スキンマイクログラフト世代の新しい脱凝集法後の組織性状

Summary

プロトコルは、ヒト組織を脱凝集し、コラーゲンスポンジと合わせ、自家マイクログラフトを作成するには、皮膚病変の治療に使用する準備ができて、人間の生体複合体を生じさせる新しい方法を説明します。さらに、このシステムは、機械的解離後の異なる時点で、マイクロ移植片の細胞生存率を維持します。

Abstract

いくつかの新しい方法は、急性および慢性の皮膚病変のための1つのステップの処理を提供するために、手術中に自己の細胞懸濁液を得るために、バイオテクノロジーの分野で開発されてきました。また、外傷、糖尿病、感染症や他の原因から生じる慢性だけでなく、急性創傷の管理は、依然として厳しいです。本研究では、単一の患者とその臨床応用の皮膚組織から自家マイクロ移植片を作成するための新しい方法を説明します。また、皮膚、脱epidermized真皮（デッド）および多臓器及び/又は多組織ドナーの真皮に由来する皮膚組織のインビトロでの生物学的特性評価も実施しました。全ての組織は、私たちは実行可能なマイクログラフトを得ることができるように、この新しいプロトコルによって解離させました。特に、我々は、この革新的なプロトコルは、自己ミクロ移植片および皮膚病変に適用する準備ができたコラーゲンスポンジで構成バイオ複合体を作成することができることを報告しました。 clini足の病変に対する自家バイオ複合体のcalの適用はまた、両方の再epitalizationプロセスの改善と病変の柔らかさを示し、報告されました。さらに、我々のインビトロモデルは、このシステムの機械的解離後の細胞生存率は、培養物の最大7日間の時間にわたって維持されることを示しました。我々はまた、解離から得られた細胞のプールが高い再生能のために、組織再生および修復のプロセスにおいて重要な役割を発揮する間葉系幹細胞を含むいくつかの細胞型で構成されていることを、フローサイトメトリー分析によって、観察しました。最後に、我々は寒天皿で培養したときに、この手順は、マイクロ移植片の無菌性を維持することをin vitroで実証されました。要約すると、我々は、臨床医は、実行可能な無菌かつ最も一般的な生物学的scaffoで単独または組み合わせて適用することができるマイクログラフトを使用する準備ができて1ステップで取得するために、この新しい回生アプローチが有望なツールとなり得ると結論しますLDS。

Introduction

近年では、いくつかの新しい方法は、急性および慢性の皮膚病変のための一段階の治療を提供するために、手術中に自家細胞懸濁液を得るために、バイオテクノロジーの分野で開発されてきました。また、外傷、糖尿病、感染症、および他の原因から生じる急性が、主に慢性創傷の管理は、依然として厳しいです。慢性創傷は、世界中の医療システム¹に莫大な財政負担を引き起こし、深刻な世界的な健康問題となっていることを証拠があります。

皮膚病変の治療の成功率を高めるために、（セルラ強化を含む）広範囲操作の有無および無菌状態の維持は、直ちにの損傷領域に塗布することができる細胞懸濁液を作成するために、不可欠です患者は、それによって、このようなセルファクトリーとしてクリーンルームでの長い処理を回避することができます。セント小さ ​​な皮膚生検、粉砕、遠心分離および他の分離法（ 例えば、酵素的または機械的な）からarting、しばしば増殖培地で培養することができる細胞懸濁液を得るために使用されます。これらの方法の全ては、一般に、細胞構造を強調し、細胞生存率の低下につながる、実行に長い時間を必要とします。別の重要な態様は、損傷領域を修復するために、例えば、臨床医によって使用される準備ができた自己細胞懸濁液を得ることです。さらに、十分に自家組織移植片は、最終的に誘導および伝導^2、3の原則によって、受信者サイトで生き残るために転送手順を生き残ることが確立されています。理想的な移植片組織は、容易に入手でき、低抗原性およびドナー部位の罹患率^4を持つ必要があり^ます 。

これらの証拠に基づき、本研究の最初の目的は、適した自家バイオ複合体を作成することでした組織修復における臨床応用。この目的のために、我々はこのプロトコルによって脱凝集された皮膚組織から始まる自家マイクログラフトを得るための新しい方法を説明します。ケースの提示はまた、本明細書中にコラーゲンスポンジと組み合わせて、このプロトコルによって得られた自己ミクロ移植の臨床応用として記載されています。このアプローチは、既にヒト組織⁵の機械的分解に効率的であることが報告されていて、それが移植片および皮膚組織^6,7の再生のためだけでなく、口腔顎顔面外科手術^8-10における結合組織の再生治療のために臨床的に使用されています。

また、本研究の第二の目的は、このプロトコルによるそれらの分解後の皮膚組織の生物学的特徴づけました。この目的のために、皮膚組織の異なる相同サンプルは、異なる多臓器の胴体領域に由来しますおよび/またはマルチ組織のドナーは、エミリア・ロマーニャ地方スキンバンクでの移植のための組織（CNT 2013）を収穫、加工に関する国家規則に従い、配布処理しました。

症例提示：

車の事故に起因する複雑な外傷を示す35歳の女性患者は、アンコーナ病院の集中治療室に入院しました。患者は、オープン傷や外部固定で安定化化合物の破壊に起因する脚に感染を示しました。二つのラジカルデブ​​リドマンを行い、傷が負圧治療（VAC療法）の後にクリーンになったと骨膜が健康に見えたとき、我々は回復から2ヶ月後のプロトコルを適用しました。このシステムで分解した後、得られた微小移植片は、その後、病変の修復に対するそれらの効果を調べるために移植されたコラーゲンスポンジを用いてバイオ複合体を作成するために使用されました。

Protocol

倫理文：プロトコルの臨床応用は、患者の皮膚自家組織の使用を必要とするため、in vitroでの特性評価が収穫に関する国家規則のガイドライン以下のエミリア・ロマーニャ地方のスキン銀行での相同皮膚組織に臨床使用の前に行われた、処理および移植のための組織（2013 CNT）を配布します。

臨床応用のための1.バイオコンプレックスビル

注：このプロトコルは、臨床的にRigeneracons（組織破砕）とRigeneraマシン（組織破砕システム）（ 図1A）の使用に基づいています。組織破砕は、約50ミクロンのカットオフと六角形のブレードおよびフィルタリング細胞と細胞外マトリックスの成分により提供されるグリッドを使用して、組織の小片を破壊することができるヒト組織の生物医学的攪乱物質です。

1. 双を通して患者のskinsamplesを収集opsyパンチ（ 図1B）とは、自己ミクロ移植片^6,7,9を取得する毎に生理食塩液1mlを添加脱凝集（またはステップ2.1参照します）。
2. 臨床応用に使用する（ 図1C）toformバイオ複合コラーゲンスポンジにマイクログラフトの1ミリリットルを置きます。
3. 培養物を5％CO ₂の加湿雰囲気中、37℃で10％ウシ胎児血清を補充したDMEM培地6mlの存在下でのコラーゲンスポンジの微小移植片のさらに1 mlです。
4. 3日間の培養に続いて、室温で10分間、0.3％パラホルムアルデヒドでバイオ複合体を固定してください。サンプルの上に直接、特定のディスペンサーとパラフィンを注ぎます。厚さ5μmのミクロトームでスライスを取得し、スライドガラスに直接置きます。
5. 20ミリリットルキシレン（市販 - - o-キシレン（65％）、p-キシレン（20％）、20％ - m-キシレン（40のミックス15を含む、組織学的分析のためにガラスに5ミクロンのパラフィン切片を浸し）とETH3分間、 - （20％6）、トルエン、トリメチルベンゼン、フェノール、チオフェン、ピリジンおよび硫化水素の痕跡）イルベンゼン。
6. 脱パラフィンし、次いで脱イオン水（1時間、1時間80％エタノール、70％エタノールで1時間のために1時間100％エタノール、95％エタノール）のエタノール減少等級内のスライス（100％〜70％）を浸しそして、セクションを再水和。
7. 1のための1グラム/ L Ematoxylinの2ミリリットル - - 1でセクションを染色し、2分間、続いて任意のEmatoxylin黒字を除去するために水で洗い流してください。
8. エタノール70％と混合し、水で希釈した濃度の1％エオシンYアルコール溶液で5分間 - 4のためのセクションを染色します。
9. 各スライドセクションのエオシンYの2ミリリットル、ランニング水道水で洗い流し - 1を使用してください。
10. エタノールの増加グレードのセクションを浸し（ステップ1.6を参照）、最終的には、1時間のためにキシレン中で経過した後、ベースの取り付けとカバーガラスmediumand 100X倍率（ 図1D）の光顕微鏡下で観察します。

2.コレクション、脱凝集および組織のインビトロ分析

1. デルマトームを使用すると、それぞれ0.6ミリメートル、1ミリメートルまたは4つの異なる多臓器および/またはマルチのトランクエリアから厚さ2mmの独立した皮膚組織、乳頭デepidermized真皮（デッド）または真皮網状層（真皮）を取ります収穫、加工、移植のための組織を配布に関する国家規則（CNT 2013）は、次の40〜55歳の範囲内組織ドナー、。
   1. ゆっくり5分間オービタルシェーカー上皿にそれらを入れて、0.9％NaCl溶液中のすべてのサンプルをすすいでください。
   2. 5 mmの生検パンチを使用して、皮膚組織から直径が均一であるサンプルを作成し、デッドと真皮と分解する前に、すべての組織標本の重量を量ります。
   3. 分解のために食塩溶液1.5mlを添加すること、組織破砕で、それぞれ8個3つまたは​​4つの均一な皮膚組織サンプル、デッドまたは真皮挿入。
   4. 別の実行すべての組織サンプルの分解の時間は、 表1に示します。
   5. 対照として、無傷の組織サンプル由来のパンチ生検の特派員番号を使用してください。
   6. 機械的解離後、マイクログラフトを含む生理食塩水を吸引し、12ウェルプレートの1ウェルに個別に各サンプルを配置します。無傷の制御パンチ生検のために同じプロトコルを実行します。
   7. 各試料に、10％ウシ胎児血清（FBS）および抗生物質を補充したRPMI 1640培地を1mlを加えます。
   8. すぐに細胞生存率を評価します。各ウェルにMTTの0.5 mg / mlで（3- [含む培地を1mlを加える（皮膚組織、それぞれデッドまたは真皮8、3つまたは​​4つの均一なサンプルの同時分解によって得られる）、マイクログラフトを含みます4,5-ジメチルチアゾール-2-イル] -2,5-ジフェニルブロマイド）溶液および5％CO ₂ /空気の雰囲気中で37℃で3時間インキュベートします。無傷の制御のために同じプロトコルを実行します生検パンチ。
   9. インキュベーション後、全ての培地を含有するMTTを除去し、10分間、各試料1mLのジメチルスルホキシド（DMSO）に加えます。
   10. キュベット中の各試料とDMSOを転送し、分光光度計を用いて570nmでの光学密度（OD）で読み取りました。 570 nmの吸光度の比と分解する前に使用した組織のグラム重量（グラム）として細胞生存率を計算します。無傷の制御パンチ生検のために同じプロトコルを実行します。
2. 機械的解離後、皮膚組織、単一ドナーのデッドと真皮サンプル由来のマイクログラフトを含む生理食塩水を吸引します。
   1. 12ウェルプレートの1ウェルに、またはそれぞれの細胞生存率試験および形態素解析のための培養フラスコ内で個別に各サンプルを置きます。
   2. 5％CO ₂ / Alの雰囲気中、37℃で、10％FBSおよび抗生物質を補充したRPMI 1640培地1mlの（12ウェルプレート）または5ミリリットル（培養フラスコ）を添加培養マイクログラフト24時間または7日間R。
   3. （リピートが2.1.8-2.1.10ステップ）、24時間または7日後に細胞生存率を評価します。
   4. フラスコ中での培養の24時間と7日後に光学顕微鏡で細胞懸濁液の存在を評価する形態素解析を実行します。
   5. FACS分析⁶によるCD146、CD34およびCD45抗原を含む間葉系および造血細胞マーカーに陽性のために真皮のサンプルを分析します。
   6. 層流フードシード下で完全に脱凝集しない各組織試料の対応する小断片（皮膚組織、それぞれデッドまたは真皮8、3つまたは​​4つの均一なサンプルの同時分解によって得られた）各マイクログラフト（>大きさ50ミクロン脱凝集処理後の）5％ヒツジ血液培養液100μLを含むコロンビア寒天プレート上。
   7. 無菌^11を評価するために、三日間37℃でプレートをインキュベートし、コロンビア寒天プレート上の微生物学的分析を行います。

Results

この予備的研究では、最初の目的は、使用する準備ができてバイオ複合体を生成するために、コラーゲンのような生物学的支持体と結合したヒト自家マイクロ移植片の能力を調査することでした。これらのバイオ複合体は、患者に移植しました。 自動車事故（ 図2A）によって引き起こされる足の病変と30日（ 図2B）後の組織修復に関連した完全な再上皮で観察されました。また、臨床フォローアップを5ヶ月（ 図2C）の後、損傷領域の良好な質感及び柔軟性を示した。臨床応用に並行して、 インビトロ研究はまた、皮膚組織のような異なる皮膚組織の細胞生存率を評価しました、このシステムによる分解前後のデッドと真皮。具体的には、アカウントに組織の各タイプ、8のしきい値の異なる厚さを取って、皮膚組織、デッドと真皮のための単一工程で処理することができる4および3生検は、それぞれ、設立されました。 <...

Discussion

この予備的研究では、既に他の臨床用途において報告されているように、このプロトコルによって得られる微小移植片は微小移植片インプラント^9、10の有効性を最適化するために、コラーゲンスポンジと組み合わせることができることを示した。特に、この研究は、生体の能力を報告し-complexes、臨床応用から30日後の足病変の創傷治癒をアジュバント、微小移植片およびコラーゲンスポンジで構成される。さらに、in vitroでの結果はすぐに機械的解離後も24時間と7日間の培養後の両方でかなりの細胞生存率を維持し、三つの異なる皮膚組織を脱凝集するために、このプロトコルの有効性についての証拠を提供します。

均質化のこの種の後の細胞生存率の維持は、大規模な操作を避けて、1つのステップだけ無菌自家マイクロ移植片で得ることができます。この証拠は、一致していますin vitroでのこのプロトコルの有効性は骨膜、心臓の心房と眼球⁵の外側直筋の生検を含め、組織の他のタイプでも試験され...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rigenera マシン	ヒューマン ブレイン ウェーブ	79210R
リジェネラコンズ	ヒューマン ブレイン ウェーブ	79450S
MTT	ロシュ ダイアグノスティック GmbH	11465007001
RPMI ミディアム	PBI インターナショナル	733-2292
DMEM ミディアム	PBI インターナショナル	F 0415
抗生物質	バイオロジカルインダストリーズPBI	03-038-1
FACS分析用抗体	eBiosciences	コード12-1469 CD146-P; コード17-0349  CD34-APC用
コロンビア寒天	BioMerieux Company	43041
Condress®	アビオジェン・ファーマ		バイオコンプレックス用コラーゲンスポンジ
DMSO	Bioniche Pharma USA LLC、Lake Forest、IL
NaCl溶液	Fresenius Kabi、バートホンブルク、ドイツ
キシレン	カルロ・エルバ