炎症部位でのCD4エフェクターT細胞の間質運動を支配するメカニズムは、比較的知られていません。我々は、in vitroで視覚化して操作するための非侵襲的なアプローチは、その場でこれらの細胞の動的挙動の研究を可能にする、炎症を起こした耳の真皮中のCD4 T細胞を-primed提示します。
この記事について
サマリー
要約
エフェクター機能を実行するCD4 T細胞の能力は、未未定義の機構を介して炎症の末梢組織におけるこれらの細胞の迅速かつ効率的な移行に依存します。免疫系の研究に多光子顕微鏡の応用は、無傷の組織内の免疫応答の動態を測定するためのツールを提供しています。ここでは、炎症を起こしたマウス耳真皮におけるCD4 T細胞の非侵襲的な生体内多光子イメージングのためのプロトコルを提示します。カスタムイメージングプラットフォームの使用及び静脈カテーテルは、運動性に関与する重要な分子成分に対する抗体をブロッキング添加によってリアルタイムでこれらの細胞に問い合わせする能力を、皮膚間質におけるCD4 T細胞の動態の可視化を可能にします。このシステムは、in vitroモデルおよび外科的侵襲的な画像化手順の両方に勝る利点を提供します。運動のためのCD4 T細胞によって使用される経路を理解することは、最終的にバシへの洞察を提供することができますCのCD4 T細胞の機能だけでなく、慢性感染症からの両方の自己免疫疾患の病因と病理。
概要
CD4 T細胞のエフェクター機能は、損傷の調査、感染の病巣の特定、または慢性感染や自己免疫による病理を引き起こすために、さまざまな末梢組織に迅速に侵入して横断する能力に大きく依存しています。 炎症部位1-4へのホーミングと血管系から組織への血管外漏出5-7のプロセスは十分に特徴付けられていますが、T細胞の間質運動性を駆動および調節する因子は未定義のままです。複雑な3D環境におけるT細胞の移動は、人工マトリックス8-10またはマイクロ流体デバイス11,12を用いてin vitroで研究されてきたが、これらはin vivoシステムの複雑で動的な環境を再現することができない。高解像度のマルチカラー生体内イメージングの出現により、免疫細胞の動的挙動をin situで研究することが可能になり、無傷の免疫応答をより深く理解できるようになりました。
10年以上前に、免疫学的な問題に取り組むために初めて多光子顕微鏡を利用したいくつかの影響力のある研究が発表されました。初期の研究では、外植リンパ器官内の免疫細胞の挙動に焦点を当てていました13-16、その後すぐに麻酔をかけたマウスの露出したリンパ節を画像化する技術が続きました17。イメージングにより、T細胞18のリンパ節プライミングの段階、....
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プロトコル
マウスを含むすべての手順は、ロチェスター大学の施設内動物管理使用委員会によって承認され、国立研究所によって投与動物福祉法と動物愛護実験動物の管理と使用に関する公衆衛生サービスポリシーに厳密に従って行きました健康、実験動物福祉のオフィスの。
エフェクターCD4 T細胞の調製
注：特に鶏卵卵白アルブミン（：ISQAVHAAHAEINEAGR pOVA）由来のペプチドを認識したBALB / c TCRトランスジェニックDO11.10マウス。その他のTCRトランスジェニックシステムが示されたpOVAの代わりに適切な同族ペプチドを使用して、置換することができます。
- ナイーブCD4 T細胞を精製
- マウスは頸椎脱臼に続いて、1分間の運動や呼吸の兆候を示していないまで、2リットル/分のCO 2にさらす、またはに従ってによって6-8週齢の雌DO11.10 BALB / cマウスを安楽死させます地元の施設内動物管理使用委員会のガイドライン。 70％エタノール溶液でマウスをスプレーし、腹部ダウン道の2/3にマウスの顎から皮膚内の約7センチの切開を行います。後足に向かって腹部の切開部の端2〜3センチの皮膚切開を行います。腹膜にカットしないように注意してください。
- 慎重に静かにピンセットで引っ張ることにより、腹膜から皮膚を分離します。鼠径リンパ節を本体と後肢の接合部付近の皮膚....
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結果
免疫環境を変更することなく、 その場での免疫応答を研究する能力は、炎症組織でTエフェクター細胞のリアルタイム相互作用の研究に不可欠です。 図1AおよびBで概説し、このプロトコルにより、無傷の耳の真皮のイメージングは、皮膚の間質における転送蛍光標識されたTエフェクター細胞の可視化を可能にします。これは、高解像度（ 図1C）とタイムラプス（ 図1D、 映画1）炎症を起こし、真皮内のエフェクターT細胞動態の画像の両方を可能にします。
図1.高解像度と無傷の皮膚の間質におけるTエフェクター細胞の4Dイメージング.......
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ディスカッション
意義
ここでは、無傷のマウス耳真皮における転送、抗原特異的なエフェクターTh1細胞の4D可視化のための完全なプロトコルを提示します。この方法は、いくつかの理由のために、いくつかの現在の撮像モダリティ上の利点を提供します。腹側の耳の真皮を画像化することによって、我々は他の皮膚部位を含むイメージング・プロトコルのために必要とされる脱毛を見送ることができます。脱毛剤は、一般的に軽度であるが、それらは皮膚バリア42、免疫応答43,44を刺激することができるプロセスに混乱を引き起こすことが示されています。また、真皮や皮下組織を露出させるために侵襲的な外科的処置を回避することにより、このプロトコルは、損傷誘発炎症と真皮への好中球37および他の免疫細胞の迅速な動員を防止します。重要な分子に対するブロッキング抗体を提供するために、このシステムにおける静脈カテーテルの使用は、DYNAのリアルタイム尋問を可能にしますCD4 T細胞のマイク行動。この撮像プロトコールを使用することは、 イン.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
著者は、ライブイメージングのヘルプのためのロチェスター大学の多光子顕微鏡中核施設に感謝します。 DJFにNIH AI072690とAI02851によってサポートされています。 MGOへAGおよびAI089079にAI114036。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BALB/c マウス | ジャクソン研究所 | 000651 | 使用したマウスは社内で飼育しました |
| DO11.10 マウス | ジャクソン研究所 | 003303 | 使用したマウスは社内で飼育しました |
| HBSS | フィッシャー | 10-013-CV | 多重等 |
| 価子牛新生児血清 (NCS) | サーモ/ハイクローン | SH30118.03 | 56°Cで不活化モル |
| モット補体 | ダーレーン | CL-5000 | |
| 抗CD8抗体 | ATCC | 3.155(ATCC TIB-211) | 得られる抗体 このハイブリドーマ |
| 抗MHCクラスII抗体 | ATCC | M5/114.15.2(ATCC TIB-120) | から得られる抗体 このハイブリドーマ |
| 抗CD24抗体 | ATCC | J11d.2(ATCC TIB-183) | から得られる抗体抗体は このハイブリドーマ |
| 抗Thy1.2抗体 | ATCC | J1j.10(ATCC TIB-184) | 抗体由来 このハイブリドーマ |
| Ficoll(Fico / Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | 複数の同等の |
| EDTA | フィッシャー | 15323591 | |
| ビオチン化抗CD62L抗体(クローンMEL-14) | BD | ||
| ストレプトアビジン磁気分離ビーズ | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS 分離カラム | Miltenyi | 130-042-401 | |
| 組換えヒト IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| 組換えマウス IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| 組換えマウス IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| 抗IFNg抗体 (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anti-IL-4 antibody (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | フィッシャー | 15303641 | |
| L-グルタミン | フィッシャー | 15323671 | |
| 2-メルカプトエタノール | バイオ・ラッド | 161-0710 | |
| オボアルブミンペプチド | バイオペプチド | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH ペプチド | |
| 牛胎児血清 (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | 56°Cで不活性化C 30分間 |
| 24ウェル培養プレート | LPS | 3526 | 複数等価 |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 インスリン注射器、1ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 インスリン注射器、300μ;l | BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB シリンジ、1ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 針 | BD | 305106 | |
| PE-10 医療用チューブ | BD | 427400 | |
| シアノアクリレート獣医用接着剤 (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| 加熱プレート | WPI | 61830 | |
| 加熱プレート コントローラー | WPI | ATC-2000 | |
| ウォーターブランケットコントローラー | ゲイマー | TP500 | 生産終了、新しい同等の |
| 利用可能なウォーターブランケット | ケントサイエンティフィック | TP3E | |
| イソフルラン気化器 | LEI Medical | Isotec 4 | 生産終了、新しい同等の |
| 利用可能なイソフルラン | ヘンリー・シャイン | 獣医を通じて注文スタッフ | |
| マイクロ遠心チューブ | VWR | 20170-038 | 複数等価 |
| 医療テープ | 3M | 1538-0 | |
| イソフルランノーズコーン | 社内で構築、図2 | ||
| イメージングプラットフォーム | 社内で構築、図2 | ||
| 湾曲した鉗子 | WPI | 15915-G | 複数の同等の |
| ハサミ | Roboz | RS-6802 | 複数の同等の |
| ガラスカバースリップ | VWR | 複数の同等の | |
| 高真空グリース | フィッシャー | 146355D | |
| 綿棒 | 複数の同等の | ||
| 繊細なタスクワイプ | フィッシャー | 34155 | 複数の同等の |
| オリンパス Fluoview 1000 AOM-MPM 直立顕微鏡 Spectra-PhysicsMaiTai HP DeepSee Ti:Saレーザー | オリンパス | ||
| 振動制御付き光学テーブル | ニューポート | 見積もり | |
| 25倍NA 1.05 多光子イメージングのための水浸対物レンズ | オリンパス | XLPLN25XWMP2 | |
| 対物レンズヒーター | Bioptechs | PN 150815 | |
| 検出フィルターキューブ | オリンパス | FV10-MRVGR/XR | 独自のキューブは、個々のフィルター/ダイクロイクス |
| 抗インテグリン&βから近似することができます。1抗体(クローンhMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | アジドフリー、低エンドトキシン |
| 抗インテグリン&β;3抗体(クローン2C9。G3) | eBioscience | 16-0611-82 | アジドフリー、低エンドトキシン |
| テキサスレッドデキストラン (70,000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
参考文献
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al.
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