繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価

サマリー

一次繊毛は、さまざまなシグナル伝達経路に影響を与えます。哺乳類の蝸牛は、平面細胞極性(PCP)シグナル伝達を調べるのに理想的です。繊毛の機能障害は、蝸牛の成長、細胞パターン化、有毛細胞の配向、PCPの読み取りに影響を与えます。私たちの目標は、表現型解析、免疫組織化学、走査型電子顕微鏡法を通じて、マウス蝸牛のPCPシグナル伝達を分析することです。

要約

近年、一次繊毛は、多数のシグナル伝達経路に影響を与えることにより、発生と疾患の主要な調節因子として浮上しています。繊毛機能と関連していることが示された最も初期のシグナル伝達経路の1つは、平面細胞極性(PCP)シグナル伝達とも呼ばれる非標準的なWntシグナル伝達経路でした。脊椎動物の発達における平面細胞極性(PCP)シグナル伝達の影響を研究するのに最適な場所の1つは、哺乳類の蝸牛です。マウス蝸牛のPCPシグナル伝達の混乱は、蝸牛の伸長、細胞パターン形成、および有毛細胞の配向を混乱させますが、これらはすべて繊毛機能障害の影響を受けます。このプロトコルの目標は、表現型分析、免疫組織化学、および走査型電子顕微鏡法を通じて、発生中の哺乳類蝸牛におけるPCPシグナル伝達の分析を説明することです。輻踽骨と伸展の欠陥は、蝸牛管の短縮および/または細胞パターンの変化として現れ、これは発生中のマウス変異体からの解剖後に定量化できます。立体線毛束の配向とキノシリアの長さまたは位置の変化は、免疫蛍光法または走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して観察および定量できます。細胞シグナル伝達経路やその他の生物学的現象における繊毛タンパク質の役割についてより深く理解することは、細胞生物学や発生生物学の理解、さらには標的治療戦略の開発にとって非常に重要です。

概要

一次繊毛は、ほとんどの哺乳動物細胞の表面から延びる長い微小管ベースの付属しています。一次繊毛常にセルごとに複数存在し、そのうちの多くの場合、運動性繊毛と混同しており、その目的は、膜の表面を横切って流体を移動させることです。一次繊毛は、対照的に、感覚的役割を採用し、その結果、また感覚繊毛と呼ばれます。いったん長い忘れて、この細胞小器官は、最近、ヒト遺伝病¹の多数との会合の結果として「再発見」されました。理想的には、シグナリングオルガネラとして位置付け、一次繊毛は、組織の恒常性と疾患ではなく、開発の²の間だけでなく、重要であるそれらの多くは、多数のシグナル伝達経路を調節することが示されています。

繊毛機能不全に関連することが示され、最初のシグナル伝達経路の一つは、平面内細胞極性（PCP）経路としても知られている非標準Wntシグナル伝達経路、ました > 3。最初にショウジョウバエで同定され、このシグナル伝達カスケードは、胚形成のために重要です。特に収束と拡張のプロセスのために上皮⁴の平面内での細胞の正しい向きのため。調節タンパク質のコアセットのシーケンシャルシグナル伝達は、最終的に細胞骨格の再編成につながると平面⁵における上皮細胞の協調分極が生じる方向性の手がかりを変換します。収束と拡張のプロセスは絶対に細長くする蝸 ​​牛管のために、正しい携帯パターニング⁶のために必要とされます。これはPCP経路の活性化を介して調節されるように、蝸牛のPCP変異体の最も印象的な表現型の一つが無秩序な感覚上皮^7に短縮蝸牛管です。正確にこれを調節する方法が解明されないままでも同様に、繊毛を欠くマウス変異体は、また、そのような収束と拡張表現型^{8,9を示します} 。

ve_content ">収束と拡張のプロセスは蝸牛管の伸長、および蝸牛管の中の感覚上皮の細胞パターニングのために重要であるため、開発蝸牛は脊椎動物の開発中にPCPシグナル伝達を検討する中で理想的な器官である。器官コルティ、その行蝸牛管を特殊な感覚上皮に与えられた用語は、一様に^10を機能させるには蝸牛のために配向させる必要があり、非感覚支持細胞と機械刺激有毛細胞から構成されている。機械刺激有毛細胞がそのように理由で呼ばれていますクチクラ板から延びるstereociliary束それぞれの感覚有毛細胞¹¹の（先端面）。mechanosensationのと不動としての命名法にもかかわらず、一次トランスデューサとしてこれらの行為は、実際に変更されたアクチンフィラメントベースの微絨毛で構成されている。各山形の髪の中でバンドルは、不動の3行は非常に注文し、定期的なPAで構成されています階段のケース状にttern。実微小管ベースの繊毛、kinociliaは、stereociliary ^束 12の開発と方向のために必要とされていると呼ばれます。各有毛細胞の際に、一つの運動毛は、物理的に不動の一番高い行に中央に隣接して位置する、不動毛束に取り付けられています。運動毛の正確な機能は不明である、と1の仮説は、彼らが微絨毛¹²から成熟するにつれて運動毛が形に不動を「引っ張る」ということです。脊椎動物では、蝸牛内kinociliaは一過性のみ存在し^{、11,13,14を聞く}の開始前にマウスでの有毛細胞から退避。

深刻な短縮蝸牛管、誤形成され、誤指向stereociliaryバンドルだけでなく、誤位置付け基礎体^8,9の途上蝸牛結果の繊毛の完全な損失。機能的な繊毛はちょうど繊毛軸糸で構成されていません。繊毛に関連した多くのタンパク質機能は、基礎体温、移行帯、または繊毛軸糸¹⁵として繊毛関連のサブドメインに局在する複合体で起こります。中心体の母中心小体由来基礎体温は、また、細胞体に繊毛から離れて延びている微小管のための微小管組織化の中心であり、細胞内輸送、ならびに繊毛輸送を調節することができます。毛様体遷移ゾーンは、繊毛機能が毛様体化合物¹⁶のインポートおよびエクスポートを整理するのが規制されている別の領域です。

正確なメカニズムは^、17不明であるものの、複数の研究は、繊毛および非標準Wnt（PCPシグナリング）との間の接続を確認しています。毛様体およびPCP遺伝子の冗長性と一般化された細胞異常に細胞極性の感度は、それが困難な直接PCP-特定の赤字に変異をリンクすることを可能にします。 PCPシグナル伝達の読み取りアウトの一つは、基礎体温とprimarの位置付けでありますしたがって、2次欠陥から、主なものを分離するのy繊毛は、困難です。ゼブラフィッシュとマウスの変異体におけるいくつかの研究は^{、18-20シグナリング}繊毛およびWnt間の接続を示唆していません。データの矛盾は、種、組織、またはWntシグナル伝達に向かって毛様体の貢献の時間依存性の違いを反映しているのかもしれません。基礎体が機能している場合はさらに、正常なWnt応答性が保持されることがあります。細胞シグナル伝達経路中の毛様体タンパク質の役割をより深く理解し、他の生物学的現象は、細胞および発生生物学の我々の理解のためだけでなく、標的治療戦略の開発のために重要です。

プロトコル

CO ₂吸入と頸椎脱臼を経由して、最も一般的に、機関投資家や政府のガイドラインおよび規則に従ってすべての動物を使用し、安楽死させます。

試薬の調製

注：前初めに、分析グレードの化学薬品を使用して、すべての試薬を準備します。特に断りのない限り、分子グレード蒸留および脱イオン水を使用してソリューションを作成します。

1. _H 2 Oの1 Lで、8グラムのNaClを溶解させることによって1×PBSの1 Lを作る0.2グラムのKCl、1.44グラムのNa ₂ HPO ₄および0.24グラムのKH ₂ PO _4：リン酸生理食塩水（1×PBS）をバッファリングHClでpHを7.4に調整します。 PBSは、無菌である必要はなく、室温で保存することができます。このバッファはのCaCl ₂または_MgCl 2をせずに作られていることに注意してください。
2. パラホルムアルデヒド（4％PFA）：換気ドラフト内で1×PBS中のPFAの4％溶液を調製します。 1×PBSの1リットルにパラホルムアルデヒド粉末の40グラムを追加します。約60°Cに溶解する、攪拌および熱、そしてゆっくりとNaOHをpHを上げるために滴下追加します。粉末が溶解した後、HClでpHを7.4に再調整します。 0.45μmのフィルターを通して濾過し、アリコートを凍結します。各実験のために新鮮なアリコートを解凍。
3. トリトン緩衝液：0.1 Mトリス-HClを調製液（pH7.5）、0.15MのNaCl、0.1 MのTris-HCl（pH7.5）を1Lに8.77 gでのNaClを溶解し、0.1％トリトンX-100溶液。 1ミリリットルのTriton X-100を追加します。溶解するように攪拌します。 RTでTritonバッファーを保管してください。
4. トリトンブロック：Tritonバッファーの9ミリリットルにヤギ血清の1ミリリットルを追加することにより、Tritonバッファー中10％ヤギ血清を準備します。 4℃で保存。マウスで育った一次抗体を使用している場合は、ヤギを追加抗マウスIgGのFabは、ブロッキング工程のためのトリトンブロックに200に1の希釈で断片化します。
   注：計画は、走査型電子顕微鏡（SEM）用のサンプルを使用する場合、下記のように、追加の試薬を調製します。
5. カルシウムとマグネシウムとのハンクス平衡塩溶液（HBSS）ストック溶液から希釈し、HBSSの1X溶液を作ります滅菌蒸留_H 2 OでHBSS緩衝液を作るために複雑かつ伴うリスクがありますされているように、既成の10倍原液を注文することをお勧めします。 1.26 mMの_CaCl 2を、0.49のMgCl ₂ -6H2O、0.41 mMの_MgSO 4を-7H2O、5.33のKCl、0.44 mMのKH ₂ PO _4、4.17ミリモルのNaHCO _3、137.93のNaCl：日常的に使用HBBSバッファの最終濃度は以下の通りです、0.34 mMののNa ₂ HPO _4、5.56 mMのブドウ糖。
6. Hepes緩衝液：1 L 1×HBSS緩衝液に23.8グラムのHEPESを溶解させることにより、1×HBSSに0.1 M HEPES溶液を準備します。
7. 走査型電子顕微鏡固定液（SEMの修）：Hepes緩衝液中で電子顕微鏡グレードのグルタルアルデヒド（2.5％）およびパラホルムアルデヒド（4％）を希釈することにより、SEMのための固定液を準備します。 10mMの最終濃度までのCaCl _{2を加えます} 。
8. Hepes緩衝液中の1％ _四酸化オスミウム（OsO 4）。水中の1％四酸化オスミウム：Hepes緩衝液中で四酸化オスミウムのストック溶液を希釈し、そしてseparatel1％の最終濃度まで滅菌蒸留H _{2 O}中のy。四酸化オスミウムは非常に毒性であり、最も一般的には4％の溶液として販売されています。
9. 1％（w / v）のタンニン酸：50mlの0.5 gでタンニン酸を溶解滅菌蒸留H ₂ O.フィルタは、0.45の細孔サイズのフィルターを通して濾過することにより滅菌します。
10. 段階的なエタノール溶液のシリーズ：30、50、70、90および95％エタノール溶液を作製するために滅菌蒸留H ₂ Oで200プルーフエタノールを希釈します。最終エタノールリンスのために、100％エタノール200証明が必要です。最終回のすすぎのための200プルーフのエタノールの新たにオープンしたボトルを使用してください。

組織の2.選択

1. 理想的には、胎生16.5（E16.5）と生後3日目（P3）の年齢間の胚または若い子犬を調べます。
   注：骨迷路と頭骨の骨化は、マウスが成熟するにつれて解剖が次第により困難になります。また、蝸牛の有毛細胞上に見られる唯一の真の微小管ベースの繊毛をkinocilia、開発中に後退し、もはや成体マウスに存在しません。
2. 固定後、大人の蝸牛を脱灰。回転させながら4日間 - 3用のマイクロ遠心チューブに、pHが7.3、2ミリリットルEDTA（PBS中4.13パーセント）に、骨の迷宮（セクション3を参照）解剖場所。毎日のEDTAを補給してください。組織が軟化した後、増加し、攪拌しながら1.5ミリリットル以上のPBSにニューテーター上で5分間、3回すすいでください。

3.蝸牛解剖

1. 頸椎脱臼またはCO ₂吸入（100％CO _2）を介してポスト安楽死、ヘッドを取り外します。鼻で始まり、尾側に伸びる矢状正中線に沿ってヘッドを分析するために、動物の大きさに応じて、はさみのメスの刃や小さなペアを使用してください。ピンセットで頭蓋骨の各半分から脳を削除してください。内耳の開発骨迷路が含まれている頭骨を、識別する（ 図1Aの矢印参照）。
2. 以下のためのペアを使用します慎重に頭蓋骨（頭骨）から骨迷路を分離するCEPS。解剖顕微鏡下でこれを行います。骨迷路の下に静かに鉗子を実行して、頭蓋骨から骨組織を離れてPrise。 P4までの動物では骨迷路はまだ軟骨で、簡単に破壊することなく除去することができます。
3. 解剖の後、楕円形や円形の窓をクリアし、蝸牛スパイラルの頂点に小さな穴を作るために解剖鉗子の先端を使用します。蝸牛管の更なる解剖前に、骨迷路を修正しました。 （3.7を参照）被蓋膜の容易な除去を可能にするには、氷上で5分間1.5ミリリットル、4％PFAで骨迷路を修正。
   注：被蓋膜の除去が必要とされていない場合は、長い固定が（ - 4.3 4.1を参照）をお勧めします。前蝸牛管の解剖に頭骨の簡単な固定は、解剖プロセスと被蓋膜の除去を助けます。ポスト解剖とコルチ器官の暴露、furt彼女の固定が必要です。
4. さらに、次のように蝸牛感覚上皮を露出させるために骨迷路を分析。解剖を容易にするために、PBSを含有する黒色シリコーンelastomereでコーティングされた解剖皿に骨迷路を置きます。必要に応じて組織を固定化するためにminutienピンを使用してください。 minutienピンを使用するには、上向き蝸牛スパイラルの腹側面と骨迷路の前庭部分を介してそれらを配置します。
   注：ブラックシリコーンelastomere皿：不透明な黒色を得るために、粉末状の木炭で、シリコーンelastomereベース成分を混ぜます。硬化剤を添加し、一つ以上のペトリ皿（ガラスまたはプラスチック）に注ぎます。閉じ込められた気泡を除去するために真空下で乾燥しました。使用する前に完全ドライ料理。
5. 蝸牛管を露出させ、外側の軟骨を除去するために、微細な鉗子（＃5）を使用します。楕円形のウィンドウで起動します。楕円形のウィンドウに鉗子の下部先端を差し込んで、静かにゆっくりと向かって上方に移動する、軟骨をこじ開けます頂点。
6. 蝸牛管の露光後、腹面、ライスナーの膜を除去します。蝸牛管の基部にライスナーの膜をつまんで上向きの動きでそれを剥離する鉗子の罰金のペアを使用してください。感覚上皮を含む、蝸牛管の背側面を可視化します。
7. 以下に説明するように（オプション）被蓋膜を削除します。 SEMや運動毛やstereociliaryバンドルの免疫組織化学のために被蓋膜を削除します。
8. 蝸牛の基部に被蓋膜をつまんで頂点に向かって上向きに引き剥がすのに鉗子（＃55またはより細かい）の非常に微細なペアを使用してください。
   注：被蓋膜を識別することが困難にする光学的に透明です。多くの場合、膜は、1枚でオフに来て、それが容易に可視化されていないが、それはコルティの露出器官から引き剥がすように、1は抵抗を感じることができます。
9. コルチ器官を露出させた後、さらにdと組織を修正下記の傍接しました。組織のさらなる準備を支援するために、前庭の領域を保持します。

4.固定

1. 定期的な免疫組織化学のために2時間ニューテーター上で4℃で1.5ミリリットル4％PFAで切開し骨迷路を修正。
   注：ので、異なる抗体と抗原の感度、固定の長さおよび組成の変動が必要になることがありますし、各抗体のために最適化されるべきです。
2. 固定後、増加し攪拌しながらニューテーター上で5分間1.5 ml以上PBSで3回洗浄することにより、サンプルを洗浄します。サンプルは、処理する前に、数週間、4℃でPBS中に保存することができます。
3. SEMのためのサンプルを調製する場合は、RTで2時間（1.7を参照）、SEMの修正で解剖頭骨を修正。 1.5ミリリットル以上のHepes緩衝液の増加攪拌しながら旋回装置上で5分間、3回洗浄することによって洗浄します。さらに処理するまで4℃でのHepesバッファーに保管してください。週のカップルよりも長い間ストレージsが推奨されていません。

5.免疫組織化学

1. 平底96ウェルプレートの1ウェル中で解剖したサンプルの免疫組織化学を実行します。あるいは、PCRまたはマイクロ遠心チューブを使用しています。処理を容易にするために骨迷路の前庭部分を保持することをお勧めします。
2. 穏やかに撹拌しながら旋回装置上で、室温で1時間、1.5ミリリットルTritonバッファー中でインキュベートすることにより、組織を透過性。
3. 0.5ミリリットル中に室温で1時間の最低トリトンブロックをインキュベートすることによって組織をブロックします。マウスで育った一次抗体を使用している場合、200で1の希釈（1.4節を参照）でブロックに抗マウスIgG Fab断片を追加します。これは非常にマウス組織への抗マウスIgGの非特異的結合を減少させます。
4. 穏やかに攪拌しながら4℃でトリトンブロックO / Nで希釈した一次抗体で組織をインキュベートします。抗体希釈は、使用されている抗体（6.1節を参照）に依存します。あるいは、一次antibodieをインキュベート室温で2時間、S。理想的には0.5ミリリットル、一次抗体希釈液の最小量を使用しています。抗体が限られている場合、完全に組織を包む抗体希釈の最小量を使用します。
5. 増加攪拌しながら旋回装置に、1.5ミリリットル以上Tritonバッファー、15分間、3回の最小ですすぐことにより組織を洗浄します。
6. ニューテーター上で室温で1時間トリトンブロック内メーカー推奨濃度（千：200-1典型的には1）で希釈した蛍光色素コンジュゲート二次抗体で組織をインキュベートします。 0.5ミリリットル二次抗体希釈液の最小量を使用してください。
   1. 3分前には、二次抗体凝集体の非特異的結合を最小化するために使用するために13,000×gで希釈した二次抗体を集めます。蛍光色素を光退色を避けるために以降、このステップからの光から組織を保護します。
7. ステップ5.5のように、上で、15分間、1.5ミリリットル以上Tritonバッファー、最低3回ですすぐことにより組織を洗います増加攪拌しながら旋回装置。直前まで4℃でPBSで保管サンプルは、マウントします。

6.抗体選択

注：推奨される抗体およびそれらの希釈液の供給源は、 具体的な材料および装置の表に記載されています。セクション5で説明したように、抗体のインキュベーションを行います。

1. または抗アセチル化αチューブリン（1：800）：微小管ベースの運動毛を可視化するために、このような抗Arl13b（千1）のような繊毛軸糸のマーカーを使用します。 （1：200）、または任意の他の中心体マーカーγチューブリンに対する抗体を用いた基礎体を可視化します。
2. 、アクチンフィラメントに富むstereociliaryバンドルを可視化ファロイジン（1：300 - 千）を追加するには、二次抗体インキュベーションには、いくつかの異なる蛍光体の1にコンジュゲート。ファロイジンは、各上皮有毛細胞の周囲を囲む皮質アクチンフィラメントを含む他の繊維状アクチンの構造にラベルを付けます。これは決定するのに便利です各有毛細胞の輪郭。必要に応じて：（500 1）、抗ZO-1などの代替膜マーカーを使用してください。
3. またはミオシンVIIa因子（1：1,000）：ミオシンVI（千1）に対する抗体を用いて、蝸牛有毛細胞にラベルを付けます。これらは、蝸牛の長さを評価する場合に使用することができます。

注：使用顕微鏡の要件に最適化され、適切な蛍光色素コンジュゲート二次抗体。

7.取付け・イメージング

1. PBSを含む黒色シリコーンelastomere皿にサンプルを置きます。細かい鉗子を使用して、蝸牛スパイラルから前庭領域を除去。
2. 非常に慎重に蝸牛スパイラルから、基礎となる軟骨および間葉を削除します。残りの蝸牛スパイラルは、内側溝、コルチ器官と外側の溝が含まれています。
3. 顕微鏡スライド上に配置されたPBSのドロップに蝸牛スパイラルを転送します。必要であれば、1ターンに相当個に蝸牛スパイラルを分離します。このステップは、しかし必要ではなく、リットルにつながることができます組織のOSS。蝸牛の有毛細胞の頂端表面（不動側）カバーガラスに向かって上向きにする必要があります。
4. ウィック離れて静かにろ紙の吸着剤の組織や切れ端でPBSおよび上皮がシフトし、それ自体の上に重なっている場合は蝸牛のスパイラルを再配置します。
5. 蝸牛のサンプル上に直接取り付けメディアの低下を加え、穏やかに上にカバースリップを置き、気泡を避けるように注意しながら。いいえスペーサーは必要ありません。サンプルに直接カバースリップを配置。代わりにカバーグラスを保持するために追加の手順を必要としない水溶性、非蛍光性、半永久的な取り付け媒体が推奨されます。マウントメディアとカバーガラスの厚さは、顕微鏡の仕様に適合させるべきです。
6. 蝸牛有毛細胞の頂端表面の画像をキャプチャする目的 - 、高開口数（1.4 1.2） - 高倍率（100X 63）を装備した落射蛍光またはレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用してください。 LOを使用してください蝸牛管の長さを定量化するために蝸牛スパイラルの重複画像を撮影するために - 目標（20X 5）WER。二次抗体に使用蛍光団に励起レーザや発光フィルタと一致しています。

8.走査型電子顕微鏡

1. 4.3節から続けてください。 Hepes緩衝液でSEM固定したサンプルを洗浄した後、換気の下で次の手順を実行します。以下のプロトコルは、蝸牛の組織に適していますし、導電性金属とのスパッタコーティングの使用を回避します。
2. 5分ごとに蒸留水1ミリリットルで3回洗浄した1時間Hepes緩衝液中の1％のOsO ₄でポストフィックス、。組織を完全に包むのOsO ₄の最小量は、有害廃棄物を最小限にするために使用されるべきです。いいえ、攪拌は必要ありません。
3. ステップ間で5分ごとに1ミリリットルの蒸留水で3回洗浄して1時間以下の各溶液に室温でサンプルをインキュベート：1％タンニン酸を新たに水とFILで行われました使用前に結。水中で1％のOsO _4、水中の1％タンニン酸、水で1％のOsO _4。
4. 30、50、70、90、及び95％以下の希釈液の各々における10分間のインキュベーションにより段階的エタノールシリーズを通してサンプルを脱水します。いいえ、攪拌は必要ありません。
5. （200プルーフのエタノールの新しくオープンしたボトルから）100％エタノールを3回交換し、5分間ずつ、を介して転送サンプル。
6. 臨界点乾燥機以下のメーカーの指示かかわらず、サンプルを実行します。
7. 電子顕微鏡で撮像前にSEMスタブの上に導電性カーボン接着剤を使用したサンプルをマウントします。実体顕微鏡下で、優しく蝸牛上皮を上に向けてサンプルを配置するために微細な鉗子や絵筆のペアを使用。 「アンカー」スタブへの組織にサンプルの前庭部分を使用してください。イメージングまでデシケーターで保管サンプル。ジョーンズ^（2012）21に記載されているようにSEMの撮影を行います。

9。定量化

1. 免疫組織化学の調製後、落射蛍光またはレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて画像を取得します。 SEMのための準備の後、画像に標本を走査型電子顕微鏡を使用しています。画像露出した蝸牛の有毛細胞とインターカレートされた支持細胞とコルチ器官の先端面。
2. 、蝸牛管に沿ってベースからのような25、50、および75％の特定の位置を定義して、変異体およびコントロールサンプル間蝸牛領域を比較するためにこれらを使用しています。遺伝的背景の違いは蝸牛の表現型を変更することができるよう、彼らの同腹子対照と繊毛の変異体を分析し、比較します。
   注：コルチ器官を頂点とベースの両方に向かって半ばベースから延びる勾配で開発しています。マウスでは、開発はP14まで完全ではないので、同様の発達段階との位置で領域を比較することが重要です。
3. ALLO顕微鏡に付随するソフトウェアを使用して写真を撮ります特定の表現型の定量化のために必要とされるW（下記参照）。 、長さを測定し、細胞をカウントし、下記のようにタンパク質の局在化を決定するために顕微鏡を伴うこのような画像Jまたはソフトウェアとして画像分析ソフトウェアを使用。変異対コントロールを比較した棒グラフ、散布図、箱ブロットまたはヒストグラムなどのグラフこれらのデータを、。
4. 蝸牛管（ 図3A）の合計の長さ：
   1. （stereociliaryバンドルをマーク）有毛細胞マーカーまたはファロイジンを使用して、決定し、感覚上皮が開始位置と終了位置を測定。蝸牛管の長さは、多くの場合、繊毛変異体に短縮されます。
5. Stereociliaryバンドル異常（ 図3B、D、E、G）。
   1. バンドルの頂点と図3Gに示すように、バンドル「腕」の両端を通って延びる線との間の最短距離としてバンドル凸部（高さ）を測定し、左。代わりに、面積を定量化右、 図3Gに示すように、外有毛細胞stereociliaryバンドルの腕に包含されます。円形stereociliaryバンドルとともに有毛細胞を同定することができる場合は、合計有毛細胞の割合として、これらを数えます。
      注：多くの毛様変異体におけるバンドルの異常に関係なく束方向の観察することができます。正確stereociliaryバンドル異常を定量化することは困難です。
6. stereociliary束（ 図3B、C、G）のオリエンテーション：
   1. 内側と外側の有毛細胞を分離ピラーセルの行に垂直に延びる直線に対してそれぞれ個別の束の向きを評価します。通常の方向を有する細胞は、この垂直軸に沿って整列し、そのように0°の回転を持っています。 0°から360°の表記として、または絶対偏差のいずれかを使用して回転角度を決定します。
7. Kinocilia位置決めやstereociliaryバンドルの位置（ 図図3Bに示すように、F、H）。
   1. kinociliaが欠落している細胞の割合をカウントします。バンドルの「頂点」または中心に運動毛からの距離を測定します。バンドルが異常である場合、バンドルの「頂点」を定義することは容易ではないかもしれない、したがって束の中央部を代わりに使用することができます。
8. 各有毛細胞上に位置グリッドを重ねると運動毛の根元やstereociliaryバンドルの頂点/中央のいずれかの場所をマークすることによって、頂端有毛細胞表面上kinociliaとstereociliary束の位置を定量化します。グリッドの特定の領域内にある各カテゴリの割合として、および1の位置グリッド上の各マーキングの位置を重ねることによって、データを表示します。
   注：対照組織では、kinociliaは常にstereociliaryバンドルの頂点に取り付けられています。繊毛の変異体では、kinociliaは、多くの場合、不足しているまだついたまま、あるいは完全にsから切り離さmislocalizedtereociliaryバンドル。
9. Kinocilia長（ 図3I）：
   1. 繊毛軸糸のマーカーで標識することにより、運動毛の長さを測定します。わずか1.5μmの共焦点平面内に平らにkinociliaを測定します。繊毛は、スキャンされた組織の断面を観察することによって平らに横たわっていることを確認してください。運動毛が開発中に後退するので、蝸牛の同じ領域から高齢者マッチしたサンプルを比較してください。
10. 極性タンパク質の誤局在：
    1. このようなVangl2やGαi3などの極性タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学に続いて、結像を介して局在を決定します。

注：一部の繊毛の変異体では、極性タンパク質の局在化が破壊されます。これらはVangl2とGαi3、Ift20において破壊されることが示されており、Bbs8とBbs6変異蝸牛が含まれます。

注：有毛細胞polaritを定量化して表示する方法のための更なる例yは以下の論文に記載されています。カーティン、ら。 （2003年）カレントバイオロジー^{22、Montcouquiol}ら。 （2003）ネイチャー^7、王、ら（2006）ら神経科学^{23、Montcouquiol、}誌。分子生物学²⁴月-Simera中（2008）の方法は、ら。分子生物学の（2012）の方法^25、殷ら（2012）PLoSの1 ^26。

結果

蝸牛解剖と組織調製

脳を除去した後、P0マウスヘッドの後正中線矢状切開、後ろから見骨迷路は、（ 図1A、白矢印）可視化し、除去することができる。 図1Bは、蝸牛有毛を有する単離骨迷路を示しています、腹、上向き（左）と後ろから、背側（右）。 1は、外側の軟骨の除去を開始することができ、そこから卵円窓に白い矢印ポイント。外側の軟骨が完全に除去された後、露出された蝸牛管は、まだ無傷の（ 図1C）を観察することができます。切開を補助する前庭領域を通るピンの位置決めが示されています。異なる角度で配置された2つのピンは、また、組織を固定するために使用することができる。 図1Dはライスナー'の除去後に蝸牛管を示しています; sの膜とふたとなる膜（左）とそれが免疫組織化学（右）のために実装するための...

ディスカッション

分析のための蝸牛組織を調製する場合、心に留めするためのいくつかの重要なポイントがあります。まず、遺伝的背景の違いは、それが必要なだけ同腹のコントロールを分析し、比較すること、蝸牛の表現型を変更することができます。第二に、被蓋膜の完全な除去は、免疫組織化学で最高の画像を得るために必要とSEMのために必須です。被蓋膜は不透明構造であり、イメージングがより困難に、その下に直接感覚上皮の細胞を曖昧にすることができます。時折処理中に、被蓋膜は有毛細胞を暴く、バック縮むことがあります。これらの場合であっても除去が強くお勧めします。このステップは、忍耐と練習が必要です。第三に、毛様体タンパク質、高度に圧縮された基礎体温に局在し、特にもの、に対する抗体を用いた免疫組織化学は、挑戦することと最適化を必要とすることができます。 permeabilを強化し、抗原の検索を行う考えてみましょう化工程、または固定の濃度または時間を減少させます。 P1を以降ベース - 頂点勾配で - 最後に、運動毛（蝸牛有毛細胞上に見られる一次繊毛）を撮像する場合は、それがP0から退避し始めることに留意してください。運動毛の長さを測定する場合したがって、蝸牛の同じ領域から、年齢一致...

材料

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名前	会社	カタログ番号	コメント
ツール/機器
シリコーンエラストメア - Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028-5EA	注2を参照してください
マイクロ解剖ハサミ-ストレートブレード	さまざまな
細かい鉗子(No.5および55)と鈍い鉗子	さまざまな
解剖顕微鏡。	さまざまな
コーティングされていないガラス顕微鏡スライドさまざまな
顕微鏡カバースリップ(22 mm× 40 mm× 0.15 mm)	さまざまな
トランスファーピペットさまざまな
微細ピン	ファインサイエンスツール	26002-10
SEMサンプルホルダー	tousimis	8762
走査型電子顕微鏡スタッド	TED PELLA	16111
PELCOタブ:カーボン接着剤	TED PELLA	16084-3
蛍光顕微鏡	各種
臨界点乾燥機	各種
走査型電子顕微鏡	各種
ガラス顕微鏡スライド	各種
ガラスカバースリップ	各種
キムワイティッシュ	さまざまな
細かいペイントブラシ
1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Gibco/Life Technologies	10010023
パラホルムアルデヒド (PFA)(EMに必要なEMグレード)	さまざまな		1×で4%溶液を準備します。毎回新鮮に作られたPBS。EMに必要なEMグレード。
2.5% グルタルアルデヒド グレード 1	Sigma-Aldrich	G5882
Tris-HCl (pH 7.5)	各種
NaCl	各種
CaCl 2	各種
Triton X-100	各種
正常ヤギ血清	各種
AffiniPure Fab フラグメント ロバ 抗マウス IgG (H+L)	ジャクソン免疫研究	715-007-003
フルオロマウント-G封入剤	SouthernBiotech	0100-01
10回;ハンクスの平衡塩溶液 (HBSS)	Gibco/Life Technologies	14065
Hepes	Gibco/Life Technologies	15630-080
四酸化オスミウム (OsO4)	Sigma-Aldrich/Fluka Analytical	75632
タンニン酸	Sigma-Aldrich	403040
エタノール 200 プルーフ	各種
抗体
抗 Arl13b	Protein Tech	17711-1-AP	推奨濃度 1:1,000
抗アセチル化チューブリン (611-B1)	Sigma-Aldrich	T6793	推奨濃度 1:800
抗ガンマチューブリン (GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557	推奨濃度 1:200
抗 Zo_1	Invitrogen	40-2300	推奨濃度 1:500
ミオシン VI	プロテウス バイオサイエンス	25-6791	推奨濃度 1:1000
ミオシン VIIa	プロテウス バイオサイエンス	25-6790	推奨濃度 1:1,000
抗 Vangl2	メルク ミリポア	ABN373	推奨濃度 1:250
抗 G&α;i3	Sigma-Aldrich	G4040	推奨濃度 1:250
Alexa Fluor® 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379	推奨濃度 1:300 - 1,000
Alexa Fluor® 568 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12380	推奨濃度 1:300 - 1,000