遺伝的にコードされた蛍光電圧センサーの2種類のイメージング膜電位

Summary

遺伝的にコード化された電圧指標を使用して膜電位の変化をイメージングする方法が説明されています。

Abstract

遺伝的にエンコードされた電圧インジケータ(GEVI)は、in vivo記録に有用になり始めるところまで改善されました。最終的な目標はin vivoでニューロンの活動を画像化することですが、in vivoでの調製を成功させるには、単一細胞の活動を画像化できなければなりません。この手順では、単一細胞の膜電位をイメージングして、最終的にin vivoでイメージングするための基盤を提供する方法について説明します。ここでは、1つの蛍光タンパク質(FP)またはin vitroでフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)が可能な2つの蛍光タンパク質に融合した電位検出ドメインからなるGEVIのイメージング方法について説明します。イメージスプリッターを使用すると、2つの異なる波長で作成された画像を同じ電荷結合素子(CCD)カメラに同時に投影できます。イメージ スプリッターは、ライト パスに 2 番目のフィルター キューブを配置します。この 2 番目のフィルターキューブは、ダイクロイックフィルターと 2 つの蛍光フィルターで構成されており、GEVI の FP に応じてドナー蛍光波長とアクセプター蛍光波長を分離します。このセットアップにより、アクセプターとドナーの両方の蛍光パートナーを同時に記録しながら、膜電位を全細胞パッチクランプ構成で操作できます。1つのFPで構成されるGEVIを使用する場合、2番目のフィルターキューブを取り外すことで、イメージスプリッターのミラーが1つの画像をCCDカメラに投影できます。

Introduction

この論文の主要な焦点は、遺伝的にコード化された蛍光タンパク質を用いたin vitroでの膜電位の変化の光学イメージングを実証することです。膜電位のイメージングの変化は、神経回路の活動を研究のエキサイティングな可能性を提供しています。蛍光強度の変化、膜電位の結果の変化は、カメラの各画素は、神経活動の非侵入測定を可能にする代理電極になったとき。 40年以上にわたり、有機電位感受性色素は^、1-4膜電位の変化を観察するために有用でした。しかし、これらの染料は、細胞特異性を欠きます。また、いくつかの細胞型は染色が困難です。遺伝的にコードされた電圧インジケータ（GEVIs）蛍光電位感受性プローブ​​を発現特に検討される細胞を有することにより、これらの制限を克服します。

GEVIsの3つのクラスがあります。 GEVIの最初のクラスは、VOを使用しています単一の蛍光タンパク質^（FP）5-9または蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）ペア^10-12のいずれかの電圧センシングホスファターゼからltage感知ドメイン。センサの第二のクラスは、蛍光指示薬直接^13-15として、またはエレクトロクロミックFRET ^16,17を介して微生物のロドプシンを使用しています。第三のクラスは、2つのコンポーネント、膜アンカーFPおよび膜結合消光染料^18-20である第2の成分である遺伝的要素を利用しています。第二および第三のクラスは 、in vitroおよびスライス実験^19,20 内のために有用であるが、センサーの唯一の最初のクラスは現在、in vivoでの ^6を分析するのに有用です。

この報告では 、in vitroでGEVIsの最初のクラス（ 図1）を使用して、膜電位のイメージングを実証します。電圧センサのこの最初のクラスは、in vivoイメージングに移行するのが最も簡単です。 GEVIs U以来FPに融合された電圧センシングドメインは約センサのロドプシンクラスより明るい50倍されるtilizing、それらはむしろ非常に強力なレーザを必要とするよりも、アーク灯照明を用いて撮像することができます。明るさの格差の別の結果は、GEVIsの最初のクラスを簡単に脳の自家蛍光を超えることができるということです。ロドプシンベースのプローブはできません。センサの第三のクラスは、ファーストクラスと同じくらい明るいですが、in vivoで投与することが困難である化学消光剤の添加を必要とします。

我々は、したがって、単一の^{FP（Bongwoori）8}とFRETペア（ナビ^2）12からなるプローブとプローブの取得のデモンストレーションを行います。ナビ2.242とナビ2.244という名前の緑色蛍光ドナー、クローバーから成る^11、および赤色蛍光アクセプター、mRuby2、 - VSFP-CR（クローバー-mRuby2電位感受性蛍光タンパク質）の蝶のバージョンでは、FRETがこのレポートで構築されています

図1.この報告書 （A） で撮像された遺伝的にコードされた電圧インジケータ（GEVIs）膜貫通電圧センシングドメインおよび蛍光タンパク質を持つGEVIベースのモノFPの二種類 。 （B）の膜貫通電圧センシングドメインで構成されるFRETベースGEVI、FRETドナーとアクセプター。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Protocol

倫理文：動物実験プロトコルは、KIST動物プロトコル2014から001に施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

1.機器のセットアップ

1. イメージングセットアップ
   1. 防振テーブル上に倒立蛍光顕微鏡を配置します。高倍率（1.35開口数の60倍の油浸レンズ）対物レンズと電圧イメージングのために使用される蛍光タンパク質に適したダイクロイックミラーとフィルターを備えたフィルターキューブを使用してください。
      注：この設定は、より高いNAの対物レンズを採用するために、倒立顕微鏡を使用していますが、直立顕微鏡を使用することもできます。実際に、倒立顕微鏡は、プローブの開発のために、より高い開口数（NA）ので、対物レンズにより雑音比（SNRに信号を改善低NAを有するものよりも多くの光を収集され、で割ったピーク光信号として説明することができますベースラインの標準偏差記録の蛍光）。非開発者のために、私たちはそのようなスライスとして、またはin vivoでの録音でのアプリケーションのための正立顕微鏡をお勧めします。
   2. 効率的な落射蛍光広視野イメージングのためのメカニカルシャッタを備えた光源、 例えば 、キセノンアークランプ、準備。マウントライトガイドを介して顕微鏡に光を向けます。光は、励起フィルターを通過し、フィルタキューブの第1ダイクロイックミラーによって反射されます。ビュー²¹の分野にわたって最大化光強度で均一に試料を照明する光の位置を合わせます。
      注：より高いワット数の電球が大きくなく、明るい照明のフィールドを作成するため、伝統的に、75ワットのアークランプを使用しました。レーザーを使用することができるが、単一の波長に制限されています。 LEDが明るくなってきており、実際に選択された光源は、複数の波長を提供し、機械的なシャッターを必要としないことができます。
   3. fluorescに2台のCCDカメラをマウントします図2Dに示すようにレンス顕微鏡。
      注：最初のCCDカメラは、高い空間分解能を有し、試験される細胞膜にGEVIを発現する細胞を同定するために使用されます。膜電位のイメージングの変更については、第2のCCDカメラは、毎秒千フレーム（FPS）などの高フレームレートを持っていることを確認してください。 2台のCCDカメラとの間に撮像経路を切り替えるためにデュアルポートカメラアダプター（ 図2D-（3））を使用してください。このセットアップでは、demagnifierは、第2のCCDカメラにおけるCCDチップ上に対物レンズからの画像を適合させるために使用されます。
   4. FRETベースのGEVIのイメージングのために最初の（遅い）と第二（高速）CCDカメラ間の画像スプリッタをインストールします。画像スプリッタにダイクロイックミラー（560 nm）を有するフィルタキューブと2つの発光フィルター（520nmの/ 40＆645 nmの/ 75）を挿入します。これは、2つの視野、アクセプタ蛍光を表すドナー蛍光およびその他のための1つになります。これはよ削除単一のFPでGEVIを画像化econdフィルタキューブ。
      注：この方法でテストした単一のFPベースGEVIはFP、超黄道pHluorin A227D（SE A227D）を使用していますBongwooriです。励起フィルター（472ナノメートル/ 30）、発光フィルタ（497ナノメートル/ロングパス）と、ダイクロイックミラー（495ナノメートル）は、その励起および発光スペクトル⁵に基づいて選択しました。一般的に、励起および発光フィルタは、ダイクロイックミラーブロックの任意の励起光は発光フィルターを透過しつつ、明るい画像を取得する蛍光体の各スペクトルとの最大の重なりを持っている必要があります。 FRET ^対 11ベースGEVI記録用フィルタおよびダイクロイックミラーの選択は、ドナーおよびアクセプター蛍光の同時観察用画像スプリッタで第二のフィルタキューブを必要とすることを除いて同じ原理に従います。顕微鏡フィルターボックス内に配置された第1のフィルタキューブは、クローバーの励起フィルター（475 nmの/ 23）を有する必要があります。そして、放出されたF両方のFPからluorescenceは、第1ダイクロイックミラー（495 nm）を介して第2のフィルタキューブに送信されます。第二のフィルタキューブは、ダイクロイックミラー（560 nm）をそれぞれFPは、このように二つの異なるのFPからの蛍光を分離するための2つの発光フィルタ（クローバーのための520 nmの/ 40およびmRuby2のための645 nmの/ 75）を有しています。

		シングルFPベースGEVI （Bongwoori）	FRETペアGEVIをベース （ナビ2.42＆ナビ2.44）
顕微鏡に配置された第一のフィルターキューブ	励起フィルター	472 nmの/ 30	475nmの/ 23
	ダイクロイックミラー	495 nmの	495 nmの
	発光フィルター	497 nmの/ロングパス	-
ビームスプリッタに配置された第2のフィルタキューブ	ダイクロイックミラー	-
	発光フィルター1	-	520nmの/ 40
	発光フィルター2	-	645 nmの/ 75

シングルFPベースのGEVIとFRETベースGEVIレコーディングに使用し、表1つの異なるフィルターセット

2. 振動絶縁
   1. 防振テーブル上のコンポーネントを移動すると、任意の機器をマウントしないでください。非絶縁機器に接続されたケーブルは、試料の振動を避けるために緩んでいることを確認してください。
3. パッチクランプ室
   1. 対物レンズの作動距離が比較的小さいので、薄い＃0のカバーガラスをパッチクランプ室の底部を密封します。これは、倒立顕微鏡のセットアップの欠点です。
      注：高NA対物レンズを有することのトレードオフとしては、作動距離が減少します。 SPECIMを配置するために非常に短い作動距離内のアンは、カバーガラスとカバーガラス（ステップ2）は、可能な限り薄くする必要があります。
4. 温度制御
   1. 浴溶液は^33°Cの実験を通して周りのパッチを適用し、細胞を維持するために温度制御装置を通って流れることを確認してください。
5. 機器の接続
   1. パッチクランプアンプと高速のCCDカメラのバヨネットニール・Concelman（BNC）コマンドボックスに光源のメカニカルシャッターを接続します。これは、アンプ、カメラ、および同時に光源を制御するために、イメージングソフトウェアを使用可能にします。
      注：電気的およびイメージング構成要素は、電気的活動の同時電気的および光学的記録を提供するために同期される必要があります。

図2.装備光路次GEVIsと電圧イメージング用メント設定ワークフロー、（A）75Wキセノンアークランプ、（B）アークランプからの励起光は、励起フィルターにより濾過し、次いでそれが到達する前に、第1のダイクロイックミラーで反射され試料ステージ、右上の挿入図は、低速のCCDカメラは、細胞パッチクランプの両方の選択を助けるために使用される全セル構成、（C）、（D）画像取得部を示す図です。 （1）高速CCDカメラ、（2）の両方のために画像スプリッターがペアとモノFP GEVIs、（3）高速CCDカメラ内のCCDチップ上に画像に合わせてdemagnifierを、（4）デュアルポートFRETイメージング経路を切り替えるためのカメラアダプターとパッチへの細胞の同定のための高空間分解能を持つ（5）低速CCDカメラ、（E＆F）のシングルFPベースGEVI（E）とFRETベースのGEVIと画像取得（F）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

GEVIsの2式

1. ヒト胚腎臓293細胞における
   1. 培養ヒト胚性腎臓293（HEK 293）CO ₂インキュベーター（5％CO _2）で^37°Cの 、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で細胞。 100ミリメートルの直径と20ミリメートルの高さを持つ組織培養皿を使用してください。 2×10 ³で培養を開始- 6×10 ³細胞/ cm ²と、彼らはその後のトランスフェクションのための80〜90％の集密度に達するまでインキュベートします。
   2. トランスフェクションの日に、細胞培地を吸引し、穏やかにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水で一回洗浄します。 、1-2分間、0.25％トリプシン-EDTA溶液を用いてHEK293細胞を分散させた溶液を吸引し、静かにCを分離するために皿の側面をタップells。新鮮なDMEM（10％FBS）を加え、ピペッティングにより凝集した細胞を解離します。血球計数器を用いて、細胞濃度を決定します。
   3. 0.08置き - 厚さ0.13ミリメートル、直径10mmを、24ウェル組織培養プレート中のポリ-L-リジンで予め被覆したカバースリップ。 1×10 ⁵細胞/ cm ²の細胞密度でカバースリップ上のHEK293細胞をシード。
      注：HEK 293細胞は、互いにギャップ結合を形成することができるので、シード番号は、単離された細胞を生成する必要があります。
   4. 一過製造者の指示に従ってリポフェクション試薬を使用してGEVIをコードする適切な遺伝子構築物で細胞をトランスフェクトします。
      注：バックボーンベクターとして、この手順を利用するpcDNA3.1（Bongwoori）とpUB2.1（ナビ2.242）に使用される遺伝子構築物を。 DNAの量は、各カバースリップのために100ngた使用しました。しかしながら、トランスフェクション条件は、各GEVIを試験するために実験的に決定する必要があります。
2. 解離したマウスのヒップpocampal一次ニューロン
   1. 胎生17日目C57BL6 / Nマウスから海馬を解剖し、以前に^22,23を説明したように、次に海馬神経細胞を解離します。
   2. プレートの厚さのポリ-D-リジンコート0.08〜0.13ミリメートル、1×10 ^5細胞 / mlの細胞密度で直径10mmのカバースリップ上に解離したニューロン。 CO ₂インキュベーターを37 ^{O Cで}細胞をインキュベートする（5％CO _2）。
   3. 以前^{24に記載されているように} 、リン酸カルシウムトランスフェクション試薬を使用してGEVIをコードする遺伝子構築物を用いてインビトロ（DIV） で 7日- 6で一過性解離ニューロンをトランスフェクトします。
      注：バックボーンベクターとして、この手順を利用するpcDNA3.1（Bongwoori）とpUB2.1（ナビ2.244）に使用される遺伝子構築物を。使用されたDNAの量は、各カバースリップのために1μgのでした。再び、トランスフェクション条件は、試験した各GEVIために経験的に決定する必要があります。
3. IMAを電圧に先立って発現レベルを確認してくださいエージング
   1. CO ₂インキュベーターから組織培養プレートを取り、落射蛍光顕微鏡下でトランスフェクションした細胞からの蛍光を観察します。
   2. 膜からの蛍光を確認した後、セクション3の電圧イメージングのためのパッチ適用チャンバにカバースリップを転送します。
      注：電圧イメージングは​​16で行われる - 24時間後、トランスフェクションを。異なる蛍光タンパク質は異なる成熟時間を持っているようしかし、いくつかのGEVIsは、トランスフェクション後でより多くの時間を必要としています。例えば、このプロトコルでmRuby2を含むFRETペアはmRuby2の成熟がクローバー¹¹よりも大幅に時間がかかりますので、表現するために時間がかかることがあります。ドナーとアクセプターの両方の蛍光をチェックする必要があります。

3.電圧イメージングプロトコル

1. 良好な膜発現で健康な細胞を選択してください
   1. 顕微鏡を使用して、それは強く示して健康な細胞（ 図4B）を見つけます内部蛍光に比べ、膜局在する蛍光。丸みを帯びた細胞にパッチを適用しないようにしてください。円形細胞はいずれかの除または瀕死とパッチに困難です。その後のパッチクランプ実験を助けるために、期間中に振幅と5.0ミリ秒で5.0 mVでの試験パルスを適用します。
2. 電圧イメージングのための細胞を調製します
   1. パッチへのセルを選択した後、セルの上のパッチクランプピペットを配置します。それは静かに細胞膜に接触するまでピペットを停止します。パッチクランプ^ソフト 25上の膜抵抗の2MΩ上昇-このステップでは、1MΩを観察します。
      注：時々、良いギガオームシールは、細胞膜に触れるだけで簡単に発生する可能性があります。限りギガオームシールが安定しているとして、それがOKであるべきです。
   2. 静かにピペットを介して負圧を適用することにより、ギガオームシールを確立します。希望の保持電位でのピペット電位を設定します。
   3. ギガオームシール、番目の画像を維持しながら、Eの高速CCDカメラを用いた細胞及び膜領域に焦点を当てます。
   4. 全細胞構成^{26を作るために}穏やかに口またはシリンジによる吸引のパルスを印加することによって、細胞膜を破裂。
   5. 画像パッチは、イメージングソフトウェアを使用して実験計画に従って全細胞クランプコンフィギュレーションの下で細胞をクランプ
      1. イメージングソフトウェアを起動します。 「CCD ACQUIRE」ページを開くために[SciMeasureカメラ]メニュー - [ACQUIRE]をクリックしてください。
      2. 画像を保存するための新しいデータファイルを作成します。
      3. [アナログ出力]をクリックし、イメージングを行うために、パルス・プロトコル・ファイルを開くために[ASCIIを読みます]。データを平均化する必要がある場合は、 '内部の繰り返しの平均」をクリックします。そして、「アナログ出力」のページを閉じます。
         注：このパルスプロトコルは設計されており、この工程の前に、各実験の目的に応じて.txtが 'ファイルとして保存する必要があります。
      4. 特定のアキを設定します「CCD ACQUIRE」ページからitionパラメータ。入力」取得のためのフレームの数」と「試行回数」のための具体的な値。
         注：フレーム数取得の速度及びパルスプロトコルのタイミングによって決定されます。例えば、画像化は、1kHzで1000フレームは、記録時間の1秒に等しい場合。
      5. 録音を開始するボタン[（光学+ BNC）データを取得]をクリックします。電圧画像化が行われている間、記録の全体にわたって安定した全細胞構成を保証するために、パッチクランプソフトウェアオシロスコープ画面を見ます。
         注：GEVIの応答電圧範囲をテストするには、ΔF/ F値または生理的な電圧範囲にわたって時間分解能での信号の大きさ、-170 mVのから130 mVの範囲の階段状の電圧パルスを有するパルスプロトコルで全細胞電圧クランプ実験を行います。培養プリマから誘発活動電位の解決にGEVIの性能を決定するために、RYニューロン、画像全体セル電流クランプ構成の下のセル。

4.データ集録

1. ΔF/ Fの計算
   1. イメージングソフトウェアを起動します。分析すべきデータファイルを開くには、[データの読み取りファイル] - [ファイル]をクリックしてください。右側にその静止光強度（RLI）で細胞画像を観察
      注：記録のRLIを決定するためのソフトウェア平均値最初の5フレームを。
   2. 画面に測定された電流値と電圧値をもたらすために「ショーのBNC」をクリックします。
   3. 応答光信号を有するピクセルを識別するために、フレーム減算機能を利用するには、「フレーム減算 'に' RLIフレーム」からページモードを変更します。すべてのピクセルは、蛍光の潜在的な変化を調べることができるので、これはイメージングの真の力です。
   4. 減算のための2つの時点（F ₀とF _{1）を選択します。}あるセルのどの領域識別膜電位の変化に応じた信号を示します。
      注：フレーム差分画像のSNRは、時間的に信号を平均化するために各時点で複数のフレームを選択することによって改善することができます。ソフトウェアは、選択したフレームから取られた平均光強度を減算し、F ₁ -F ₀値（ΔF）を算出します。通常、1つは、刺激期間中に採取保持電位と他の時点で取得された時点を選択します。
   5. コンピュータマウスを用いて、各ピクセルをドラッグするか、クリックすることによって分析する必要がある画素を指定します。ソフトウェアウィンドウの左側に選択されたピクセルからの平均蛍光強度のグラフ表示を守ってください。4（b）＆（b）は、フレーム間差分解析から、代表的な画像を示しています。
   6. RLI（F _0）を差し引いたピクセルを分割します。 ΔF/ F値を取得するために[別RLI除算]をクリックしてください
2. データを出力
   さらにGEVIの電圧センス特性を分析するために、各電圧ステップのためΔF/ F値を計算します。分析のその後のデータのための電圧対などΔF/ Fとしてグラフを描画するために、これらの値を使用してください。
3. 「ショーのBNC」メニューをunclickingによって電流と電圧のグラフを削除してください。 [OUTPUT]に移動します - [（ASCII）表示されているようにトレースを保存]の標準的なグラフ作成ソフトウェアでカーブフィッティング解析のためのASCIIファイル形式で蛍光トレースをエクスポートします。

5.データ解析

1. GEVIの電圧センシングプロパティ
   1. データ解析プログラムに電圧対ΔF/ F値をプロットすることにより、電圧グラフ（FV）に対する蛍光変化を描画します。 [フィッティング] - - [シグモイドフィット] - [開く]ダイアログ]、その後、ボルツマン関数を選択し、[分析]をクリックすることで、光信号の電圧範囲を決定するために、ボルツマン関数（ 表2）に曲線をフィット。
      注意：関数にフィッティングことがpossiblになります異なる電圧プローブの電圧検出特性を特徴づけるために、または異なる細胞におけるそれらの性能を比較するために、E。これらのプローブからのFV曲線はS字状のパターンを示すため、ボルツマン関数は、この論文で試験されたプローブのために使用することができます。
   2. 機能により算出された初期値と最終値_（1および_2）を用いて各ΔF/ F値を正規化します。
      注：ボルツマン方程式では、最小値は_1、最大値は₂です。正規化のために、1のようにゼロとして₁と_2を定義することにより、ΔF/ F値を調整するためにスプレッドシートアプリケーションソフトウェアを使用しています。正規化されたΔF/ F値を平均し、統計分析のための標準誤差を計算します。
   3. 以前のセクション5.1.1で説明したように）電圧対正規化されたΔF/ F値を再プロット。
2. 光学応答速度
   1. データ分析とステップ4.2.2から取得したASCIIファイル）を開きますプログラムと時間に対するΔF/ Fトレースをプロットします。
   2. データ解析ソフトの「データ選択」をクリックして、階段状の電圧パルスの開始と光信号が定常状態に到達した第2時点に対応する時点を選択します。クリックすることで、単一および二重指数減衰関数の両方にこの範囲を合わせる[分析] - [フィッティング] - [指数フィット] - [開く]ダイアログ]、および指数関数的減衰機能を選択します。より良いフィット感を報告します。
      注：単一または二重指数関数的減衰関数に当てはめることにより、τで表される定量化時定数を取得することができます。これは、実験者が異なる電圧インジケーターで行われ、その測定値の動態を比較するのに役立ちます。蛍光トレースは二重指数減衰関数を用いて記述することができ、高速と低速のコンポーネントが表示される場合があります。この場合、計算は、異なる振幅を有する2つの時定数をもたらします。
   3. 目を計算します電子加重τ定数は、単一成分でプローブに2時間成分を示すプローブの動態を比較しました。
      注：以下の式で定義されるように重み付けタウは、相対的な振幅を乗じ_τ1の合計として計算_1、プラス_τ2は、相対振幅を乗じ_、2れます。

Results

一過性にトランスフェクトされた細胞は、有意な蛍光強度の変化と原形質膜発現の程度を示すことができます。でも同じカバースリップ上でいくつかのセルは、内部蛍光のレベルを変化させる必要があります。これは、細胞によって吸収されるトランスフェクション剤の使用量が最も可能性が高いです。時折、あまりにも多くの式は（明るい、高い内部蛍光で、細胞を四捨五入）細胞がアポトーシス²⁷で得られた小胞体ストレス応答を体験させます。実験者は、したがって、内部表現は、信号対雑音比（SNR）を低下させる非反応性蛍光を生成するので、できるだけ内部蛍光明るい細胞および薄暗い細胞の両方をテストするために警告されます。

もう1つの考慮事項は、発色団の成熟速度である。 図3は、アクセプターchromophの蛍光の格差を示していますドナー発色団（クローバー）より長い熟成時間を持つ鉱石（mRuby2）。

Discussion

神経系は、いくつかの異なる方法で電圧を使用して、阻害は、シナプス入力がわずかな脱分極および比較的大きな電圧変化における活動電位の結果を引き起こし、若干の過分極を引き起こします。 GEVIsによって膜電位の変化を測定する能力は、同時に神経回路のいくつかの成分を分析の有望な可能性を提供しています。この報告書では、GEVIsを使用して、膜電位のイメージングの変更のための基本的な方法を示しています。

電圧のイメージングの変化のための主要なキーは、原形質膜中のGEVIの効率的な発現です。細胞内発現は、プローブのSNRを低減し、応答しない蛍光を作成します。トランスフェクション条件を最適化することは非常に光学測定の一貫性を向上させます。小説GEVIをテストするとき確かに、また、光学活性の差は全くNEに起因していることを確認するために知られているプローブをテストすることをお勧めしますワットプローブと細胞のない条件。

図6は 、電圧イメージングの感度を低下させるのに内部蛍光の影響を示しているΔF/ F値。 <...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
倒立顕微鏡	オリンパス	IX71
60倍対物レンズ (開口数 = 1.35)	オリンパス	UPLSAPO 60XO
励起フィルター	Semrock	FF02-472/30	ボンウリの超黄道pHluorinの電圧イメージングに
クロイックミラー	セムロック	FF495-Di03-25x36
蛍光フィルター	セムロック	FF01-497/LP
75W キセノンアークランプ	CAIRN	OptoSource イルミネーター	LEDやレーザーも有効光源
CCDカメラ	日立	KP-D20BU
デュアルポートカメラアダプター	オリンパス	U-DPCAD
高速CCDカメラ	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
イメージスプリッター	CAIRN	Optosplit 2
励起フィルター	Semrock	FF01-475/23-25	FRETペアの電圧イメージング用 CloverとmRuby2)
ダイクロイックミラー	Semrock	FF495-Di03-25x36
発光フィルター		Chroma ET520/40
ダイクロイックミラー	Semrock	FF560-FDi01-25X36
発光フィルター	Chroma	ET645/75
除振システム	キネティックシステム	250BM-IC, 5702E-3036-31
パッチチャンバー	ワーナーインスツルメンツ	RC-26G, 64-0235
#0 マイクロカバーガラス (22 x 40 mm)	Electron Microscopy Sciences	72198-20
Temperature controller	Warner instruments	TC-344B
#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip	Ted Pella	260366
Lipofection agent	Life Technologies	11668-027
Calcium phosphate reagent	Clontech - Takara	631312
パッチクランプアンプ	HEKA	EPC 10 USBアンプ
マルチチャンネルデータ収集ソフトウェア	HEKA	Patchmaster
画像取得・解析ソフト	RedShirtImaging	Neuroplex
スプレッドシートアプリケーションソフト	Microsoft	Microsoft Excel 2010
データ解析ソフト	OriginLab	OriginPro 8.6.0
拡大鏡	Qioptiq LINOS	Optem 標準カメラカプラー 0.38x SC38 Jクランプ
共焦点顕微鏡	ニコン	ニコン A1R 共焦点顕微鏡
アンチフェード試薬	ライフテクノロジー	ズ P36930