炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

CD4 T細胞のエフェクター機能は、損傷の調査、感染の病巣の特定、または慢性感染や自己免疫による病理を引き起こすために、さまざまな末梢組織に迅速に侵入して横断する能力に大きく依存しています。 炎症部位^1-4へのホーミングと血管系から組織への血管外漏出^5-7のプロセスは十分に特徴付けられていますが、T細胞の間質運動性を駆動および調節する因子は未定義のままです。複雑な3D環境におけるT細胞の移動は、人工マトリックス^8-10またはマイクロ流体デバイス^11,12を用いてin vitroで研究されてきたが、これらはin vivoシステムの複雑で動的な環境を再現することができない。高解像度のマルチカラー生体内イメージングの出現により、免疫細胞の動的挙動をin situで研究することが可能になり、無傷の免疫応答をより深く理解できるようになりました。

10年以上前に、免疫学的な問題に取り組むために初めて多光子顕微鏡を利用したいくつかの影響力のある研究が発表されました。初期の研究では、外植リンパ器官内の免疫細胞の挙動に焦点を当てていました^13-16、その後すぐに麻酔をかけたマウスの露出したリンパ節を画像化する技術が続きました¹⁷。イメージングにより、T細胞¹⁸のリンパ節プライミングの段階、T細胞が二次リンパ器官¹⁹で移動するメカニズム、T細胞と他の免疫細胞^{との相互作用20,21}、およびリンパ節²²内の動的T細胞の位置に関する新しい基本的な観察が可能になりました。初期の多くの研究はリンパ節のダイナミクスに焦点を当てていましたが、それ以来、脳^23-25、肝臓²⁶、肺²⁷、皮膚^28-30など、多くの末梢組織の免疫応答を画像化するために生体内イメージングが利用されています。

マウスの耳の真皮は、耳の皮膚が薄く、髪の毛が比較的少ないこと、そして呼吸運動から分離することが容易であることから、イメージングに特に適しています³¹。実際、真耳は樹状細胞^32,33、T細胞^28,29,34,35、および好中球^36,37の間質性挙動を画像化するために使用されており、真皮の炎症を研究するための確立された部位である。非侵襲的処置は、皮膚の分割^38,39、脇腹^39,40、または背側皮膚皮弁窓^39,41 モデルなど、局所炎症性環境の変化を誘発する可能性のある皮膚の外科的製剤に取って代わることが増えています。転写されたin vitroプライミングされた抗原特異的CD4エフェクターT細胞の使用により、真皮炎症反応³⁰の状況で細胞の均質な集団の研究が可能になります。ここでは、炎症を起こしたマウスの耳の真皮間質にある抗原特異的エフェクターCD4 T細胞の可視化を可能にする非侵襲的イメージング手順と、静脈カテーテルを介してブロッキング抗体を導入することにより、これらの細胞をリアルタイムで操作する能力について説明します。このモデルは、真皮内のCD4 T細胞の動きを追跡し、この運動性を支配するメカニズムを照会するのに効果的であることを示します。

マウスを含むすべての手順は、ロチェスター大学の施設内動物管理使用委員会によって承認され、国立研究所によって投与動物福祉法と動物愛護実験動物の管理と使用に関する公衆衛生サービスポリシーに厳密に従って行きました健康、実験動物福祉のオフィスの。

エフェクターCD4 T細胞の調製

注：特に鶏卵卵白アルブミン（：ISQAVHAAHAEINEAGR pOVA）由来のペプチドを認識したBALB / c TCRトランスジェニックDO11.10マウス。その他のTCRトランスジェニックシステムが示されたpOVAの代わりに適切な同族ペプチドを使用して、置換することができます。

1. ナイーブCD4 T細胞を精製
   1. マウスは頸椎脱臼に続いて、1分間の運動や呼吸の兆候を示していないまで、2リットル/分のCO ₂にさらす、またはに従ってによって6-8週齢の雌DO11.10 BALB / cマウスを安楽死させます地元の施設内動物管理使用委員会のガイドライン。 70％エタノール溶液でマウスをスプレーし、腹部ダウン道の2/3にマウスの顎から皮膚内の約7センチの切開を行います。後足に向かって腹部の切開部の端2〜3センチの皮膚切開を行います。腹膜にカットしないように注意してください。
   2. 慎重に静かにピンセットで引っ張ることにより、腹膜から皮膚を分離します。鼠径リンパ節を本体と後肢の接合部付近の皮膚の上に配置されています。把握し、2％の新生仔ウシ血清（NCS）を補充したHBSS 8mlに鉗子と場所に引いて、取り外します。
   3. つかみ、ピンセットで軽く引いて、マウスからの腋窩及び上腕リンパ節を収穫。鼠径リンパ節にHBSS + 2％NCSに置きます。
   4. OTとのHBSS + 2％NCSで鉗子と場所でマウスの首に位置深いと浅頸部リンパ節を収穫彼女のリンパ節。
   5. 静かに腸にカットしないように注意しながら、腹膜にカット。鉗子で盲腸及び結腸をつかみ、ちょうどコロンに沿って配置されている腸間膜リンパ節を公開します。慎重にピンセットで腸間膜リンパ節を削除して、他のリンパ節に配置します。
   6. 鉗子で保持し、手術用ハサミで結合組織を切除する、腹腔内に脾臓を見つけて、慎重に取り外し。リンパ節と脾臓を置きます。
   7. 60×15ミリメートル培養皿に入れた金属ストレーナーに脾臓およびリンパ節を含むHBSS + 2％NCSを注ぐことによって、単一細胞懸濁液を準備します。静かにHBSS + 2％NCSに10ミリリットルのシリンジからプランジャーを有する金属ストレーナーを通して脾臓およびリンパ節をマッシュアップ。
   8. ピペットを使用して、清浄な50mLの遠心管に細胞懸濁液を移動させます。 、HBSS + 2％NCSの追加の10ミリリットルでのuを金属ストレーナーと培養皿をすすぎますピペットを歌い、そして細胞懸濁液と同じ50ミリリットルの遠心分離管にこのソリューションを配置します。
   9. 静かにピペッティングして10ミリリットルのHBSS + 2％NCS中で細胞を再懸濁をペレットに5分間600×gで細胞をスピン。特に断りのない限り、すべての遠心分離を5分間、600×gで行われるべきです。
   10. 1:10希釈のために、PBS中の0.1％トリパンブルーの90μlの10μlの細胞懸濁液を希釈します。血球計数器の縁に溝への溶液をピペッティングすることにより、血球計数器上にトリパンブルーで細胞を10μlを置きます。わずかに小さく表示され、赤血球、ラウンド、赤色のついた細胞と青死んだ/死細胞を無視して、血球計数器の中央グリッドの白血球をカウントします。希釈係数（10）によって、10 ⁴により計数した細胞の数を乗算し、細胞（10 ml）を体積50ml遠心チューブに回収した細胞の総数を決定します。
   11. CD4 T細胞を濃縮するために、遠心分離細胞ペレット、および約1 / mlの抗CD8（クローン3.155）を1μg/ mlの抗MHCクラスII（クローンM5 / 114）、および1μgのを含有する溶液中で2×10 ⁷細胞/ mlで細胞を再懸濁しますHBSS + 2％NCS中/ mlの抗CD24（クローンJ11d）抗体静かにピペッティングすることによって。
       注：このステップで使用される抗体は、ハイブリドーマ細胞系から社内で得られ、濃度が近似されます。補体溶解のための理想的なこれらの抗体の濃度及び量は、経験的に決定され、ラボの間で変化します。あるいは、いくつかの市販のキットは、ナイーブCD4 T細胞の精製のために利用可能であり、ここに示される補体溶解及びCD62L +の精製工程のために置換することができます。ナイーブCD4 T細胞を精製する他の方法を使用している場合、この手順は、ステップ1.2から継続することができます。
   12. 氷上で30分間インキュベートします。このインキュベーションの終了時に、急速に37℃の水（b）に置くことによってモルモット補体を解凍約2分間のATH。細胞懸濁液に直接補数をピペットで抗体溶液中の細胞ごとに1ミリリットルのための補体の100μLを加えます。 30分間37℃の水浴中で細胞をインキュベートします。
   13. 遠心管で20ミリリットルの合計体積に細胞をもたらすためにHBSS + 2％NCSを追加します。細胞下RT密度遠心分離培地8mlに層（密度1.086グラム/ミリリットル）。直ちに遠心ブレーキをオフにして室温で15分間1400×gで細胞を遠心します。
   14. 新しい50mlの遠心チューブに血清学的ピペットおよび転送細胞を用いて界面の細胞を収集します。 HBSS + 2％NCSや遠心分離で50mlに遠心分離管にボリュームをもたらすことで細胞を洗浄。
   15. 軽くピペッティングすることによって（PBS、2％NCSおよび2mM EDTAを補った）MACS緩衝液中で細胞を再懸濁し、ステップ1.1.10で、以前にカウントされます。
   16. ナイーブCD4 T細胞を濃縮するために、溶液中に2×10 ⁷細胞/ mlで細胞を再懸濁ステップ1.1.16でカウント数に基づいて、MACS緩衝液中2.5 / mlのビオチン結合抗CD62L抗体、の。氷上で30分間インキュベートします。
   17. 細胞を遠心分離した後、10ミリリットルのMACS緩衝液を加えることによって、細胞を洗浄。 MACS緩衝液で10 ⁷細胞/100μlので細胞を再懸濁し、細胞に直接1:10希釈でストレプトアビジン結合磁気分離ビーズを追加します。 20分間氷上でインキュベートします。
   18. ステップ1.1.17で、以前のように細胞を洗浄し、500μlの最小限の体積で、MACS緩衝液中で2×10 ⁸細胞/ mlで細胞を再懸濁。
   19. マグネットホルダの磁気分離カラムを置き、3ミリリットルのMACS緩衝液が流れるせることでカラムを洗浄。ピペットでカラムに細胞を適用します。
   20. カラム上にバッファ3ミリリットルのMACSをピペッティングし、MACSバッファーが流れる、と3回繰り返すようにすることによって磁気カラムに拘束されない細胞を除去するためにカラムを洗浄。フロースルー画分を捨てます。
   21. Remov電子磁気スタンドから列と新しい50ミリリットルの遠心分離管を渡って保持します。ピペットで5カラムにMACS緩衝液のミリリットルとカラム結合した細胞を解放し、そのフロースルーを収集するために、カラムに通してMACSバッファーをプッシュする列で囲まれたプランジャーを使用するには、濃縮されたナイーブCD4 T細胞が含まれています。
   22. 遠心分離を、10mlのRPMI中に細胞を再懸濁し、10％ウシ胎児血清（FCS）、100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および50μM2-メルカプトエタノール（RPMI-10）。ステップ1.1.10で、以前のように細胞を数えます。
   23. RPMI-10で6×10 ⁵ / mlにナイーブCD4 T細胞の最終濃度を調整します。
2. T細胞枯渇脾臓APCを浄化します
   1. ステップ1.1.1のように、6-8週齢の雌の野生型BALB / cマウスを安楽死させます。
   2. 70％エタノール溶液でマウススプレー、マウスのabdomeの左側に約3cmの切開を行うことによって、脾臓を露出させますn個。腹膜層を開いてカットし、静かにピンセットでそれを把握し、手術用ハサミで基礎となる接続組織から離れてそれを切断することにより、脾臓を除去します。
   3. HBSS + 2％NCSの8ミリリットルに脾臓を置きます。
   4. 、脾臓をすりつぶすことによって単一細胞懸濁液を準備し洗浄し、段階的に、以前のように、細胞をカウント1.1.7-1.1.10
   5. ペレットに5分間600×gで細胞を回転させることにより、T細胞を枯渇し、軽くピペッティングで約1 / mlの抗Thy1.2抗体（J1Jクローン）の溶液中に2×10 ⁷で細胞を再懸濁します。氷上で30分間細胞をインキュベートします。
      注：この抗体は、ハイブリドーマ細胞株から、社内で誘導したとconcentratonが近似されます。補体溶解のため、この抗体の理想の濃度及び量は、経験的に決定され、ラボの間で変化します。所望であれば、脾臓細胞からAPCを精製するための他の方法は、置換することができます。ナイーブT細胞およびAPCは、カルトに準備する必要がありますステップ1.3からURE。
   6. 、モルモット補体を追加インキュベートし、ステップ1.1.13-1.1.14で、以前のように密度遠心分離メディア勾配上の細胞を分離します。
   7. RPMI-10 10mlの中に細胞を再懸濁し、25 Gyの放射線に細胞を公開する時間の長さのガンマ照射に50mlの遠心チューブに細胞を配置することによってAPCを照射します。この時間の長さは、照射に基づいて変動するため、細胞が照射されるたびに計算する必要があります。
   8. ステップ1.1.10で、前述のように血球計数器で細胞をカウントし、RPMI-10中で2.4x10 ⁶細胞/ mlの最終濃度にAPC細胞を調整します。
3. 細胞を刺激し、5日間の培養中のTh1表現型へのCD4 T細胞に分化します。
   注：私たちはここにナイーブCD4 T細胞から生成されたTh1エフェクターを準備し、画像化するためのプロトコルを提示しているが、このプロトコルは異なる表現型にナイーブ細胞を区別するために調整することができ、またはトンOこのようなCD8 T細胞のような他の細胞型を、使用しています。プライミングおよび分化のための条件は、経験的に決定されなければなりません。
   1. 24ウェル培養皿の各ウェルに、3×10 ⁵ T細胞の合計と1.2×10ウェルあたり⁶ APCのために、ナイーブCD4 T細胞の500μlの各ウェル中の放射線照射APCの500μLを兼ね備えています。
   2. 0.2を使用して、2μM同族OVAペプチド、20 U / mlの組換えIL-2、80 / mlの抗IL-4（クローン11B11）および40 ngの/ mlの組換えIL-12およびフィルタを含むRPMI-10内の溶液を準備しますμmのシリンジフィルター。各ウェルに2mlの総容量のために、細胞の各ウェルに、この溶液を1mlを加えます。
   3. 3日間、5％CO ₂で37℃のインキュベーター中で細胞をインキュベートします。
   4. 3日目に、細胞を穏やかに再懸濁するためにピペットでよく新しい文化の中に、各ウェルから1ミリリットルを移動させることにより、培養液を分割します。 1ml / RPMI-10 + 20 U / mlの組換えIL-2のウェルを加えることによって2 mlの最終体積に各ウェルをもたらします。</李>
   5. インキュベーターにプレートを返し、細胞は5日目まで拡大することができます。

2.細胞の転送および炎症の誘導

注：イメージングのための最適な細胞数については、5×10 ⁶蛍光標識されたTh1細胞を200μlのPBSの総体積で各マウスに転送する必要があります。他の細胞追跡色素を使用することができるが、ここで細胞は、緑色色素CFSEまたは近赤色素CMTMRで標識されます。 CFSEとCMTMR標識細胞は、2つの異なるエフェクターCD4集団の追跡を可能にするために同時転写することができます。

1. CFSEで標識エフェクターT細胞
   1. 激しく各ウェル中の細胞をピペッティングし、ピペットで無菌の50mlの遠心管に移すことにより培養皿から細胞を採取します。ステップ1.1.10、その後、遠心分離機のように細胞を計数し、PBS + 5％NCSで10 ⁷細胞/ mlで細胞を再懸濁。
   2. 100：5 mMのストックCFSE液1を希釈PBS。チューブの側面にCFSE溶液の液滴を配置し、その後急速に完全に混合するために、前後にチューブを揺動することにより、細胞の各1ミリリットル、110μlのCFSEのソリューションを追加します。
   3. 細胞のチューブに直接ウシ胎児血清（FCS）を5mlを添加することによってCFSEをクエンチその後、室温で5分間、細胞をインキュベートします。 PBS + 5％NCSと50ミリリットルにボリュームをもたらします。
   4. 細胞を遠心分離し、20ミリリットルのPBS + 5％NCS中でペレットを再懸濁。 3回総細胞を洗浄するために、このプロセスをさらに2回繰り返します。ステップ1.1.10で、以前のように、血球計数器で細胞をカウントし、そしてマウスへの転送のために2.5×10 ⁷細胞/ mlで滅菌PBSで細胞を懸濁します。
2. CMTMRでラベルエフェクターT細胞
   1. ステップ2.1.1で上記のように細胞を採取し、カウントし、遠心分離し、RPMI-10で10 ⁷細胞/ mlで細胞を再懸濁。
   2. 10μMの最終濃度を細胞に直接10mMのCMTMRストック溶液を追加します。迅速にピペット番目E細胞を徹底的CMTMRで混合し、染料の析出を防止します。
   3. 37℃の水浴中で30分間インキュベートします。洗浄細胞は、ステップ2.1.3-2.1.4で、以前のようにPBS + 5％NCSで3倍。マウスに転送するために2.5×10 ⁷細胞/ mlで滅菌PBSで細胞を計数し、懸濁します。
3. 転写エフェクターT細胞は、6~8週齢の雌BALB / cマウスにナイーブします。
   1. 必要に応じて、静かに注射器の側面をフリック、注射針の側を上向きにして保持し、上下プランジャを移動させることにより、すべての気泡を除去するために注意しながら、シリンジ内に細胞懸濁液（ステップ2.1.4または2.2.3）を描きます。
   2. 尾静脈は血管拡張表示されるまで静かに加熱ランプの下できれいなケージと暑さの中でマウスを置きます。拘束装置にマウスを置き、アルコール綿棒でテールを拭きます。ゆっくりと外側尾静脈に200μlの細胞懸濁液を注入します。皮膚の下に注射または可視泡立ちへの耐性がないはずです。
4. 完全フロイントアジュバント（CFA）で免疫化することによって皮膚炎症を誘発します
   注：CFAは、同族または非同族のいずれかの抗原と乳化のこのプロトコルでは、炎症は、皮内注射によって誘導されます。転送と撮像のタイミングのために必要な細胞の数を経験的に調整する必要があるが、他の炎症性モデルは、置換されていてもよいです。
   1. マイクロチューブに滅菌PBS中のOVAペプチドの200μMの溶液を調製します。ピペットペプチド溶液の上にCFAの等量。
   2. その後、約20回この動作を繰り返し、28 G1 / 2インシュリン注射器にそれを描画した後、バックマイクロ遠心チューブにソリューションを沈めることにより溶液を乳化します。完全に乳化したときに、CFAとペプチド溶液が厚く不透明な混合物を形成します。
      注：エマルジョンは非固定needlデッドスペースに失われるように、エマルジョンを形成するために、固定針インスリン注射器を使用することが必須です電子シリンジ。
   3. ペトリ皿に入れ、水に少量をドロップすることにより、エマルジョンをテストします。エマルジョンは無傷のまま、水に分散させるべきではありません。
   4. 300μlの28 G1 / 2インシュリン注射器にエマルションを描画し、大きな気泡を除去するために、プランジャーに大幅に押し下げます。
   5. すぐに蛍光標識したエフェクターT細胞の転送後、240 mgの/ kgの2,2,2-トリブロモエタノールの腹腔内注射によってマウスを麻酔。必要に応じて、1 mgの単位でより多くの2,2,2-トリブロモエタノールを投与し、穏やかなつま先のピンチによって麻酔を評価します。
      注：他の承認された麻酔薬は、2,2,2-トリブロモエタノールの代わりに使用することができます。
   6. 左の人差し指にシンブルを置き、慎重に腹側の耳を上に向けて左手の親指と人差し指の間にマウスの耳を把握。皮膚への機械的な損傷を引き起こす可能性があります耳、に過大な圧力を加えないようにしてください。
   7. CFA eを含む針をスライドさせ真皮へのmulsionは、ベベル側が上を向いて、ゆっくりと耳にエマルジョンの10μLを注入します。注射の配置は最適なイメージングを可能にするために、ややオフセンター、耳介の外側の1/3にする必要があります。
   8. 麻酔がオフに着用しており、マウスは自分自身を右することができますし、歩行可能になるまでマウスを監視します。画像マウスの耳の真皮へのトラフィックに移入されたT細胞を開発するために、炎症のための時間を提供し、免疫後の3日間。
      注：麻酔下ながらマウスを任意の時点で放置することはできません。

3.イメージングのためのマウスを準備

1. カテーテルを準備
   1. 慎重にペンチで30 G1 / 2ツベルクリン（TB）注射針から金属針を除去し、接着剤が完全に除去されたことを視覚化するために解剖スコープを使用して、余分な糊を落とします。
   2. 残りの針がまだPであることを確認して、別の30 G1 / 2 TBの注射針のオフ先端をカット目視検査でatent。トリミングされた針の上にPE-10医療用チューブ18センチ作品をスリップし、慎重にチューブのもう一方の端部に裸の金属針は約5ミリメートルを配置し、カテーテルを作成します。
2. 滅菌PBS 1 mLのTBシリンジを充填する任意の気泡を除去することにより、カテーテルを洗い流します。静かにシリンジの先端にカテーテルを配置し、チューブ内の気泡を除去するために、カテーテルかかわらず、静かにPBSを押してください。
   注：カテーテルを通して流体を押すと、それは注射器の外カテーテルを押すからの流体圧を防止するために、注射器にカテーテルを保持するために不可欠です。
3. 尾静脈は血管拡張表示されるまで静かに加熱ランプの下できれいなケージと暑さの中でマウスを置きます。イソフルラン気化器に取り付けられたノーズコーン組立体を介して配信室内空気およびイソフルラン（2リットル/分の流量で5％誘導、1~2％のメンテナンス）の混合物を用いてマウスを麻酔。マウスをWiを麻酔されていることを確認穏やかなつま先のピンチ番目。動きが観察された場合に増分0.1％イソフルランにより流量を増大させます。マウスを麻酔されながら乾燥し、けがを防ぐために、眼軟膏で目をカバーしています。
   注：これは、麻酔をかけながらマウスが放置されることはないことが重要です。マウスは、頻繁に穏やかなつま先のピンチでは十分な麻酔のために監視する必要があります。
4. ピンセットで基部に尾を固定してから、アルコール綿棒でテールを拭きます。慎重に外側尾静脈にカテーテルをスライドさせ、ゆっくりとシリンジのプランジャーを押すことにより、開通性を確認してください。それが適切に配置されている場合は、皮膚の下の動きへの抵抗とPBSの目に見える泡立ちがあってはなりません。注射部位にシアノアクリレート組織接着剤の1〜2滴を適用することにより、尾にカテーテルを固定し、乾燥させ、約30秒。
5. 慎重にSKを損傷しないように注意しながら、ハサミで耳のバックとサイドから髪をトリミングで。同様にウィスカーをト​​リミング。綿棒を使用して、PBSを用いて耳の内表面を湿ら。
6. 24×50mmの第1.5ガラスカバースリップ上にマウスと耳を回転させます。鉗子を使用して、静かに耳をガラスと面一であることを保証するために必要な場合は、マウスを動かし、カバースリップ上に耳を平らに。ワイプティッシュで軽くブロッティングにより耳から過剰のPBSを削除してください。
   注：薄い皮膚は簡単に過度の圧力で破損することができるように、耳にあまりにもしっかりと押していないことを確認してください。
7. 湾曲した鉗子の2ペアを使用して、長さ方向上部の角に布テープの約20ミリメートル長い作品を把握。マウスの耳の上部にカバースリップ上にテープの底に置き、カバースリップに耳を固定するために、必要に応じて鉗子で邪魔にならないように、過剰な髪を押し、耳の残りの部分の上にテープをロールバックします。そっと耳自体に押ししないように注意しながら、緊密なシールを確実にするために乾いた綿棒で耳の周りにテープに押してください。
8. 粘着テープで37℃の加熱ブロックにイメージングプラットフォームを取り付けます。イメージングプラットフォームの耳領域のいずれかの側に真空グリースを塗布します。フェルトの中心に耳を揃えるように注意しながら、撮影台の上にカバースリップを配置するためにマウスを回転させます。
   注：これは、それがガラスカバースリップから切り離さてくるようになりますように、テープ上に真空グリースを入らないように注意してください。
9. ノーズコーンが安全であることを保証し、完全にマウスの鼻を覆って、イメージングプラットフォーム上のホルダーにイソフルランノーズコーンをはめ込みます。しっかりと、かつ慎重に、きれいな乾いた綿棒でイメージングプラットフォーム上にカバースリップを押すことにより、カバーガラスの下に真空グリースを広げます。
10. テープの2 20ミリメートル片とプラットフォームの上部に巻き付けたテープの2長い作品でプラットフォームにカバーガラスを貼り付けてください。気泡が耳とカバーガラスの間に存在する場合、それらは穏やかのWi下から耳に押すことによって除去することができます折り畳まれた一枚の紙番目。
    注：結果を複雑に、組織のブランチングや損傷の原因となりますので、しっかりと押して厚すぎたりである用紙を使用しないことが必須です。
11. 顕微鏡ステージにマウスを移動し、粘着テープでプラットフォームを固定します。耳の周りの​​カバーガラス上にパイプ真空グリースの二重層は、水浸対物レンズ用の貯水池として機能します。
12. イメージングプラットフォームを介してマウスの周りに水を充填した加熱ブランケットをラップします。 37℃の蒸留水で貯水池を埋めます。すべてが粘着テープでカテーテルのシリンジが簡単にアクセス可能であることをステージに固定されていることを確認してください。

インビボでのタイムラプスイメージングと静脈内抗体の管理4.

注：土・レーザ・システム：このプロトコルは、Tiを搭載した多光子顕微鏡を使用する必要があります。使用目的は、オブジェクトに貼り付けられ、1.05 NAの25倍の倍率のレンズでありますアイブヒーターを40℃に設定してください。このヒータのための最適温度は37℃での耳の皮膚を維持するための適切な温度であることが経験的に決定し、他の画像化システムで使用するために調整する必要があります。使用収集ソフトウェアは、プロトコルへの楽器との調整の間で変化し得る異なる構成のシステム上で動作するように作らなければならないことがあります。画像は、任意の所望の解析ソフトウェアと互換性のある形式で保存することができていることを確認してください。

1. 耳の中心上の目的を配置し、リザーバ内にそれに接触するまで、ちょうど水の表面を客観的に低下させることにより、接眼レンズを通して真皮を探します。外部光源を使用して、接眼レンズを通して見て、耳の表面が焦点になるまでゆっくりと目標を下げるために続けています。顕微鏡ステージの周りの内側と外側のカーテンを下ろします。
2. 顕微鏡の設定を決定し、イメージングのための領域を見つけます
   1. イマジン前画像取得コントロールウィンドウでレーザーウィンドウ、およびPMT電圧：グラム、MPレーザーControllerウィンドウで900nmのレーザー波長を調整することにより、所望の蛍光体の最大励起および検出のための取得設定でレーザパワーをレーザーを設定。
      注：この手順では、第二高調波発生（420-460 nm）を、CFSE（495から540ナノメートル）、およびCMTMR（575から630 nm）を検出するためのフィルタを900 nmでの励起波長を使用しています。その他の構成は、必​​要に応じて、異なるフルオロフォアを検出することができます。
   2. サイズとモードの窓：取得設定で2マイクロ秒/ピクセル滞留時間で、512×512ピクセルの解像度に顕微鏡を設定します。 「XYリピート」をクリックすることで、画像の領域のための組織を通るスキャンを可能にするために、ライブイメージングモードを有効にします。理想的には、領域は、気泡なしに、比較的均一で、かつ高密度の毛包の領域を回避すべきです。
      注：CFAエマルジョンは緑とねに明るく自家蛍光でありますAR-赤チャネルおよび避けるべきです。最適なフィールドには、通常、エマルジョンのエッジから約3ミリメートルを見つけることができます。約10 - 100個の細胞は、単一の画像において追跡することができます。あまりにも多くの細胞が存在する場合は、ソフトウェアを追跡することは、一般的に短縮および/または不正確な細胞トラックにつながる、近接細胞を分離しようとしてエラーが発生します。
   3. 適切な撮像視野が配置された後、「設定0」ボタンをクリックすることで、0〜Z位置を設定し、Zでスクロールダウン、真皮内のセルを「最高」配置することによって画像化されるZ領域を決定方向は、セルの深さの程度を測定します。 35-75ミクロンの撮像深さが典型的です。顕微鏡ウィンドウ：取得設定内の開始位置と終了位置を設定します。撮像視野の深さ全体に細胞の可視化を最適化するために、「明るいZ」ウィンドウ内の計器PMT電圧およびレーザパワーを調整します。
      注：ラスを上げることは避けてくださいサンプルで25 mWの上記えー電力、高電力レベルが熱損傷及び真皮に滅菌傷害を引き起こす可能性がありますように。各顕微鏡用の適切な最大電力レベルが変化し、測定する必要があります。組織の深さのレーザパワーやPMT電圧を増加させることは、ポスト取込み分析における異なる深さで画像の明るさの定量的な比較を可能にしないことに留意すべきです。
   4. 画像取得コントロールウィンドウで「スキャン」ボタンの下の「深さ」と「時間」のボタンをチェックしてください。フィルタモードのウィンドウをし、画像取得のZスライス深さ調整：画像取得コントロールに画像をライン当たり3回スキャンするカルマン・フィルタを設定し、それは完全なスタックをキャプチャするのに約1分となるように述べたように、顕微鏡のウィンドウをタイムビューウィンドウインチ
      注：長い間隔が急速に移動する細胞の追跡を防ぐようスタック間の間隔は、約1分を上回ってはいけません。目に応じて、画像化される細胞のE型は、この間隔は、解析ソフトウェアにより適切セルの追跡を可能にするように調整する必要があります。 Z-スライスは5μm以下でなければなりません。一般的に、厚さは2〜5μmの間で15-18 Z-スライスは1分間の撮像間隔に適しています。
3. プレ抗体タイムラプス画像をキャプチャ
   1. 取得設定で「5」にリピートの数を設定することにより、組織の安定性を評価するために面積の5分のタイムラプス画像をキャプチャ：TimeScanウィンドウと「スキャン」ボタンをクリックします。
      注：組織「ドリフト」は熱平衡、悪い耳の準備に到達するための耳のための十分な時間を許可しないことが原因で発生することができ、または起因する耳の1の地域におけるドリフトにすることができます。 5分の画像が安定していない場合は、画像真皮における新しい領域。新しい領域の第2の画像が不安定なままである場合、それは慎重に新鮮なCOVでステップ3.6から耳の準備と撮影を繰り返すのがベストですerslip。
   2. 組織は5分の画像内で安定している場合は、取得の設定で30〜45に繰り返し数を設定することにより、30から45分のタイムラプス画像を収集します。TimeScanウィンドウを、画像であるとして任意のマイナー組織ドリフトを監視集めました。使用する解析ソフトウェアと互換性のある形式でファイルを保存します。
      注： - 4.3.2と同じ耳の中の画像の複数の場所に繰り返すことができるプロトコルのこの時点では、4.2.2を繰り返します。死が発生しやすくなるように、単一のマウスは、4時間よりも長いため、麻酔したままにしてはいけません。
4. ブロッキング抗体を注入し、後の抗体の画像をキャプチャします。
   1. 1ミリリットルのTBシリンジに抗体混合物を描画し、すべての気泡を除去することを確認して、針を取り除きます。プランジ​​ャーを押し抗体溶液をシリンジの末尾に「液滴」を形成するようにします。
   2. ステージの周りにカーテンを持ち上げて、カテーテルを探します。オリジナルのPBS-コンタを削除しますカテーテルからiningシリンジ。カテーテルを下に置かず、慎重に抗体を含む新しい注射器を取り付けます。シリンジにカテーテルの端部を持ち、ゆっくりとカテーテル内に抗体混合物を注入します。注射に対する抵抗性がないことを確認してください。
   3. ダウンカテーテルを設定し、顕微鏡ステージを囲むカーテンを下げます。注射の時間に注意し、直ちにプリ抗体画像と同じ機器設定を使用して、同じ場所に新しい20-40分の撮像シーケンスの収集を開始。解析ソフトウェアを使用するために適切な形式でファイルを保存します。
      注：タイムラプス画像の間には、十分な麻酔および呼吸のためのマウスを観察します。抗体のクリアランスの変動金利があり得るとして、それは、抗体の投与後の複数のフィールド画像にはお勧めしません。
5. 血管の位置を特定する蛍光標識デキストランを注入し、カテーテルの開存性を評価し、Bを測定しますlood血管透過性
   1. 100μl中の蛍光共役デキストラン（7万MW）の無菌PBSに2mg / mlの溶液を調製し、気泡を除去し、シリンジ内に引き込みます。
   2. ステップ4.4.1-4.4.2と同じ技術を用いて、カテーテルに注射器を配置し、静脈内にデキストラン溶液を注入します。
   3. タイムラプス画像の場合と同じPMTとレーザー設定で、モード・ウィンドウ：取得設定で解像度を変更することにより、1024×1024ピクセルの解像度で、単一のスタックをキャプチャします。画像を収集するには、「スキャン」ボタンの下に「時間」ボタンをオフにしてから、「スキャン」ボタンをクリックします。この3D画像は、血管系に位置する排他T細胞を可能にし、カテーテルが特許だったと正しく挿入することを示します。容器のうちの蛍光デキストランの拡散は、局所血管透過性を評価することができます。
      注：この高解像度（1024×1024）静止画像は、PRのために使用されていますesentation目的とさらにタイムラプス画像と同じ領域の組織構造の分析のために使用することができます。代替的に、512×512の画像は、画像解析ソフトウェアを用いてタイムラプス画像をマージすることができる、取り出すことができます。デキストラン投与の時間経過イメージングは​​、個々の研究室の研究の必要性に応じて、所望され得ます。この場合、画像は、ステップ4.2.3-4.3.2のように設定する必要があります。
6. 撮影が完了した後、慎重に目的の下からマウスを取り外し、水ブランケットをアンラップ。テープをカットし、静かにそれが外れるまでガラスを持ち上げて撮影台からカバースリップを削除します。マウスがまだ麻酔されている間、カバーガラスから耳を切り離します。これは、端末の手順にする場合は、頚椎脱臼によりマウスを安楽死させます。繰り返しイメージングのために、このマウスを保存する場合は、マウス自体が右であることが可能になるまで、他のマウスから分離して観察するクリーンなケージに戻します歩行。麻酔から回復したら、マウスを他の動物とのケージに戻すことができます。
7. 画像解析プログラムにイメージングファイルをインポートして、任意の所望の補正を行います。非線形強化と自動化された平滑化やノイズリダクションプログラム、アルゴリズムの回避を推奨します。一般的に、画像を手動で分析する前に、画像の黒点を増加させることにより、わずかなバックグラウンド補正を必要としています。オーバストリート、Gaylo ら ³⁰のように、手動補正と自動細胞追跡プログラムを使用して撮像データを分析します。
   注：このプロトコル由来多画像から細胞動態を定量化するために使用することができ、両方のプロプライエタリとオープンソース利用可能な多くの画像解析スイートは、あります。画像解析に使用する最適なソフトウェアパッケージの正確な方法は、個々の研究室の研究の必要性に依存するであろう。

免疫環境を変更することなく、 その場での免疫応答を研究する能力は、炎症組織でTエフェクター細胞のリアルタイム相互作用の研究に不可欠です。 図1AおよびBで概説し、このプロトコルにより、無傷の耳の真皮のイメージングは、皮膚の間質における転送蛍光標識されたTエフェクター細胞の可視化を可能にします。これは、高解像度（ 図1C）とタイムラプス（ 図1D、 映画1）炎症を起こし、真皮内のエフェクターT細胞動態の画像の両方を可能にします。

図1.高解像度と無傷の皮膚の間質におけるTエフェクター細胞の4Dイメージング 。 （A）実験概要。耳preparの（B）写真エマルジョンの部位とイメージング（黒破線）およびイメージングのための最適な領域（赤線）のためのedが示されました。 （C）最大の3D CFSE標識Th1細胞（緑）を示す高解像度のスタックの投影、線維状コラーゲン（青）からの第二高調波信号およびテキサスレッドデキストラン標識された血管系（赤）。白い矢印は、いくつかの自家蛍光毛包のいずれかを示します。スケールバーは、CFA-炎症を起こし真皮に30分間追跡Th1細胞の50ミクロン（D）回遊パスを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

この撮影プロトコルは、社内で構築した特殊なイメージングプラットフォームだけでなく、撮像しながら吸入麻酔の送達のための適応ノーズコーンを使用する必要があります。イメージングプラットフォーム（ 図2A-B）は Oで構成さ隆起した中央部分でアルミベースプレートF。この隆起部分はアクリルと並ぶはめ込み部分が圧縮して、潜在的に薄い組織に損傷を与えることなく、耳へのサポートを提供するために感じています。私たちのセットアップの幾何学的形状は、撮像中に吸入麻酔を提供するために、柔軟で調整可能なノーズコーンの構築を必要としました。フレキシブルチューブ（ 図2C）の50ミリ部に接続された変更されたマイクロチューブからなるこのノーズコーンは、修正されたマイクロチューブからなるホルダー（ 図2D）で適所に固定されたフックとループファスナーを介して撮影台に固定されています。マウスのいずれかの耳を撮像することができ、最適な個々のマウスのために配置することができるように面ファスナーの使用は、ノーズコーンアセンブリの再配置を可能にします。

図2.エクイ生体内イメージングのためのpment。トップ（A）および側面（B）ビューのカスタム構築されたイメージングプラットフォーム。イソフルラン投与（C）とノーズコーンホルダー（D）のためのノーズコーン。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

尾静脈のカテーテル法は、抗体と血管系の外に拡散することができる他の小分子を投与するために、循環への継続的なアクセスを可能にする、またはそのような高分子量のデキストランのようなより大きな蛍光分子は、血管を標識します。抗β1およびカテーテルを通してブロッキング抗体抗β3インテグリンを100μgを投与した後、以前に運動性細胞は、真皮（ 動画2）内で逮捕します。これらの細胞は、抗体後に減少した平均速度を持っています管理（ 図3A）、ならびに蛇行指数の有意な減少、総トラック長（ 図3B）への総変位の比率。

抗β1 および抗β3 抗体 の 図3. 投与は、CFA 炎症を起こした皮膚におけるTh1細胞の遊走を阻害する。（A）Th1細胞の平均速度を前にし、100μgの抗β1および抗β3インテグリンの投与後ブロッキング抗体を。 （B）蛇行前Th1細胞の指標と抗体遮断後。約100追跡された細胞は前と1代表的な実験における単一のマウスから抗体遮断後の画像からのものです。マン・ホイットニー別統計。エス/ ftp_upload / 53585 / 53585fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

毛髪は、耳の表面から除去されないので、毛髪からの撮像アーチファクトが一般的です。彼らはT細胞を曖昧にし、自動画像解析ソフトウェアを妨害することができるように、毛包（ 図4A）及びその上毛（ 図4B）からシャドーイングおよび自己蛍光からの自家蛍光は、可能な限り避けるべきです。同様に、耳の表面とカバーガラスとの間に捕捉された気泡は、撮像アーチファクト（ 図4C）をもたらすことができます。耳の適切な準備が残っている泡の数とサイズを最小限に抑える必要があります。

図4。 髪の自家蛍光と貧しい耳の前から一般的な成果物paration。（A）自己蛍光毛包。画像内の暗線を引き起こし、毛の影の上にあると（B）自己蛍光の毛と毛包（緑）、コラーゲン（白）。 （C）気泡からアーティファクト、変位、自家蛍光角化表皮（点線）のエッジを示します。スケールバーは50μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

さらに、熱の複数のソースを使用すると、熱膨張収縮に起因する組織の安定性の問題につながることができます。不適切なサーモスタットの設定は、例えば、（ 動画3）難しい結果の解釈を行うことができます撮影時の大きな振動につながることができます。一定の温度を提供し、安定性を最大化する任意のシステムに最適な設定を決定することが必須です。 Ultimatエリー、温度制御された画像化チャンバは、温度変化から変動を除去するための最良の方法です。

CFA-炎症真皮に移行ムービー1. Th1細胞は、（右クリックしてダウンロード）。 30分のタイムラプス画像は、真皮コラーゲンネットワークに移行するTh1細胞（緑）（第二高調波発生、青）を示します。

β1の遮断と3インテグリンをβ時のムービー2. Th1細胞の停止（右クリックしてダウンロード）。細胞（緑）administ前に30分間画像化しましたブロッキング抗体の比と同じ場所にさらに20分間撮像しました。

コントロール不良の加熱プレートからムービー3.振動（右クリックしてダウンロード）。 30分タイムラプスTh1細胞（緑）の画像と第2高調波発生（青）。この画像を収集した後、使用される加熱プレートを画像化プラットフォームとそれに続く熱膨張と収縮の温度で振動を引き起こし、不良サーモスタットを有することが見出されました。

著者らは、開示することは何もありません。