分間、TBSの20μlの滴液（pH 7.6）でグリッドを洗浄し、それらを乾燥させます。
  8. 対比は、それぞれ、暗条件下で8 5分間蒸留水で5％の酢酸ウラニルおよび0.3％クエン酸鉛で2 Oをグリッド。
  9. 三重標識実験のために、グリッドをインキュベートO /抗ヤギCTBの混合物の20μlの滴（1：3,000）で、室温でN、抗マウスPSD-95（1：100）および抗ウサギGluN2A（1 ：50）。その後、2に2時間のグリッドをインキュベート2％BSAおよび0.02 MのNaN 3との TBSTで18、10、5 nmの金粒子に結合したIgGの混合液（pH 8.2）の0μlの低下。抗体インキュベーションの間および後の洗浄と対比のための二重標識と同じ手順を保管してください。
  10. コントロールは、二次抗体は、単独で適用された中で行いました。
  11. ビューグリッドEM上や画像をデジタル化。それが24必要な場合のみ、明るさとコントラストのためのAdobe Photoshopの6.0での最終的な数字を処理します。

4.定量

  1. 手動でランダムに25,000Xの倍率でIPLの全深さをフォトモンタージュ、8,000X倍率に穴や亀裂なし内網状層（IPL）の領域を選択します。
  2. 彼らはa）は逆行性輸送CTB信号（大きな金粒子）を含有し、b）の展示、明確に定義された膜は、裂け目、およびシナプス後密度は、c）は、少なくとも二つの小さな金の一部が含まれている場合錐体双極ダイアドでRGCの樹状突起を特定PSD内icles、またはシナプス形質膜に沿って複数の小さな金粒子。
  3. 定量分析のために、上記の基準に基づいて、55 RGCの樹状突起、 - 45を収集します。
  4. PSDおよびNIH ImageJソフトウェアを有する個々のRGCの樹状突起のシナプス形質膜の長さを測定します。形質膜26のための9ナノメートル- 7の平均厚さに基づいて、膜関連のような膜を10nm内の金の粒子をカウントします。
  5. リニアマイクロメートル当たりの金粒子の数（金/μm）と粒子密度を計算します。各金粒子の中心とPSDの真ん中（シナプス場所の場合）または（シナプス外の場所のための）PSDのエッジ間の距離を測定します。
  6. ソフトウェアにより統計分析を実行します。手段を比較するために両側t検定を使用してください。意義P <0.05を締結。特に断りのない限り、報告値は、として±SEM 18を意味します 。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以前に24,25説明したように、ここで示された結果は、ラットの網膜におけるRGCの樹状突起上GluA 2/3とNMDARをの著しく異なるシナプス下局在パターンを示しています。 RGC樹状プロファイルでGluA 2/3免疫粒子の77％は、最も中心的なシナプスと同様に、PSD（ 図1A）内に位置していました。しかし、NMDARをは、いずれのシナプスまたはextrasynaptically位置していました。 GluN2Aの免疫金粒子の83％は、PSDに局在した（ 図1C、図2A、図2B）、優先OFFシナプス、及び金粒子でのPSD（ 図2C）の中心に、より濃縮しました。対照的に、GluN2B用粒子標識（96％）の大部分は、端から180 nmのピークの粒子密度と、主にシナプス形質膜に沿って分布PSD（ 図1B、2A、2B）の外側に配置されましたPSD（ 図2B）。特に、GluN2BはONのシナ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1）短いと弱い固定、2）、3）ポスト埋め込み免疫染色、および4）定量化置換をフリーズ：私たちは、埋め込み後イムノゴールドEM成功定量するための4つの技術を記載しています。

EMの免疫は、超薄組織切片中の特定のタンパク質の検出を可能にします。金粒子で標識された抗体は、直接EMを使用して可視化することができます。膜受容体のシナプス下局在を検出する際の強力な一方で、EMの免疫は、技術的に困難であること、および組織固定および処理方法の厳密な最適化を必要とすることができます。

膜の完全性及び抗原性の間の最適なバランスを取るために、我々は別の固定方法と時間をテストしました。例えば、中枢シナプス19,20で包埋後のEM NMDARに使用される成功したプロトコルは、網膜にNMDARの免疫反応性を検出することができませんでした。この研究は、に穏やかな固定と短いインキュベーション時間を採用しました強い、長期の固定16後NMDA受容体の抗原性の還元を避けます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示していません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、国立衛生研究所の難聴やその他のコミュニケーション障害に関する神経疾患・脳卒中研究所（NINDS）と国立研究所（NIDCD）、（NIH）の学内プログラムによってサポートされていました。私たちは、NINDS EM施設と支援のためのNIDCD高度なイメージングコア（コード＃ZIC DC 000081から03）をお願いいたします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
パラホルムアルデヒドEMS15710
グルタルアルデヒドEMS16019
NaH2PO4ΣS9638
Na2HPO4σ7782-85-6
CaCl2σC-8106
BSAΣA-7030
Triton X-100ΣT-8787
NaOHSigma221465
NaN3JT BakerV015-05
グリセロールGibco BRL15514-011
Lowicryl HM 20Polysciences15924-1
Tris-BaseFisherBP151-500
TrisFisher04997-100
Anti-GluN2AミリポアAB1555P希釈 1/50
抗GluN2BミリポアAB1557P希釈 1/30
抗GluA2/3ミリポアAB1506希釈 1/30
アンチ PSD-95ミリポアMA1–046希釈 1/100
ロバ反ウサギ IgG-10 nm 金粒子EMS25704希釈 1/20
ロバ反マウス IgG-10 nm 金粒子EMS25814希釈 1/20
ロバ反マウス IgG-5 nm 金粒子EMS25812希釈 1/20
ロバ反ヤギ IgG-18 nm 金粒子ジャクソン免疫研究705-215-147希釈1/20
Formvar-カーボンコーティングされたニッケルスロットグリッド。EMSFCF2010-Ni
酢酸ウラニルEMS22400-1
メタノールEMS67-56-1
クエン酸鉛ライカ
ライカ EM AFSライカ
ライカ EM CPCライカ
ウルトラミクロトームライカ
日本電子 1200 EM日本電子液体
窒素 ロバーツ酸素
プロパンロバーツ酸素
CTBリスト生物研究所1041 - 1.2%
抗CTBリスト生物研究所703希釈1/4,000

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
  2. Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
  3. Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
  4. Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
  5. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  6. Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
  7. Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
  8. Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
  9. Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
  10. Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350(1995).
  11. Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
  12. Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
  13. Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
  14. Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
  15. Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
  16. Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
  17. Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
  18. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
  19. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).
  20. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
  21. Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
  22. Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
  23. Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
  24. Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
  25. Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
  26. Peters, A., Palay, S., Webster, H. The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , Oxford University Press. New York. (1991).
  27. Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
  28. Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
  29. Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
  30. Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
  31. Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).
  32. Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
  33. Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
  34. Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
  35. Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
  36. Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

NMDA

関連記事