スキンマイクログラフト世代の新しい脱凝集法後の組織性状

近年では、いくつかの新しい方法は、急性および慢性の皮膚病変のための一段階の治療を提供するために、手術中に自家細胞懸濁液を得るために、バイオテクノロジーの分野で開発されてきました。また、外傷、糖尿病、感染症、および他の原因から生じる急性が、主に慢性創傷の管理は、依然として厳しいです。慢性創傷は、世界中の医療システム¹に莫大な財政負担を引き起こし、深刻な世界的な健康問題となっていることを証拠があります。

皮膚病変の治療の成功率を高めるために、（セルラ強化を含む）広範囲操作の有無および無菌状態の維持は、直ちにの損傷領域に塗布することができる細胞懸濁液を作成するために、不可欠です患者は、それによって、このようなセルファクトリーとしてクリーンルームでの長い処理を回避することができます。セント小さ ​​な皮膚生検、粉砕、遠心分離および他の分離法（ 例えば、酵素的または機械的な）からarting、しばしば増殖培地で培養することができる細胞懸濁液を得るために使用されます。これらの方法の全ては、一般に、細胞構造を強調し、細胞生存率の低下につながる、実行に長い時間を必要とします。別の重要な態様は、損傷領域を修復するために、例えば、臨床医によって使用される準備ができた自己細胞懸濁液を得ることです。さらに、十分に自家組織移植片は、最終的に誘導および伝導^2、3の原則によって、受信者サイトで生き残るために転送手順を生き残ることが確立されています。理想的な移植片組織は、容易に入手でき、低抗原性およびドナー部位の罹患率^4を持つ必要があり^ます 。

これらの証拠に基づき、本研究の最初の目的は、適した自家バイオ複合体を作成することでした組織修復における臨床応用。この目的のために、我々はこのプロトコルによって脱凝集された皮膚組織から始まる自家マイクログラフトを得るための新しい方法を説明します。ケースの提示はまた、本明細書中にコラーゲンスポンジと組み合わせて、このプロトコルによって得られた自己ミクロ移植の臨床応用として記載されています。このアプローチは、既にヒト組織⁵の機械的分解に効率的であることが報告されていて、それが移植片および皮膚組織^6,7の再生のためだけでなく、口腔顎顔面外科手術^8-10における結合組織の再生治療のために臨床的に使用されています。

また、本研究の第二の目的は、このプロトコルによるそれらの分解後の皮膚組織の生物学的特徴づけました。この目的のために、皮膚組織の異なる相同サンプルは、異なる多臓器の胴体領域に由来しますおよび/またはマルチ組織のドナーは、エミリア・ロマーニャ地方スキンバンクでの移植のための組織（CNT 2013）を収穫、加工に関する国家規則に従い、配布処理しました。

症例提示：

車の事故に起因する複雑な外傷を示す35歳の女性患者は、アンコーナ病院の集中治療室に入院しました。患者は、オープン傷や外部固定で安定化化合物の破壊に起因する脚に感染を示しました。二つのラジカルデブ​​リドマンを行い、傷が負圧治療（VAC療法）の後にクリーンになったと骨膜が健康に見えたとき、我々は回復から2ヶ月後のプロトコルを適用しました。このシステムで分解した後、得られた微小移植片は、その後、病変の修復に対するそれらの効果を調べるために移植されたコラーゲンスポンジを用いてバイオ複合体を作成するために使用されました。

倫理文：プロトコルの臨床応用は、患者の皮膚自家組織の使用を必要とするため、in vitroでの特性評価が収穫に関する国家規則のガイドライン以下のエミリア・ロマーニャ地方のスキン銀行での相同皮膚組織に臨床使用の前に行われた、処理および移植のための組織（2013 CNT）を配布します。

臨床応用のための1.バイオコンプレックスビル

注：このプロトコルは、臨床的にRigeneracons（組織破砕）とRigeneraマシン（組織破砕システム）（ 図1A）の使用に基づいています。組織破砕は、約50ミクロンのカットオフと六角形のブレードおよびフィルタリング細胞と細胞外マトリックスの成分により提供されるグリッドを使用して、組織の小片を破壊することができるヒト組織の生物医学的攪乱物質です。

1. 双を通して患者のskinsamplesを収集opsyパンチ（ 図1B）とは、自己ミクロ移植片^6,7,9を取得する毎に生理食塩液1mlを添加脱凝集（またはステップ2.1参照します）。
2. 臨床応用に使用する（ 図1C）toformバイオ複合コラーゲンスポンジにマイクログラフトの1ミリリットルを置きます。
3. 培養物を5％CO ₂の加湿雰囲気中、37℃で10％ウシ胎児血清を補充したDMEM培地6mlの存在下でのコラーゲンスポンジの微小移植片のさらに1 mlです。
4. 3日間の培養に続いて、室温で10分間、0.3％パラホルムアルデヒドでバイオ複合体を固定してください。サンプルの上に直接、特定のディスペンサーとパラフィンを注ぎます。厚さ5μmのミクロトームでスライスを取得し、スライドガラスに直接置きます。
5. 20ミリリットルキシレン（市販 - - o-キシレン（65％）、p-キシレン（20％）、20％ - m-キシレン（40のミックス15を含む、組織学的分析のためにガラスに5ミクロンのパラフィン切片を浸し）とETH3分間、 - （20％6）、トルエン、トリメチルベンゼン、フェノール、チオフェン、ピリジンおよび硫化水素の痕跡）イルベンゼン。
6. 脱パラフィンし、次いで脱イオン水（1時間、1時間80％エタノール、70％エタノールで1時間のために1時間100％エタノール、95％エタノール）のエタノール減少等級内のスライス（100％〜70％）を浸しそして、セクションを再水和。
7. 1のための1グラム/ L Ematoxylinの2ミリリットル - - 1でセクションを染色し、2分間、続いて任意のEmatoxylin黒字を除去するために水で洗い流してください。
8. エタノール70％と混合し、水で希釈した濃度の1％エオシンYアルコール溶液で5分間 - 4のためのセクションを染色します。
9. 各スライドセクションのエオシンYの2ミリリットル、ランニング水道水で洗い流し - 1を使用してください。
10. エタノールの増加グレードのセクションを浸し（ステップ1.6を参照）、最終的には、1時間のためにキシレン中で経過した後、ベースの取り付けとカバーガラスmediumand 100X倍率（ 図1D）の光顕微鏡下で観察します。
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2.コレクション、脱凝集および組織のインビトロ分析

1. デルマトームを使用すると、それぞれ0.6ミリメートル、1ミリメートルまたは4つの異なる多臓器および/またはマルチのトランクエリアから厚さ2mmの独立した皮膚組織、乳頭デepidermized真皮（デッド）または真皮網状層（真皮）を取ります収穫、加工、移植のための組織を配布に関する国家規則（CNT 2013）は、次の40〜55歳の範囲内組織ドナー、。
   1. ゆっくり5分間オービタルシェーカー上皿にそれらを入れて、0.9％NaCl溶液中のすべてのサンプルをすすいでください。
   2. 5 mmの生検パンチを使用して、皮膚組織から直径が均一であるサンプルを作成し、デッドと真皮と分解する前に、すべての組織標本の重量を量ります。
   3. 分解のために食塩溶液1.5mlを添加すること、組織破砕で、それぞれ8個3つまたは​​4つの均一な皮膚組織サンプル、デッドまたは真皮挿入。
   4. 別の実行すべての組織サンプルの分解の時間は、 表1に示します。
   5. 対照として、無傷の組織サンプル由来のパンチ生検の特派員番号を使用してください。
   6. 機械的解離後、マイクログラフトを含む生理食塩水を吸引し、12ウェルプレートの1ウェルに個別に各サンプルを配置します。無傷の制御パンチ生検のために同じプロトコルを実行します。
   7. 各試料に、10％ウシ胎児血清（FBS）および抗生物質を補充したRPMI 1640培地を1mlを加えます。
   8. すぐに細胞生存率を評価します。各ウェルにMTTの0.5 mg / mlで（3- [含む培地を1mlを加える（皮膚組織、それぞれデッドまたは真皮8、3つまたは​​4つの均一なサンプルの同時分解によって得られる）、マイクログラフトを含みます4,5-ジメチルチアゾール-2-イル] -2,5-ジフェニルブロマイド）溶液および5％CO ₂ /空気の雰囲気中で37℃で3時間インキュベートします。無傷の制御のために同じプロトコルを実行します生検パンチ。
   9. インキュベーション後、全ての培地を含有するMTTを除去し、10分間、各試料1mLのジメチルスルホキシド（DMSO）に加えます。
   10. キュベット中の各試料とDMSOを転送し、分光光度計を用いて570nmでの光学密度（OD）で読み取りました。 570 nmの吸光度の比と分解する前に使用した組織のグラム重量（グラム）として細胞生存率を計算します。無傷の制御パンチ生検のために同じプロトコルを実行します。
2. 機械的解離後、皮膚組織、単一ドナーのデッドと真皮サンプル由来のマイクログラフトを含む生理食塩水を吸引します。
   1. 12ウェルプレートの1ウェルに、またはそれぞれの細胞生存率試験および形態素解析のための培養フラスコ内で個別に各サンプルを置きます。
   2. 5％CO ₂ / Alの雰囲気中、37℃で、10％FBSおよび抗生物質を補充したRPMI 1640培地1mlの（12ウェルプレート）または5ミリリットル（培養フラスコ）を添加培養マイクログラフト24時間または7日間R。
   3. （リピートが2.1.8-2.1.10ステップ）、24時間または7日後に細胞生存率を評価します。
   4. フラスコ中での培養の24時間と7日後に光学顕微鏡で細胞懸濁液の存在を評価する形態素解析を実行します。
   5. FACS分析⁶によるCD146、CD34およびCD45抗原を含む間葉系および造血細胞マーカーに陽性のために真皮のサンプルを分析します。
   6. 層流フードシード下で完全に脱凝集しない各組織試料の対応する小断片（皮膚組織、それぞれデッドまたは真皮8、3つまたは​​4つの均一なサンプルの同時分解によって得られた）各マイクログラフト（>大きさ50ミクロン脱凝集処理後の）5％ヒツジ血液培養液100μLを含むコロンビア寒天プレート上。
   7. 無菌^11を評価するために、三日間37℃でプレートをインキュベートし、コロンビア寒天プレート上の微生物学的分析を行います。

この予備的研究では、最初の目的は、使用する準備ができてバイオ複合体を生成するために、コラーゲンのような生物学的支持体と結合したヒト自家マイクロ移植片の能力を調査することでした。これらのバイオ複合体は、患者に移植しました。 自動車事故（ 図2A）によって引き起こされる足の病変と30日（ 図2B）後の組織修復に関連した完全な再上皮で観察されました。また、臨床フォローアップを5ヶ月（ 図2C）の後、損傷領域の良好な質感及び柔軟性を示した。臨床応用に並行して、 インビトロ研究はまた、皮膚組織のような異なる皮膚組織の細胞生存率を評価しました、このシステムによる分解前後のデッドと真皮。具体的には、アカウントに組織の各タイプ、8のしきい値の異なる厚さを取って、皮膚組織、デッドと真皮のための単一工程で処理することができる4および3生検は、それぞれ、設立されました。 表1に示されるように生検の確立数が良好な細胞生存率を維持するために、分解の最適条件を同定するために、それらの生物学的特性に応じて4つの異なる時間に脱凝集しました。

組織処理自体は、必然的に無傷の組織と比較して細胞生存率の障害を誘発したが、このシステムを用いて行った機械的解離は、皮膚、デッドと真皮の全てのサンプルで30％の細胞生存率の平均値を維持するように思われます 22 OD /グラムから7 OD / grのFOに、（脱凝集後グラム/ 92 OD /無傷の皮膚組織に対するグラムと29 ODの平均無傷組織（ 図3B）に関して、異なる時間（ 図3A）で評価R無傷の分解に、最終的に脱凝集に関して無傷の真皮）のための2.7 OD /グラムに16 OD /グラムからに関してDED。 したがって、これらの予備的結果は、このシステムは、即時解離後の細胞生存率のかなりのレベルを維持することが可能であることを示します。細胞生存率に対する分解の効果は、24時間又は7日間培養した組織サンプルで調べた変数の結果が観察されました。具体的には、皮膚組織試料における細胞生存率の実質的な変化は、開始時間（T 0）（ 図4A）と比較して均質化し、培養の時点で独立して観察されませんでした。一方、時間（T 0）を開始すると比較して、培養24時間後デッドサンプルの減少生存率が観察されたが、驚くべきことに、細胞生存率は、7日間の培養（ 図4B）の後に復元されました。同様の結果はまた、真皮（ 図4Cのサンプルについて観察されました）。各試料を重複し、 表2に報告された値で評価しました。

これらの結果に基づいて、我々は、細胞生存率に加えて、 表3に報告されているように皮膚組織の三タイプの細胞生存率を維持するために、分解の適切な時間を識別し、培養された細胞懸濁液の形態学的局面は、単一細胞を同定、評価しました。組織解離か ​​ら24時間後、皮膚組織およびデッド/真皮サンプルの両方における繊維の7日後に存在しながら、残基は（ 図5 AB）が観察されました。また、フローサイトメトリー解析により、細胞の特徴付けは、その均質化した後に、真皮のサンプルで行った：内皮細胞および間葉系幹細胞を含むいくつかの細胞タイプで構成細胞の異種プールを同定した（ 図6）。さらに、細菌の増殖の欠如は、Iを同定しました。 nはすべて分解されたサンプルはopportunely実験手順（ 図7）の無菌性を証明する、寒天皿上に播種しました。

図1.バイオ複合ビル組織 組織かく乱と続いて脱凝集。バイオ複合体は、コラーゲンスポンジにマイクロ移植片を組み合わせ得られたた患者の病変エリアからダーマの小片の撹乱システム（A）とコレクション損傷修復（C）のために使用する人間のパッチの準備ができて取得する。（D）ヘマ ​​トキシリン＆エオシン（H＆E）染色の代表的なバイオ複雑なDMEM培地で3日間培養し、顕微鏡検査することが観察の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。

図3. C エル生存率はすぐに無傷の皮膚組織（B）。皮膚に対する皮膚組織（A）の三種類の異なる時間に脱凝集した後 、4人の異なるドナー由来デッドと真皮組織は、組織disruでばらばらにされました本文中の適切なセクションに示すようptors。細胞生存率は、各組織サンプルについて二重に行ったMTT試験によって評価しました。グラフは、各サンプルの重複で行う四つの異なる実験の代表です。結果は、光学濃度（OD）と組織のグラム（GR）との間の比として表されます。標準偏差は、組織の光学密度（OD）とグラム（GR）との比に計算した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

24時間、7日間の時間（T 0）を起動すると、サブカルチャー後の 図 皮膚組織（A）の脱凝集サンプルの 4 C エル生存率レベル、デッド（B）と真皮（C）。組織は組織でホモジナイズしました。インディカとして攪乱本文中の適切なセクションでテ。細分化サンプルは、24時間、続いて培養し、7日後に分解し、5％CO 2 /空気の雰囲気中で37℃で10％ウシ胎児血清および抗生物質を補充したRPMI 1640培地中で維持しました。前述のように細胞生存率をMTTによって評価しました。グラフは、単一のドナーに由来する皮膚組織、デッドと真皮の各試料について二重に行った実験の代表です。結果は、組織の光学密度（OD）とグラム（GR）との間の比として表されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

脱凝集した皮膚組織の 図5. 形態素解析（A）およびデッド/真皮（B）24時間後とカルトの7日間 URE。形態素解析は、皮膚組織およびデッド/真皮組織上のRPMI培地の存在下での培養の24時間と7日後に光学顕微鏡を用いて行った。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

フローサイトメトリー分析によって、図6の細胞の特徴付け。機械的解離後、真皮によって得られたマイクロ移植片は培養中に入れ、7日後には、CD146、CD34およびCD45抗原を含む間葉系および造血細胞マーカーに陽性、について分析した。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。

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脱凝集した皮膚組織、デッドと真皮サンプルの 図7. 微生物学的分析。脱凝集した組織サンプルの小断片は、層流フード下で5％ヒツジ血液（ビオメリュー社）を添加コロンビア寒天上に播種し、3日間37℃でインキュベートしました微生物学的分析を実行し、手順の無菌性を評価する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

皮膚の脱凝集のために使用される4つの異なる時間の表1略図は、デッドと皮膚の真皮。八、4と3のパンチ生検は、デッドと真皮は、それぞれ、それらの生物学的特性に応じて、4異なる時間にばらばらにされました。

一つの生物学的複製のためのOD /グラムで表された値の表2の範囲。皮膚組織、デッドと時間を開始すると表示された時間に機械的に解離した後に評価真皮からの細胞生存率の値。結果は、一つの実験二重に行い、組織の光学密度（OD）及びグラム（GR）との間の比として表さの代表です。

Differeで良好な細胞生存率を維持するための脱凝集のベストタイムの表3略図NT組織試料皮膚、デッド真皮組織サンプルは、それぞれ、脱凝集の5,1及び2分後に最適な細胞生存率を示します。

著者アントニオ・グラツィアーノは、生成しRigeneraシステムを販売している人間の脳波SRLの科学ディレクターです。著者レティツィアTrovatoは、人間の脳波SRLの科学部門の協力者であります