三次元バイオミメティック・テクノロジー：小説Biorubberはコラーゲンハイドロゲルで定義されたマイクロ・マクロスケールのアーキテクチャを作成します。

サマリー

革新的なバイオファブリケーション技術が開発されました。これは、生体内の組織の建築的特徴、構成要素、機械的特性に似た3次元の構築物を設計するためです。この技術は、新開発の犠牲材料であるBSAゴムを特徴としており、詳細な空間的特徴を転写することで、さまざまな組織の生体内構造を再現します。

要約

組織足場は、組織再生の過程において重要な役割を果たしています。理想的な足場は、そのような適切な組成を有するなど、いくつかの要件、対象と弾性率、および明確に定義されたアーキテクチャ機能を満たす必要があります。 in vivoでの組織の本質的なアーキテクチャを再現生体材料は、疾患を研究するだけでなく、失われ、不正な形式の軟組織の再生を促進するために不可欠です。新規biofabrication技術は、研究および臨床用途のための生体材料の新世代を作成する技術の画像、3次元（3D）印刷法、選択的酵素活性の状態を組み合わせた開発されました。開発した材料、ウシ血清アルブミンゴムは、特定の幾何学的特徴を掲げ型に注入反応です。この犠牲材料は、天然の足場材料への建築の特徴を十分に転送できます。プロトタイプは4と3ミリメートルチャンネルのreprで3Dコラーゲン足場で構成されてい分岐構造をESENT。本論文では、自然の構築物の生成のためのこのbiofabrication技術の使用を強調しています。このプロトコルは、足場材料内にその建築の特徴を残して、ゴムの酵素消化に続いて、BSAゴムを注入し、反応になる固体の金型を製造するためのコンピュータ支援ソフトウェア（CAD）を利用します。

概要

組織工学の分野では、組織スキャフォールドを製造する能力が不可欠です。適切な組織足場は、3次元構造を有する、生体適合性材料から構成されており、 生体内組織アーキテクチャの模倣は、細胞および組織の増殖及びリモデリングを容易にします。この足場は、栄養素の輸送や廃棄物^1-4の除去を可能にしなければなりません。これらの足場の製造における主な障害の一つは、生体適合性材料に特有の幾何学的特徴を再現する能力です。いくつかのbiofabrication技術がこれらの足場の幾何学的特徴を制御するために報告されており、例としては、溶媒キャスティング^9、造形^{10 5-8}エレクトロスピニングされ、とりわけ^、11 3Dは、印刷します。これらの技術は、制御可能な内部および外部の建築の特徴を比較的容易に転送を提供するには及ばない高価であり、（彼らの解像度と印刷適性によって制限されています例えば、ノズルゲージ、材料の制限）、または実行可能な足場^{12を生成するために}長時間を必要後の製造技術を必要とします。

多くの商業的な製造システムでは、内部空隙、チャネル、および機能の作成は、砂または他の適切な取り外し可能または犠牲材料を使用して達成されます。金属又はプラスチック部品は、砂型の周囲に形成され、そしてそれが固化した後、砂を除去します。ほぼ同じ方法で、生体材料の次世代biosand相当を必要とします。したがって、BSAゴムはbiosandの代替品として開発されました。 BSAゴムはグルタルアルデヒドで架橋されたウシ血清アルブミンから成る新たに処方材料です。究極の目標は、生分解性コラーゲン足場に固有のアーキテクチャ機能を再作成することです。元の組織の型と次元の忠実度を維持し、犠牲biorubberの特性が記載されています。

BSA及びグルタルアルデヒド濃度のいくつかの組み合わせは、様々な溶媒を用いて試験しました。この材料は、BSAとグルタルアルデヒドとの反応によって作成されました。 BSAゴムは、組織の型の複雑な幾何学的形状に注入反応することができます。架橋されたBSAは、不安定なトリプシンと容易に穏やかなpHおよび温度条件で酵素によって消化されます。逆に、Iコラーゲン無傷のタイプは、トリプシン消化に非常に耐性です。これらの機能は、選択の背後にあるコラーゲンを残すBSAゴムを除去するために資産計上されました。本研究は、生体適合性足場に固有のアーキテクチャ機能を提供することができます不安定な金型を得るために必要な理想的なパラメータを決定から成っていました。評価された特定の特徴は、混合性、酵素消化、耐荷重、及び負の型に注入反応される能力が含まれていました。 30％BSA及び3％のグルタルアルデヒドとの組み合わせは、これらの要件を満たします。このプロトコルは、necessを提供aryのガイドラインは、これらの3次元足場を作成します。プロトタイプは1流入し、それぞれ4および3-ミリメートルの直径を持つ2つの流出路を有する分岐アーキテクチャを表すコラーゲン足場から構成されています。この技術は、対象の組織のマクロおよびミクロ環境を模倣する可能性を有します。この技術は 、生体内の組織の弾力性と関心の組織の他の特性を模倣するように調整することができる高忠実度、比較的容易かつタイムリーな問題で生分解性材料に固有の幾何学的な有益を提供するために実行可能な技術を提供します。

プロトコル

1.コラーゲンバッチ中の固形分の割合を決定

1. 以前に公開されている手順¹³以下のコラーゲンを抽出します。コラーゲンの20ミリリットルの最小値を解凍します。形成されたハイドロゲル中のコラーゲン濃度を操作するために、バッチ中のコラーゲン固形分の最初の割合を決定します。
   1. アルミ箔（約6×6センチ）の3枚をカットし、25ミリリットルのビーカーの底を使用して、パンなどの各1を形作ります。各パンの重量を記録します。
   2. 各パンにコラーゲンの少量を追加し、アルミニウムパンとコラーゲンの総重量を記録します。各アルミニウムパンにコラーゲンの0.8グラム - 0.5を追加します。
      注：このステップの後、そこに3アルミ箔鍋があり、それぞれ1はコラーゲンの少量を持っている必要があります。各（合計3）空のアルミニウム製パンの重量とコラーゲンの添加後のパンの重量を記録するようにしてください。
   3. Fを使用して各皿中のコラーゲンの量を計算します式をollowing：
      コラーゲン量=パンとコラーゲンの重量 - パンの重量
   4. 24時間100℃のオーブンでコラーゲンを保持する3アルミニウム皿を置きます。
   5. 24時間後、それぞれのアルミニウムパンと脱水コラーゲンの重量を記録します。
   6. 以下の式を用いて脱水したコラーゲンの量を計算します。
      脱水コラーゲン量=パン、脱水コラーゲン重量 - パン重量
   7. 以下の式を使用してコラーゲン固形分濃度を決定するための3つのサンプルのための固体の百分率を計算します。
      
   8. 3つのサンプルのそれぞれのためのコラーゲン固形分の割合を使用してバッチの平均コラーゲン固形分を計算します。
      注意：使用されるコラーゲンは、水和したコラーゲンから残っているものです。脱水コラーゲンのいずれも使用されません。
   9. 固体コラーゲンの割合を決定した後（ⅰバッチのnitialコラーゲン濃度）は、残りの水和したコラーゲンを使用し続けます。 3にコラーゲンバッチのpHを調整するために較正されたpHメーターを使用。
      1. 12 N塩酸（HCl）の少量（一度に2-5μl）を追加します。すべての回で、氷上で保管してください。コラーゲンに直接塩酸を追加しないでください - チューブの側面に酸を追加します。酸を添加した後、コラーゲンに酸をプッシュするためにスパチュラを使用してすばやく混合物をかき混ぜます。
   10. それは3のpHに到達すると、コラーゲンは4℃でO / Nを座らせて。

BSAゴムの調製

1. 以下に記載されている手順に従って、ウシ血清アルブミン（BSA）溶液を調製します。
   1. 2倍のリン酸緩衝溶液（PBS）を準備します。 0.02 M PBS溶液を作るために水100mlに2 PBS錠を追加します。
   2. 以下に示す手順を用いて30％BSA溶液を作成するために、2×PBSでBSAを兼ね備えています。
      1. 例えば、2×PBSの30ミリリットルと30％のBSAを作るために、BSAの12.9グラムを使用します。攪拌棒を備えたフラスコに2×PBS（ 例えば、10ミリリットル）の1/3を追加します。フラスコにBSA（ 例えば、6.45グラムのBSA）の1/2を追加し、スパチュラを用いて、乾燥溶質を濡らします。
      2. すべての溶質と溶媒をフラスコになるまでPBS、その後、BSAを追加するこのプロセスを繰り返します。すべての溶質を濡らすためにへらを使用します。これは、いくつかの液体と塊の混合物のようになります。それは約30分間座ってみましょう。
      3. そして、低サイクルに攪拌機をオンにし、攪拌棒周りに塊がないことを確認します。これは、溶液中のすべてを取得するために90分を取るべきか、4℃でO / N撹拌したままにすることができます。溶質がすべて溶解した後、20mLの注射器で溶液を配置し、0.20μmのシリンジフィルターでキャップ。フィルターを通して液体を排出し、新しいチューブで滅菌溶液を収集するためにプランジャーを押してください。 4℃で保存。
   3. 3％のグルタルアルデヒドsolutiを準備滅菌濾過し2倍PBSで25％グルタルアルデヒド溶液を希釈することにより、上。例えば、3％グルタルアルデヒド溶液を10mlのために、2~25％のグルタルアルデヒドmlの2×PBS 8mlのを使用。 4℃で保存。

3.金型の治療

注：このホワイトペーパーで説明したプロトタイプは、カスタムメイドのステンレス製Y型部品を使用しています。金型は、それぞれ、流入と4と3ミリメートルの2の流出チャネルを含みます。まず、クリーンな金型は、不飽和のラードで​​それらをスプレーし、それらを滅菌します。以下の手順で金型を準備します。

1. 35キロヘルツの周波数で超音波処理を使用して清浄なステンレス製の金型。超音波処理器で金型を置き、水と氷でそれらを沈めます。超音波処理器が動作している間、すべての回で冷たい金型を保管してください。 90分の2の期間のための超音波処理装置を実行します。
   1. 各期間の後、ステンレス鋼またはbをロックルアーでない材料がないことを確認するために針を使用RASSコネクタ。金型の両側の表面全体をきれいに石鹸と水を使用してください。チャンネル内の障害物がないことを確認します。
2. オートクレーブ袋に金型、ネジ、及びルアーロックコネクタを配置し、それをオートクレーブ。
3. 市販のラード（混合脂肪酸離型剤）と空気噴霧器半分に取り付けられるボトルを埋めます。正規のキャップボトルとキャップを交換してください。オートクレーブ袋に入れて、それをオートクレーブ。
   注：ラード反応が（BSAゴム）に後で注入される物質の放出を容易にするために使用されます。それは内部のシールを損傷することがautoclave-にスプレーボトルの蓋を置かないでください。
4. 45秒間または電子レンジでそのはっきりと液体になるまでラードをウォームアップ。ラードボトルに空気噴霧器の蓋をねじ込みます。スプレーで蓋を接続します。実験台の空気源に噴霧器を取り付けます。エアーバルブを開き、それは表面を濡らし始めるまで噴霧器のノズルを開きますペーパータオルの。
5. 表面が完全に覆われるまで金型表面に対して垂直ラードスプレー。各ピースを噴霧した後、ペトリ皿に置き、それを密封します。 2時間4℃で金型を置きます。
6. 30分間UV光に表面を露出させることにより、金型を殺菌するために進んでください。彼らは反応注入する準備が整うまで4℃でそれらをバックに置きます。

BSAゴムの4反応射出

注：すべての材料とソリューションは、次の手順で、BSAゴムの早期設定を防止するために使用する準備ができるまで冷たい維持されるべきです。

1. 以下の手順に従って、金型にBSAゴムを配信するためのディスペンサーを準備します。
   1. ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）フード中で30分間UV光にそれを暴露することによって：混合成分（1ディスペンサ2個のOリング、シリンジキャップ、ダブルシリンジ先端を混合し、4）の全てを滅菌します。
      注：PCRフードがトンために使用しました彼の手順では、固定剤を伴います。これらの化学物質は、細胞への暴露と毒性のリスクに起因する細胞/組織培養フード内で使用することができません。 UV光を含む任意の他のフードが適切であろう。
   2. ソリューションホルダーの先端キャップを置きます。
   3. BSAの1の比率：4：4で混合し、注入を実行グルタルアルデヒドを。ソリューションの最高額をお届けしますダブルシリンジ室に30％のBSAを追加します（これは、埋めるために約4ミリリットルがかかります）。あふれと隣接する室内の汚染を防止するためにOリングを配置するために十分なスペースを残していることを確認してください。
   4. （それは埋めるために、約1ミリリットルがかかります）、他のチャンバーに3％グルタルアルデヒド溶液を追加します。あふれと隣接する室内の汚染を防止するためにOリングを配置するために十分なスペースを残していることを確認してください。
   5. ディスペンサーの二重注射器を置きます。シリンジキャップが上になるように垂直にアセンブリを傾けます。ミキシングチップとキャップを交換してください。
   6. 皮下2つのステンレス鋼の鋳型片をREW。
   7. オートクレーブバッグの内側にアセンブリを配置します。
   8. ディスペンサーに空気を除去するには、直立位置に保持し、すぐにハン​​ドルをグルタルアルデヒドと混合BSAの少量を解放するために1時間を絞ります。その後すぐに、シリンジ先端にステンレス製Y型のルアーロックコネクタを取り付けます。
   9. 左側、右側にBSA-グルタルアルデヒド混合ディスペンサー付きステンレス製のY型を保持します。代替内部の空隙が溶液で満たされていることを確認するオートクレーブバッグの側面に排気を押して、流出路の左右の排気のそれぞれをカバーしています。そして、水平方向に金型を配置して、再注入します。
   10. 25ミリメートルペトリ皿にディスペンサーと場所から金型を外します。
   11. ゴムの脱水を防ぐために、ペトリ皿の周りにパラフィルムを置きます。
   12. 4℃の冷蔵庫のO / Nで金型を置きます。

注：コラーゲンは、プロセス中にすべての回で氷上に維持されるべきです。

1. コラーゲン固形分の割合を使用して、コラーゲン濃度を変更します。
   1. 冷水で最初のコラーゲン濃度を調整することにより、1.75％のコラーゲンの10ミリリットルを加えます。
   2. 較正されたpHメーターを使用して、12 N塩酸を用いてpHを3に調整します。コラーゲンチューブの側面に酸を追加するに直接塩酸を追加しないでください。酸を添加した後、コラーゲンの中に酸を押し、すぐに混合物を攪拌するへらを使用しています。
   3. 別個のコニカルチューブ中のコラーゲンを4g秤量します。
   4. 4℃、20〜30分間、9343×gで空気を除去するためにコラーゲンを遠心します。
   5. UVを30分間、細胞培養フードを滅菌し、4ミリリットルのコラーゲンへのラミニンの14μlを添加します。これは、10μgの/μlの最終ラミニン濃度になります。注：ラミニンがsを提供tructural完全性、密着性、および様々な細胞応答を促進します。
   6. 滅菌前のためのフードを使用してPCR UVは20〜30分間点灯し電源を入れます。
   7. 2時間エタノール中で、20ミリリットル注射器に取り付けられるように、ルアーロックキャップを置きます。そして、それは乾燥し、UV光の中でそれを配置することができます。
   8. ガンマは1200 cGyでに到達するために8.6分間コラーゲンを照射します。
      注：時間はセシウム源の減衰に依存します。同じ投与量に達するまでの時間を調整します。

BSAゴムにコラーゲンを6.Casting

1. 1：1の比率（コラーゲン：HEPES：MEM）コラーゲンを重合するために、8を使用します。以下の手順は（ステップ5.1.8から）酸性化し、コラーゲンの最初の4グラムに基づいています。
   1. 水中の0.2 N HEPES溶液を作製し、1-5 M水酸化ナトリウム（NaOH）溶液の少量（1-5μl）を添加することによりpHを9に調整します。較正されたpHメーターを使用して、各添加後の溶液のpHを監視します。 4°CまたはKEで保存氷上のEP。
   2. フードを滅菌するために20〜30分間組織培養フードのUV光をオンにします。
   3. オートクレーブ鉗子、へら、と滅菌用メス。
   4. 組織培養フードを使用して、0.2 N HEPES（pH値9）とミリリットル10倍MEMの1.5の1.5ミリリットルを混ぜます。使用前に氷の上にそれを維持し、5秒のためにそれをボルテックスすることを確認します。 4℃で保存したり、氷上に保ちます。
   5. PCRフードを滅菌するために、30分間、UV光をオンにします。
   6. 10分間-20℃で12ウェルプレートと20ミリリットル注射器を置き、または準備ができるまで継続します。注：使用する準備ができるまで冷たいすべての材料を保管してください。温度の上昇は、早期コラーゲン原線維形成を誘導します。
   7. 70％エタノールでフードにされ、殺菌のためにそれらを乾燥させしようとしている全てのチューブおよびウェルプレートをスプレーします。後で使用するために冷却するために氷上で20ミリリットル注射器を置きます。
   8. PCRフード内で、BSAゴムを解放するためにステンレス鋼の金型を開いて、メスを用いて、BSA Rの排気チャネルを切断ubber金型。
   9. PCRフードの下で、（それは十分に混合し、固形の付着物がないことを、HEPES-MEM液を抽出する前に、そのことを確認してください）​​滅菌コラーゲンチューブを開き、HEPES-MEM溶液1mlを追加します。
   10. 無菌のスパチュラを用いて、徹底的にコラーゲンおよび緩衝溶液を混合。
   11. 閉じると渦、それはすぐに十分に混合されたヒドロゲルを確保します。
   12. 冷たい20ミリリットル注射器に移します。
   13. 片手で、井戸の内部のBSAゴムを保持し、他を使用して、ウェルの底部にコラーゲンヒドロゲル溶液の半分を分注します。
   14. 滅菌ピンセットを用いて、ゴムの流入と流出端部がウェルの側面に触れていることを確認してください。
   15. 完全に覆われるまで、ゴムの上にコラーゲン溶液を注ぎます。
   16. BSAゴムはコラーゲンの中に中断されていること、特にゴムの端の近くに気泡が、存在しないことを確認してください。
   17. カバーを置き、周りにパラフィルムを包みます井戸の周囲。
   18. 37℃で1時間培養器に入れてください。上のPCR UV光を保管してください。
2. コラーゲンの重合後、UVは、以下の手順を介してヒドロゲルを架橋します。
   注：コラーゲンの架橋は、エネルギー量を制御することができる紫外線架橋装置を用いて行われます。
   1. UVクロスリンカーをオンにして、63万μJ/ ^cm 2の空室を照射するエネルギー設定を使用します。
   2. インキュベーターからゲルを削除します。
   3. エタノールで手をスプレーし、そして、チャンバ内に、可能な限り迅速にふたを取り外します。
   4. チャンバーを閉じ、UVは、エネルギー設定を選択し、63万μJ/ ^cm 2で照射することによりヒドロゲルを架橋します。
   5. 架橋サイクル後、PCRフードにUV光をオフにします
   6. エタノールで手をスプレーし、す​​ぐにウェルプレートに裏蓋を配置し、チャンバーを開きます。ウェルプレートを移動PCRフードへ。
   7. 無菌のスパチュラを用いて、優しく井戸からゲルを緩め、取り外します。ハイドロゲルの底部を架橋するためにボンネットの下にゲルを反転します。繰り返しステップ6.2.3と6.2.4。

BSAゴムの7酵素消化

1. 中空コラーゲン足場を有するためには、ヒドロゲル中に埋め込まれた寸法に影響を与えない方法で、BSAラバーを削除します。手順を以下に説明します。
   1. 組織培養フードを滅菌するために20〜30分間、UV光をオンにします。
   2. 0.25％トリプシン溶液のpHは7.8にします。例えば、水の15ミリリットルのために、50ミリリットルコニカルチューブにトリプシンの0.0376グラムを追加します。 1MのNaClの少量（2-5μl）を加えることによって、pHを7.8に調整します。 20ミリリットル注射器内の溶液を配置し、0.20μmのシリンジフィルターでキャップ。フィルターを通して液体を排出し、新しいチューブ内の無菌溶液を収集するためにプランジャーを押してください。
   3. 水浴をオンにして、30に温度を設定°C。
   4. 30分後、UV光をオフにします。フードに使用される全てのチューブおよび材料にエタノールをスプレーします。
   5. 個別のコニカルチューブ内のフードと場所の下にコラーゲンハイドロゲルを転送します。
   6. 各チューブに7.8のpHを有する0.25％トリプシン溶液（ゲルをカバーするのに十分なだけ）の周りに3〜5ミリリットルを追加します。
   7. パラフィルムと約1分間軽くボルテックスでチューブを密封します。
   8. 15-24時間、30℃の水浴に入れ。 BSAゴムは消化又はヒドロゲルから除去されるまで水浴中ながら、軽く頻繁にゲルをボルテックス。
      注：BSAゴムが除去されたかどうかを決定するために、いずれかのゴムをトリプシン溶液中に浮遊しているか、壊れた部分があります。ヒドロゲル内には視覚的な暗い部分があってはなりません。
2. 以下に説明するように、すべてのBSAゴムおよびトリプシンは、ヒドロゲルから削除されたことを確実にするために、それをすすぎます。
   1. PCRホーオンにします20〜30分間のD UV光。
   2. Mosconas溶液を調製します。塩化カリウム（KClを、28.6ミリモル）、（のNaHCO _3、11.9ミリモル）、グルコース（9.4ミリモル）及び（のNaH ₂ PO _4、0.08 mM）を水に結合します。 1 M NaOHまたは12 M HCl溶液でpHを7.4に調整します。 20ミリリットル注射器内の溶液を配置し、解決策を滅菌するために0.20ミクロンのシリンジフィルターを使用します。
   3. ボンネット上に置くする以前に、エタノールですべてをスプレーし、エタノールを乾燥させます。
   4. チューブを開き、新しい50mlコニカルチューブに無菌Mosconas溶液を5〜10mlのを転送します。
   5. 酵素液が含まれているコニカルチューブにコラーゲンハイドロゲルを転送します。ヒドロゲルは完全に溶液で覆われていることを確認してください。 4℃で30分間冷蔵庫でシェーカーにチューブを残します。
   6. Mosconas液二回繰り返しステップ7.2.5を吸引。
   7. 4℃で保存。

結果

結果は、このbiofabrication技術は、インビボで組織に見られる空間的配置を模倣することができる三次元足場を生成するのに効率的であることを示しています。建築の特徴は、組織の in vivoでの細胞の相互作用と機能性において重要な役割を果たしている組織工学アプリケーションのための重要なパラメータです。

BSAゴムの一貫性と混合性が均一であり、その意図された形状を維持することが可能であるBSAゴムの製造において重要なパラメータでした。タンパク質の溶解性は、タンパク質 - タンパク質相互作用、および全体的なタンパク質の挙動の変化を誘導する溶媒との相互作用などの分子間作用によって決定されます。 BSA溶液の導電率は、溶液の塩濃度の指標である、測定された。 表1はcombinatiBSAのアドオンは、溶剤、及びグルタルアルデヒドは、試験しました。予想されるように、最も高い導電性を有し...

ディスカッション

Biofabricationは、生物学と工学の原則は、天然組織を模倣する複雑な材料を生成するためにマージする高度に学際的分野です。これを達成するために、in vivoでの組織から収集した情報を使用して、 インビトロ足場に翻訳技術を開発する必要があります。この方法では、プラットフォームは、密接にin vivoでの組織の、建築の機能的、および機械的特性に似ていることを操作することができます。最適な足場材料は、生体適合性であるような特定の特性を有する目的の組織の機械的特性を模倣する、制御された分解が可能な細胞の生存を支持することができ、そして組織リモデリング^{2,3を可能にする}ことが可能であるべきです。

製造技術の多くは、実行可能な、三次元構造を生成するために開発されてきました。これらの技術は、2つの主要なカテゴリに分類されます。従来のANをdが進みました。従来技術では、多孔質構造を作るために合成及び天然の伝統的な材料の使用を含みます。いくつかの例は、凍結乾燥、溶媒キャストされ、成形溶融します。これらの技術の欠点...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
子牛皮から抽出	I
ヒドロクロル酸(HCl)	Sigma-Aldrich	7647-01-0
リン酸緩衝液(PBS錠)	MP Biomedical	U5378	100 mlあたり1錠で、
ウシ血清(BSA)から1x PBSアルブミウムを作る	Sigma-Aldrich	A9647
グルタルアルデヒド	Sigma-Aldrich	G5882	Toxic
Lard	Fields	3090
ステンレス鋼金型			Microlution Machine
エア ブラシ キット	セントラル ニューマチ	47791
ダブル シリンジ用ミキシング チップ	Medmix	ML2.5-16-LLM	ミキサー、DN2,5X16、4:1 ブラウン、メッド
ダブル シリンジ用小型 O リング	Medmix	PPB-X05-04-02SM	ピストンB、5 ml、4:1、PEナチュラル
ダブルシリンジキャップ	Medmix	VLX002-SM	キャップ、4:1/10:1、PE ブラウン、
ダブル シリンジ用 med ビッグ O リング	Medmix	PPA-X05-04-02SM	ピストン A、5 ml、4:1
ダブル シリンジ	Medmix	SDL X05-04-50M	ダブル シリンジ、5 ml、4:1
ダブル シリンジ ディスペンサー	Medmix	DL05-0400M	ディスペンサー、5 ml、4:1、med、プレーン
ラミニム			3.6 mg/ml - 抽出された USC ラボ
20 ml シリンジ ルアー ロック チップ	BD	302830
ルアー ロック キャップ	フィッシャー	JGTCBLLX
HEPES	シグマ -アルドリッチ	H4034
Gibco 最小必須メディア 10x (MEM)	Life Technologies	1143-030
Trypsin Life	Technologies	27250-018
UV 架橋剤	Spectroline UV	XLE1000
Sodium Cloride (NaCl)	Fisher	S271-10	モスコナス
塩化カリウム(KCl)	シグマ -Aldrich	P5405-250	モスコナス
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)	Fisher	BP328-500	モスコナス
グルコース	シグマ -Aldrich	G-8270	調製するモスコナ
リン酸ナトリウム didasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S-7907	Mosconas 滅菌フィルターを調製するには
	Corning	431224