方法論記事

SLP1ポリマーと単層のAuのインタラクションから

DOI：

10.3791/53572

⸱

2016年1月19日

 ,  , 
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

水系からの金の収着とリサイクルに関する基本的な情報を得るために、S層タンパク質上のAu(III)とAu(0)ナノ粒子の相互作用を調査しました。タンパク質ポリマーの吸着はICP-MSで、タンパク質性単分子膜の吸着はQCM-Dで調べました。その後のAFMにより、ナノ構造のイメージングが可能になります。

要約

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この出版物では、Lysinibacillus sphaericus JG-B53の表層(S層)タンパク質(Slp1)の金吸着挙動が記載されています。これらの生体分子は、表面上に常結晶性2次元配列に配置され、金属を結合するため、環境や工業プロセスからさまざまな元素を除去または回収するための生体吸着材料など、いくつかの生物工学的用途にとって興味深いものです。S層指向合成1またはナノ粒子の吸着のいずれかによって、S層上にAu(0)ナノ粒子を堆積させることは、多様な官能的応用のための新たな可能性を開きます。S層2-5の生体吸着特性については数多くの研究が述べられていますが、タンパク質-タンパク質およびタンパク質-金属相互作用をより深く理解することは依然として困難です。以下の研究では、誘導結合質量分析(ICP-MS)を使用して、懸濁S層による金属吸着を検出しました。これは、たんぱく質単分子膜の形成と金属沈着のオンライン検出を可能にする散逸モニタリング付き水晶振動子マイクロバランス(QCM-D)の測定と相関しており、したがって、金属結合に関するより詳細な理解が可能になりました。

ICP-MSの結果は、懸濁したS層ポリマーへのAu(III)の結合がpHに依存することを示しました。Au(III)の最大結合はpH 4.0で得られました。QCM-Dの調査により、in situ実験中にAu(III)の収着とAu(0)-NPの沈着をリアルタイムで検出することができました。さらに、この方法により、Slp1のタンパク質格子安定性に対する金属結合の影響を研究することができ、構造特性とタンパク質層の安定性は、原子間力顕微鏡(AFM)を使用してQCM-D実験の直後に視覚化することができました。結論として、これらの異なる方法を組み合わせることで、懸濁液中の細菌S層タンパク質、または細菌細胞または再結晶表面上の単層としての細菌S層タンパク質による金属結合についてより深い理解が得られます。

概要

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原因エレクトロニクス、触媒、バイオセンサ、または医療機器のようないくつかのアプリケーションのための金の使用の増加に、この貴金属の需要はここ数年の時間6-9かけて成長してきました。重鎖または貴金属、最も環境汚染は継続的なプロセスであるが、金だけでなく、他の多くの貴重な重金属は、鉱業活動を通じて、希薄濃度の工業排水を経て環境中に放出され、廃棄物処理7,8,10されています主に技術的な活動によって引き起こされます。これは、自然の生態系の重要な干渉につながり、潜在的に人間の健康9を脅かします。これらの負の結果を知ることは、工業廃水からの金属のリサイクルに汚染された生態系や改善点から金属を除去するための新しい技術の探索を推進しています。沈殿又はイオン交換のような十分に確立された物理化学的方法には、特に高で、それほど効果的ではありませんLYは、溶液7,8,11に希釈しました。バイオソープションは、いずれかの生きているか死んバイオマスで、廃水処理10,12のための魅力的な代替です。そのような生物学的材料の使用は、毒性化学物質の消費量を低減することができます。多くの微生物は、蓄積又は金属を固定するために記載されています。例えば、Lysinibacillusのスフェリカスの細胞が（L.スファエリカス ）JG-A12は、貴金属のための高い結合能力を示している、例えば、パラジウム（II）、白金（II）、金（III）、及びPbのような他の有毒金属（II）またはU（VI）4,13、クロム（VI）14のためのバチルス・メガテリウムの細胞、金のために白金（II）およびPd（II）15、及びクロレラ下品ためのサッカロマイセス・セレビシエの細胞（III）とU（VI）16 、17。金（III）、パラジウム（II）、およびPt（II）のような前の金属の結合はまた、 デスルホビブリオ18およびL.ためのdesulfuricansについて報告されていますスフェリカス JG-B53 19,20。それにもかかわらず、ではないアルリットルの微生物は、金属を大量に結合して、収着材料としての用途は限ら12,21です。また、容量の金属結合は、異なるパラメータ、 例えば、細胞組成物、使用されるバイオコンポーネント、または環境や実験条件（pH、イオン強度、温度など）に依存します。単離された細胞壁断片22,23の研究は、膜脂質、ペプチドグリカン、タンパク質、または他の構成要素と同様に、複雑な構築全細胞8,21のプロセスを結合金属を理解するのに役立ちます。

この研究に着目セル構成要素は、S層タンパク質です。 S層タンパク質は、多くの細菌及び古細菌の外側細胞エンベロープの一部であり、それらは、約15を構成する - これらの生物の全タンパク質質量の20％。環境への最初のインターフェイスとして、これらの細胞の化合物は、強く、細菌の吸着特性3に影響を与えます 。 40の範囲の分子量を有するS層タンパク質kDaでの数百の細胞内で生産され、それらは脂質膜または高分子の細胞壁成分に層を形成することができる場合に外部組み立てられます。一旦単離されると、ほぼ全てのS層タンパク質は自発的に界面で、または平面または管状の構造体3を形成する面に、懸濁液中で自己集合する固有の特性を有しています。タンパク質の単分子層の厚さは、細菌に依存し5の範囲内である- 25nmで24。一般に、形成されたS層タンパク質の構造は、35ナノメートル3,24に対して斜め（P1またはP2）、正方形（P4）、または六角形（P3またはP6）2.5の格子定数との対称性を有することができます。格子形成は、二価の陽イオンに依存して、主のCa 2+ 25,26、ラフ、Jらに多くのケースであるように思われます。 S層タンパク質ベースのエンジニアナノ構造における産業用アプリケーションに基づくナノコンポジット。 （編Tijana Z.グローブ＆Aitziber L. Cortajarena）（スプリンガー、2016（提出））。それにもかかわらず、特に例えば、Ca 2+およびMg 2+などの二価カチオンのモノマーの折り畳み、モノマー-モノマー相互作用、格子を形成し、異なる金属の役割の完全な反応カスケードは、まだ完全には理解されていません。

グラム陽性菌株L. 27（新系統発生的分類した後、バチルス・スファエリカスから改称） スフェリカス JG-B53はウラン鉱山廃棄物の山「ハーバーランド」（Johanngeorgenstadt、ザクセン、ドイツ）4,28,29から単離しました。その機能S層タンパク質（SLP1）は正方格子、116 kDaで30の分子量、および細菌細胞31生きに ​​≈10nmの厚さを有しています。以前の研究では、約10nmの厚さで閉じ、安定したタンパク質層のインビトロでの形成は10分未満19で達成されました。関連菌株L.スフェリカス JG-A12は、また「ハーバーランド "パイルからの分離株は、高い金属結合能力を有し、その単離されたS層タンパク質は、Auのような貴金属のための高い化学的および機械的安定性と優れた吸着率を示した（III）、白金（II）、およびPd（II）4,32,33。貴金属のこの結合は、いくつかの金属について多かれ少なかれ特異的であり、ポリマーの外側及び内側タンパク質表面上及び細孔内の官能基、イオン強度、およびpH値の利用可能性に依存します。 、OH - 、PO 4 - - 、SO 4 - 、およびSO-タンパク質による金属相互作用に関連する官能基は、COOH-、NH 2です。原理的には、金属結合能力は、アプリケーション、 ラフ、Jらの広いスペクトルを開きます。 S層タンパク質ベースのエンジニアナノ構造における産業用アプリケーションに基づくナノコンポジット。 （編Tijana Z.グローブ＆Aitziber L. Cortajarena）（スプリンガー、2016年（提出））。 例えば、除去又は回復のためbiosorptiveコンポーネントとして溶解毒性または有価金属の、合成または触媒反応、およびバイオ感覚層3,5,18,33のような他の生体工学材料のため、定期的に構造化金属ナノ粒子（NPS）の定義された堆積のためのテンプレート。 Auのような規則的に配置されたNPアレイ（0）-NPsはCO酸化34-37ための分子エレクトロニクスやバイオセンサー、超高密度記憶装置、および触媒に至るまでの主要な用途のために使用することができます。このようなアプリケーションや、これらの材料のスマートなデザインの開発は、基礎となる金属結合メカニズムのより深い理解を必要とします。

このようなバイオベース材料の開発のための前提条件は、生体分子と技術面38,39との間の界面層の信頼できる実装です。例えば、高分子電解質は、S層タンパク質39の再結晶化のための界面層として使用されているレイヤー・バイ・レイヤー（のLbL）技術40,41に組み付け。このようなインタフェースは、再現可能かつ定量的な方法でタンパク質コーティングを実行するための比較的簡単な方法を提供しています。接着剤プロモーターと変更することなく、種々の実験を行うことで、コーティング速度、層の安定性、および生体分子19,42、ラフ、J.らと金属との相互作用に関する記述することが可能です。 S層タンパク質ベースのエンジニアナノ構造における産業用アプリケーションに基づくナノコンポジット。 （編Tijana Z.グローブ＆Aitziber L. Cortajarena）（スプリンガー、2016年（提出））。しかし、タンパク質吸着およびタンパク質 - 表面相互作用の複雑なメカニズムは完全に理解されていません。特に立体構造、パターンの向き、コーティング密度の情報がまだ不足しています。

消費モニタリング（QCM-D）技術で水晶マイクロバランスは、タンパク質吸着、コーティング速度を研究するためのツール、および対話プロとして近年注目を集めていますナノメートルスケール19,43-45上セス。この技術は、リアルタイムで大量の吸着の詳細な検出を可能にし、タンパク質格子19,20,42,46-48に機能性分子のタンパク質自己集合プロセスと結合するための指標として用いることができます。また、QCM-Dの測定は、天然の生物学的条件下でのタンパク質性の層と金属の相互作用の過程を研究する可能性を開きます。最近の研究において、Euのような選択された金属とS層タンパク質の相互作用（III）、金（III）、パラジウム（II）、およびPtは（II）QCM-D 19,20で検討されています。吸着したタンパク質層は、グラム陽性細菌の細胞壁の単純化モデルとしての役割を果たすことができます。この単一の成分の研究では、金属相互作用のより深い理解に寄与することができます。しかし、単にQCM-D実験は、タンパク質に金属の表面構造と影響に関する記述を許可していません。他の技術は、そのような情報を得るために必要です。 One POSイメージングバイオナノ構造のための任及び構造特性情報を取得するには、原子間力顕微鏡（AFM）です。

提示研究の目的は、特にL. SLP1に、S層タンパク質に金（Au（III）とAu（0）-NPs）の収着を調査することでしたスフェリカス JG-B53。 ICP-MSを使用して5.0とQCM-Dを使用して固定化されたS-層と - 実験は、2.0のpH範囲内のバッチスケールで懸濁タンパク質を用いて行きました。さらに、格子の安定性に対する金属塩溶液の影響は、その後のAFM研究で調査しました。これらの技術の組み合わせは、特定の金属親和性について細菌細胞全体のイベントを結合についての詳細を学ぶためのツールとして、in vitroでの金属相互作用プロセスのより良い理解に貢献しています。この知識だけでなく、環境保護のための金属の回収のために適用可能なフィルター材料の開発と再の保全のために重要です49だけでなく、様々な技術的なアプリケーションのための高度に秩序化された金属NPのアレイの開発のためのソース。

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プロトコル

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1.微生物および栽培条件

注：すべての実験は、無菌条件下で行われたL.。スフェリカス JG-B53は、凍結保存培地29,30から得られました。

  1. 300ミリリットルのクリーンベンチの下に転送凍結保存培養物（1.5ミリリットル）の滅菌栄養ブロス（NB）メディア（3グラム/ Lの肉エキス、5グラム/ Lペプトン、10グラム/ LのNaCl）。その後、培養のために前培養物を得るために、30℃で少なくとも6時間溶液を攪拌します。
  2. 70 Lに、pH値= 7.0で、30℃をNB培地で好気的条件下で細菌を育てるには、蒸気インプレースバイオリアクターをスケールされました。したがって、≈57 L脱イオン水で原子炉を埋めます。バイオリアクターに直接固体NBメディアを追加し、溶解（濃度は、上記参照）。
    1. さらにメディアをオートクレーブ（122°C、温度保持時間30分）、培養中の泡の形成を抑制するために培地に消泡剤（30μL/ LのNB-メディア）を追加原子炉施設の内部。
  3. メディアをクールダウンし、完全な酸素飽和度を実行します。 （1 MH 2 SO 4と2 M NaOHを用いて）pHを7.0に調整し、300ミリリットル前培養の自動接種を開始します。接種ポイントで栽培パラメータのデータの記録を開始します。栽培中の例えば オンラインパラメータ、溶存酸素レベル（2 DO）、酸及び塩基付加、およびpH値を記録します。
    1. 非侵襲的な濁度測定によりオンライン細菌の増殖を監視します。
  4. 栽培の毎時間後に追加のサンプリングを行い、そのようなバイオ乾燥重量（BDW） とオフラインの光学密度（OD）としてさらにパラメータを決定。したがって、無菌条件下で各サンプリング点で20ミリリットルの培養ブロスを収集します。
    1. 600nmでの吸収の光度測定によってオフラインでODを決定します。ブランク値として無菌ろ過NB培地を使用してください。船尾にER吸着に到達することは> 0.4は、ランベルト・ベールの法則の直線以下の細胞懸濁液を希釈します。
    2. 細菌懸濁液を5mlのBDW遠心分離機1の決意を室温で5分間、5,000×gで（細胞密度に応じて）。質量安定性までの加熱炉で105℃で得られた細胞ペレットを乾燥させ、ペレットの質量を測定します。
  5. 細菌の増殖を確認するため、クロスコンタミネーションコントロールとして400〜1000倍の倍率（それぞれ位相差コンデンサー2および3）に光位相コントラスト研究顕微鏡で顕微鏡画像を取ります。
  6. オンラインで検出された指数増殖期に達した後、2、オンライン濁度を行う15,000×gでフロースルー遠心分離によりバイオマスを収穫、4℃、標準緩衝液（50 mMトリス、10mMのMgCl 2を、3 mMので二回バイオマスを洗いますNaN 3、pH値= 7.5）。
    注：得られたバイオマスのペレットを-18＆＃で保存することができます176; C分離のためのさらなる使用まで。

2. S層タンパク質の単離および精製

注意：以前に2,19,30,32,50,51説明したように適応した方法に従ってSLP1ポリマーを精製します。

  1. 4℃で冷却氷浴下分散機（レベル3、10分）を使用して、鞭毛を削除するには：（1（）w / vの1）標準緩衝液で栽培から得られる洗浄し、解凍し、粗バイオマスを均質化します。
  2. 懸濁液（8,000×gで、20分間、4°C）を遠心分離し、標準的な緩衝液で2回得られたペレットを洗浄し（1：1（W / V））。洗浄、遠心分離（8,000×gで、20分間、4℃）した後、標準的なバッファーを用いてペレットを再懸濁（1：1（W / V））、懸濁液にDNアーゼIIおよびRNase（0.4単位/ gのバイオマス）を追加し、崩壊します高圧ホモジナイザー1,000バーで細胞。その後、27,500×gで1時間4℃のサスペンションを遠心します。
    注：研究MIとコントロール細胞懸濁液をcroscope。 3無傷の細胞400倍の倍率で顕微鏡の視野に表示されている - 2未満のときに破裂が完了します。
  3. 標準緩衝液で2回ペレットを洗浄（1：1（w / vで））し、再び遠心分離を行います。その後、標準的な緩衝液中にペレットを再懸濁し（2：1（W / V））、1％トリトンX-100と混合し、脂質沈着物を可溶化するために連続振盪（100 rpm）で下に20分間それをインキュベートします。
  4. 遠心分離機溶液（27,500×gで、1時間、4℃）、標準緩衝液で得られたペレットを3回洗浄し（1：1（W / V））。
  5. 標準緩衝液中で6時間、追加の遠心分離（27,500×gで、1時間、4℃）後に得られたペレットをインキュベートし（1：1（W / V））ペプチドグリカン50で結合を加水分解するためには0.2g / Lのリゾチームと混合。さらに懸濁液にDNアーゼIIおよびRNase（各0.4単位/ gのバイオマス）を追加します。
  6. 遠心分離後（45,500×gで、4℃、1時間）は、Tの低容量と上部白タンパク質相を再懸濁彼は、タンパク質サブユニットを含有する上清（<30 ml）を遠心分離します。
  7. 6 M塩酸グアニジン（6 MのGuHCl、50mMのトリス、pH値= 7.2）で1：1に混合することにより、白色の懸濁液を可溶化します。解決策は明るくなります。
  8. 追加の高速遠心分離（45,500×gで、1時間、4℃）に続いてのGuHCl処理液の滅菌濾過（0.2μm）を実行します。
  9. 透析膜チューブ（MWCO 50,000ダルトン）に上清を移し、48時間再結晶化バッファー（1.5 mMトリス、10mMのCaCl 2を、pH値= 8.0）に対してそれを透析しました。
  10. 45,500×gで、1時間4℃でチューブと遠心分離機に白の再結晶タンパク質ポリマー溶液を移します。超純水（<30ミリリットル）の低容量でペレットを再懸濁。
  11. その後、透析膜チューブに懸濁液を移し、バッファーの内容を削除するために24時間超純水に対して透析を行います。
    注：いくつかのバッファの変更や超純水During透析が不可欠です。
  12. 凍結乾燥機で精製SLP1を凍結乾燥。

実験3.特性とSLP1の定量

注：収着およびコーティング実験のためSLP1濃度は、UV-VIS分光光度法により定量しました。

  1. 直接光度計の低い測定台座の上に溶解SLP1サンプルのピペット2μL。タンパク質についての特性、波長280 nmの吸着最大でタンパク質濃度を決定します。 SLP1濃度を決定するために、0.61の吸光係数を使用してください。基準測定用SLP1無料のソリューションを使用してください。
  2. 実験（1 G / L及び0.2グラム/ Lのために所望の濃度に（0.9％のNaClを使用してバッチモードで吸着実験はpH = 6.0およびQCM-D実験は、再結晶化バッファを使用するため、でpH = 8.0）緩衝液でタンパク質を希釈それぞれ）。
  3. 標準bioanalによってSLP1品質および分子量を分析Laemmli、UK 52記載ytical方法ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）。
    1. 10％ポリアクリルアミド分離ゲルを用いたAu（0）-NPのインキュベーション後に、実験および例えば内SLP1を使用する前に、SDS-PAGEを行います。
    2. サンプルバッファーで栽培またはタンパク質サンプルの≈10μlのSDS-サンプルミックスの場合（1.97グラムTRISは、5 mgのブロモフェノールブルー、5.8ミリリットルグリセリン、1グラムのSDS、βメルカプトエタノール2.5ミリリットルを、50ミリリットルの超純水で満たす）で比1：1（v / v）のゲルポケットに95℃で4分間のインキュベーションの後、混合物をピペット。
    3. 60 Vの電圧で動作し、SDS-PAGE 30分のサンプルは、分離ゲルを通過したら、120 Vに収集ゲルと変化電圧を渡すまで。
    4. ゲル系からゲルを外し、固定液（10％酸性酸、50％無水エタノール）に1時間超純水と場所で洗い流し。その後、超純水でゲルをすすぎます。
    5. ステインゲル適応非特異コロイドクマシーブリリアントブルー法53,54を使用します。 72,73を脱色した後、製造業者のプロトコルに従って、ゲルドキュメンテーションシステムによって、SDS-PAGEの画像を撮影します。

バッチモードおよび金属定量4.収着実験

  1. バッチ吸着実験のために金属塩を希釈および1mMの初期金属濃度とは1g / Lの最終SLP1濃度にSLP1 / NaCl溶液と混合、H 2 O 3∙のHAuCl 4の金（III）ストック溶液を調製。 SLP1のない追加の陰性対照とトリプレットで実験を行います。吸着実験のために5ミリリットルの全容量を使用してください。
  2. （低濃HClおよびNaOH溶液でpHを調整）24時間2.0〜5.0の間で異なる事前調整されたpH値で、室温で連続的にサスペンションを振ります。
  3. 吸着した後、20分間の遠心15,000×gで、4℃でのサンプル）SEPARへ上澄み液からSLP1を食べました。
  4. 溶解したタンパク質の単量体を除去するために、20分間、15,000×gで4℃での限外濾過チューブに上清（MWCO 50,000 Da）で遠心これを転送します。
  5. ICP-MS 19,20によって得られたろ液中の金属濃度を決定し、SLP1乾燥質量によって収着金属のバック計算の結果を使用しています。原理を測定する方法及び使用済みICP-MSの構成要素の機会が、文献55に記載されました。
    1. 内部標準（1 mg / mlの）とマトリックスとロジウムとして1％のHNO 3を用いて、ICP-MS測定用の試料と参照を準備します。

5.金-NPの合成と粒子サイズの決意

注：クエン酸は、Au（0）-NPはMühlpfordt、H.らの前述の適合方法に従って合成した安定しました。 （1982）の直径を有する球状粒子を得た10 - 15ナノメートル56,57 。

  1. NPの形成のために、安定化の25mMのHAuCl 4∙3 H 2 Oの在庫を準備します。
  2. 19.75ミリリットル超純水に、このストック溶液の250μLを希釈し、連続振とう下で15分間、61℃でこれらをインキュベートします。
  3. 第二ストック溶液5ml（12mMのタンニン酸、7 mMのクエン酸ナトリウム二水和物、0.05 mMのK 2 CO 3）を用意し、15分間61℃で別々に2 番目のソリューションをインキュベートします。
  4. 定数は、溶液1に2 番目の原液を攪拌下に追加します。 61℃で少なくとも10分間、反応混合物を撹拌しました。その後、溶液を冷却し、QCM-D実験内SLP1格子上のNPコーティングのためにそれを使用します。
    注：得られたAu（0）-NPは、典型的に形成されたAu（0）58 -NPsの検出のために使用される520nmでの吸光度の最大でUV-VIS分光法で特徴づけました。溶液を4℃で保存することができます。
  5. 形成の大きさを分析また、動的光散乱として知られて光子相関分光法（PCS）によって金（0）-NP。
    1. NPサイズの決意について、層流ボックス内で無塵の条件でキュベットに合成金（0）-NP溶液1.5mlを転送し、サイズおよびゼータ電位、粒子寸法測定器でそれを分析します。 PCSおよび試料調製の詳細な説明はSchurtenberger、P.らに記載されています。 （1993）59、ジャイナ、R。ら。 （2015）60。

6. QCM-Dの実験 - SLP1格子の上表面上SLP1コーティングとAu-NP吸着

注：測定は、最大4つの流れモジュールを搭載したQCM-Dを用いて行きました。すべてQCM-D実験は、25℃で125μL/分の一定の流速で行いました。 SLP1コーティングおよび金属/ NPのインキュベーションは≈5 MHzでの基本周波数とSiO 2の圧電ATカット水晶センサ（Ø14ミリメートル）で行いました。すすぎ工程およびアドオンソリューションのitionは、代表的な結果の一部を図にマークされています。 QCM-D実験はSLP1の再結晶化により、後に金属と金属のNPの相互作用に続いて使用されるセンサーのクリーニングや表面改質で始まるステップの方法によりステップとして記述することができます。

  1. 清掃手順：
    1. センサーダミーと流体セルを装備。ポンプ少なくとも20 mlのスルーQCM-D及びチューブシステム（超純水（v / v）の2％の洗浄剤）、アルカリ性液体洗浄剤の（モジュールごとにそれぞれ）。その後システムを介して超純水の五倍の体積を（各モジュールあたり）ポンプ（300μL/ minに速度をアップフロー）。製造業者のプロトコルに従って、クリーニングを行ってください。
    2. 2％SDS溶液中でのインキュベーション（少なくとも20分）により、フローモジュール外のSiO 2のセンサーを清掃し、超純水61,62と、その後数回のセンサーをすすぎます。
    3. フィルタリングコンプの結晶を乾燥させ空気をressedと20分63,64のためのオゾン洗浄室に配置します。
    4. すべての有機内容を削除するために二回の洗浄手順を繰り返します。
    5. センサ表面から結合金属を除去するには、1 M HNO 3でセンサーをすすぎます。その後、超純水ですすぎ、すべての手順を実行します。
  2. 高分子電解質によってセンサ表面改質：
    注意：表面改質はいずれかの内部（手順を流れる）またはフローモジュール（のLbL技術）の外に行うことができます。これらの実験の範囲内の表面を変更するには、以下の方法を使用しました。
    1. 3グラムによって記事に特別に使用されるシステムについて前述のLbL技術40,41を用いて、ディップコーティングを介したポリエチレンイミン（PEI、MW 25,000）とポリスチレンスルホン酸（PSS、MW7万）の交互のPE層の/ Lのセンサーを変更Suhrの、M。ら。 （2014年）19。
    2. 深いワットで適切なPE-ソリューション内部のセンサーを配置エルプレートし、室温で10分間これらをインキュベートします。
    3. PE-溶液からセンサーを取り出し、超純水で集中的にすべてのディップコーティング工程の間にセンサーをすすぎます。
      注意：新たな表面改質は、正に荷電したPEIで少なくとも三つのPE層の終端から成ります。
    4. この外部変更後の流れモジュール内のセンサーを配置し、実験を開始する前に、超純水でリンスすることによってセンサーを平衡化。
  3. SLP1単層の再結晶：
    1. モノマーのポリマーへの変換のための4 M尿素SLP1を溶解します。
    2. 単量タンパク質15,000×gで1時間4℃で遠心分離し、より大きなタンパク質凝集物を除去します。
    3. 0.2g / Lの最終タンパク質濃度に再結晶化緩衝液で可溶化し、遠心分離SLP1上清を混合します。
      注：SLP1（自己組織化）のカルシウムによって再結晶化は、RECの添加により開始しますrystallizationバッファ。したがって、すぐに（流れモジュールの内部に配置）センサ125μL/ minの流量で混合した溶液をポンプ。再結晶は、QCM-D実験内で検出された周波数と消費シフトの安定した値の後に行われます。
    4. 周波数と消費シフトの安定した値が検出されるまでの流れモジュール内部のPE-修正センサの上部に成功したタンパク質の再結晶後125μL/ minの流量でwaterintensively再結晶バッファまたは超純でコーティングされたセンサーをすすぎます。
      注：SLP1単層およびAFMの研究への吸着後の実験のためにPEのSiO 2表面改質は 、図1に可視化されます。

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図1.回路図デザインのPE表面改質とSLP1単層のコーティング;この図はSuhrの、M。らから変更されています。 （2015年）19スプリンガーから許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 金属および金属NP相互作用：
    注：Au金属塩溶液（のHAuCl 4∙3 H 2 O）との吸着は、pH = 6.0で0.9％NaCl溶液で1 mMのまたは5mMの濃度で行いました。金-NP吸着は、pH≈5.0で1.6 mMの三ナトリウム - クエン酸緩衝液中で希釈されていない金-NPを用いて行きました。
    1. 周波数及び散逸シフトの安定した値が検出されるまでのフローモジュールに成功SLP1コーティングした後、0.9％NaCl溶液で激しく得SLP1層をリンス。
    2. 125μL/ minの流量でフローモジュールに準備された金属溶液（1ミリモル）及びNP溶液をポンプおよびSLに大量の吸着を追跡P1層。質量吸着のSauerbrey式（ 式1）を参照して周波数シフトを追跡することにより直接検出することができます。
    3. 金属および金属NPの相互作用を完了した後、弱い結合又は弱い添付金属またはナノ粒子を除去するために、金属/ NP空きバッファを持つ層をすすぎます。
      注：実験の図を図2に示されています。

figure-protocol-2
図2 * 66 401フロー・モジュールQFMを使用して、QCM-Dのセットアップの概略設計 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. データの記録と評価 ：
    1. ヘルツ（たΔfn）と損失（ΔDnは周波数の変化を記録します）QCM-D固有のソフトウェアを使用して、QCM-D実験内。
    2. 倍音n番目に適用されるセンサ表面に摩擦なし接続された薄くて硬質フィルムに対して有効である吸着質量感度（量Δm）のSauerbrey方程式/モデル（ 式1）65 66の評価のために使用します。カット水晶センサーで使用する5 MHzのための項C（のSauerbrey定数）は17.7 ngの∙ヘルツ-1∙cm -2で68です。剛性のために、均等に分布しており、十分に薄い吸着層は、良好な近似として式（1）を使用しています。
      figure-protocol-3
    3. メーカー固有のソフトウェアとの粘弾性分子68〜71の有効なケルビン・フォークトモデルに応じて追加のモデリングを行い、のSauerbreyモデルのそれと結果を比較します。
    4. 層の厚さの計算および質量吸着用重要なモデルパラメータとして1.35の吸着層の密度G∙cm -3のS層タンパク質72〜75について前述した値に相当します。タンパク質性の層と金属の相互作用の計算のために同じ値を使用します。

7. AFM測定

  1. 倒立光学顕微鏡で完全に行うことができ、AFMを用いた研究を行います。
    1. コー​​ティングされたQCM-Dセンサに直接再結晶化緩衝液または超純水を用いた液体のレコードAFM像。
    2. QCM-D実験後に超純水でセンサを洗浄し、AFM流体セルの内部に配置します。したがって、約1.5ミリリットルの総容量で、閉じた流体セルを使用しています。 30℃での流体セルの温度を一定に保ちます。
    3. 水に≈25 kHzでの共振周波数と<0.1 ​​N / Mの剛性とカンチレバーを使用してください。 2.5から10μm/秒の間のスキャン速度を調整します。
      4. 動的接触モードで画像を取ります。 76減衰振動によって表面にカンチレバーの距離を決定します。
      注：Z値は、表面の正確な形状を表している高さの画像は、zスケールで示しています。振幅Z値は、走査パラメータに依存し、限られた情報を負担するため、振幅（擬似3D）画像は、zスケールなしで示​​されています。画像の解析は、3つの異なる評価ソフトウェアの77を用いて行きました 。

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結果

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微生物およびSLP1キャラの育成

細菌増殖の記録されたデータは、約5時間で指数増殖期の終わりを示します。以前の研究は、それにもかかわらず、定義されたメディアコンポーネントを使用して、培養の最適化またはfed-。最大収率19 4.36グラム/ L（SLP1は収穫のこの時点から単離することができることを湿潤バイオマス（≈1.45グラム/ L（BDW））を示していますバッチ培養戦略これは産業用アプリケーションのためのバイオマスの大量の使用を不可分である。高いバイオマス収量につながる。 オンラインとオフラインの記録栽培パラメータは、図3（a）に要約されてからの値。顕微鏡制御（ 図3B）時L.スフェリカス JG-B53の収穫ショー非胞子形成細胞の。

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ディスカッション

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この研究では、異なる分析方法の組み合わせを用いて調べたS層タンパク質の金の結合を研究しました。具体的には、金の結合は、例えば 、感覚面鉱業水またはプロセス溶液から金を回収するだけでなく、材料の建設のためだけでなく、非常に魅力的です。 Auの相互作用の研究のために金（Au（III）及びAu（0）-NPs）に懸濁し、SLP1の単層を再結晶化して、タンパク質が持っていたが単離されます。したがって、本研究では、グラム陽性菌株L.の成功した培養を示していますスフェリカス JG-B53と表層タンパク質SLP1の分離。それにもかかわらず、栽培やタンパク質の分離が困難なままであり、最適化されなければなりません。バイオマスとS層タンパク質の大規模生産は、金属選択フィルタ材料の製造のために、例えば 、両方の工業的応用のための前提条件です。その応用の可能性があるundoubtedl有毒金属の除去または処理水に溶解させた有価金属の回収、排水、または排水のための高Y。さらに、S-層の適用可能性は、このようなバイオセンサーおよび触媒として他の生体触発材料、での追加の可能性を考慮しても大きくなっ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究の一部はBMWiとBMBFプロジェクト」Aptasens」（BMBF / DLR 01RB0805A）が資金を提供し、IGF-プロジェクト「S-ふるい」（490 ZBG / 1）によって資金を供給されました。英語のネイティブスピーカーとして原稿を読み取るためのAFM研究中およびエリックV.ジョンストンへの彼の貴重な助けのためのトビアス・J・ギュンターに感謝します。さらに、この論文の著者は、Manjaフォーゲル、ナンシーアンガー、カレンE. Viacavaとヘルムホルツ研究所のグループバイオテクノロジー（ICP-MS測定における支援のためのリソースエコロジー研究所から）アリーンリッターとサブリナGurlitに感謝したいと思います資源技術のためのフライベルク。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot SystemApplikon Biotechnology, NetherlandsZ6XdO2, Applikon BiotechnologyのpHセンサーとBioXpertソフトウェア V2
非侵襲的バイオマスモニター BugEye 2100BugLab, Concord (CA), USAZ9X---
SpectrometerUltrospec 1000Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain80-2109-10Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifugeVWR, Germany521-2844For centrifugation of cultivivation
研究システム顕微鏡 BX-61Olympus Germany LLC, Germany037006イメージングソフトウェアと組み合わせた顕微鏡
Cell^P (version 3.1)オリンパスソフトイメージングソリューションズLLC、Münster, Germany---with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-SCarr Centritech, Florida, USA9010PLTバイオマス収穫用
T18 basic Ultra TurraxIKA Labortechnik, Germany431-2601べん毛の除去とサンプル均質化用
Sorvall Evolution RC Superspeed CentrifugeThermo Fisher Scientific, USA728411タンパク質の分離に使用
移動式高せん断流体プロセッサ、M-110EH-30 パイロットマイクロ流体工学、マサチューセッツ州、米国M110EH30K細胞破裂に使用
Alpha 1-4 LSC 凍結乾燥機Martin Christ 凍結乾燥機LLC、オステロード、ドイツ102041---
UV-VIS 分光光度法 (NanoDrop 2000c)Thermo Fisher Scientific, USA91-ND-2000C-Lタンパク質の測定用濃度
Mini-PROTEAN 縦型電気泳動チャンバーBio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany165-3322For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany1708030SDS-PAGEゲルのイメージングに使用
ICP-MS Elan 9000PerkinElmer, Waltham (MA), USAN8120536金属濃度
の測定に使用Zetasizer Nano ZSMalvern Instruments, Worcestershire United KingdomZEN3600ナノ粒子径測定用
Q-Sense E4デバイス Q-Sense AB、ヨーテボリ、スウェーデンQS-E4LOT quantum design で注文 (E4 プラットフォームに付属するソフトウェア)
Q-Soft 401 (データ記録)Q-Sense AB、ヨーテボリ、スウェーデン
Q-Tools 3 (データ評価とモデリング)Q-Sense AB、ヨーテボリ、スウェーデン
QCM-D フローモジュール QFM 401 Q-Sense AB、ヨーテボリ、スウェーデンQS-QFM401LOT quantum design
QSX 303 SiO2圧電ATカットクォーツセンサーQ-Sense AB、ヨーテボリ、スウェーデンQS-QSX303LOT量子設計で注文
オゾン洗浄室Bioforce Nanoscience、エイムズ(IA)、米国QS-ESA006LOTで注文 量子設計
原子間力顕微鏡 MFP-3D Bio AFMAsylum Research、サンタバーバラ(CA)、米国MFP-3DBioAFM測定およびイメージングソフトウェア
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223Asylum Research, Santa Barbara (CA), USAイメージングソフトウェアがCatに含まれています。いいえ。MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 SoftwareWaveMetrics, Inc., USA---イメージングソフト Cat.いいえ。MFP-3DBio
BioHeaterAsylum Research, Santa Barbara (CA), USABioheaterAFM測定用サンプルヒーター
Biolever mini cantilever, BL-AC40TS-C2Olympus Germany LLC, ドイツ BL-AC40TS-C2AFM測定用カンチレバー
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)Nanotec Electronica S.L. , SpainフリーウェアAFM解析用ソフトウェア
NameCompanyカタログ番号コメント
洗剤およびその他の機器
酸性酸、100%、p.A.カールロスGmbH + CO。KG3738.5危険、可燃性、腐食性の液体および蒸気。重度の皮膚や目の損傷を引き起こします。
消泡剤 204Sigma-Aldrich Co., LLC.A6426泡沫抑制用
ブロモフェノールブルー、ナトリウム塩Sigma-Aldrich Co. LLC.B5525---
クーマシーブリリアントブルーR (C45H44N3NaO7S2)CARL ROTH GmbH+CO.KG3862.1
---デオキシリボヌクレアーゼII 豚脾臓由来Sigma-Aldrich Co., LLC.D4138Typ IV , 2,000 - 6,000  クニッツ単位/ mgタンパク質
エタノール、95%VWR、ドイツ20827.467危険、可燃性
グリセリン、PAカールロスGmbH + CO。KG3783.1---
グアニジン塩酸塩(GuHCl)CARL ROTH GmbH + CO。KG0037.1
---Hellmanex IIIHellma GmbH & Co. KG9-307-011-4-507---
塩酸 (HCl) (37%)CARL ROTH GmbH+CO.KG4625.2危険;腐食性、
鶏卵白のpH調整リゾチームSigma-Aldrich Co. LLC.L6876 凍結乾燥粉末、タンパク質= 90%= 40,000単位/ mgタンパク質(シグマ) 
加熱式マグネチックスターラー MR 3000KHeidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany504.10100.00実験中の標準攪拌機
NB-Media DM180Mast Diagnostica GmbH121800---
硝酸 (HNO3)CARL ROTH GmbH+CO.KGHN50.1危険;酸化性、腐食性
PageRuler 未染色タンパク質ラダーThermoScientific-Pierce26614---
ポリ(ナトリウム 4-スチレンスルホンナット) (PSS)Sigma-Aldrich Co. LLC.243051平均 MW ~70,000
ポリエチレン (PEI)、分岐Sigma-Aldrich Co. LLC.408727警告;有害、刺激性、環境に危険;平均 MW ~25,000
無水炭酸カリウム (K2CO3)Sigma-Aldrich Co. LLC.60108警告;
ウシ膵臓由来の有害なリボヌクレアーゼA シグマ・アルドリッチ(株)R5503I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
アジ化ナトリウム (NaN3)Merck KGaA106688危険; 非常に有毒で環境に危険
塩化ナトリウム (NaCl)CARL ROTH GmbH+CO.KG3957.2---
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)Sigma-Aldrich Co., LLC.L-5750危険性;有毒
水酸化ナトリウム(NaOH)CARL ROTH GmbH+CO.KG6771.1危険;腐食性、栽培およびpH調整内のpH調節に使用
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000 カールロスGmbH + CO。KG1893.1---
硫酸(H2SO4)CARL ROTH GmbH + CO.KGHN52.2危険;腐食性、栽培中のpH調節に使用される
タンニン酸(C < sub >76< / sub >H < sub >/ 52< / sub >O < sub > 46< / sub>)Sigma-Aldrich Co. LLC。16201---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl)CARL ROTH GmbH+CO.KG9090.2
---Triton X-100ロスGmbH + CO。KG3051.3警告;有害、環境に危険
VIVASPIN 500、50,000 MWCO 限外ろ過チューブザルトリウス AGVS0132---
β-メルカプトエタノールSigma-Aldrich Co. LLC.M6250危険、有毒
samples ---に使用されます なカール

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