「ヒト化」を生成ショウジョウバエ S2細胞株

サマリー

このプロトコルは、キネシン-5の低分子阻害剤に感受性を持つショウジョウバエS2細胞株を生成する方法を説明しています。細胞ベースのエラー訂正アッセイにおけるこれらの細胞の使用についても概説します。

要約

キネトコレは、細胞分裂中にセントロメア上に集まり、染色体を紡錘体微小管にリンクする大きなタンパク質ベースの構造です。遺伝物質を適切に分布させるには、すべての染色体上の姉妹動原体が、後期に進む前に、反対側の紡錘体極から微小管に付着することにより二配向性になる必要があります。しかし、誤った非二方向結合状態が一般的であり、細胞分裂中にそのような付着を検出し、修正するための細胞経路が存在します。不適切な動原体-微小管の相互作用が不安定になるプロセスは、エラー訂正と呼ばれます。生細胞のエラー訂正を研究するために、キネシン-5モーターの化学的阻害によって意図的に誤った付着が生成され、これがモノポーラスピンドルアセンブリを引き起こし、薬物のウォッシュアウト後に誤った配向から二方向の移行が観察されます。多くのモデル組織培養細胞タイプには多数の染色体が存在するため、個々のエラー修正イベントを観察する上で課題があります。ショウジョウバエ S2細胞は、染色体が4対しかないため、このような研究に適した対象です。しかし、低分子キネシン-5阻害剤はショウジョウバエキネシン-5(Klp61F)に対して効果がありません。ここでは、Klp61Fをヒトキネシン-5に効果的に置き換えるショウジョウバエ細胞株を構築する方法を説明します。これにより、細胞はモーターの薬理学的阻害に敏感になり、細胞ベースのエラー訂正アッセイでの使用に適しています。

概要

細胞分裂中のゲノムの均等な分離には、複製されたDNAと紡錘体微小管との間の正しい相互作用が必要です。微小管は、動原体¹として知られるセントロメアで集まるタンパク質のアンサンブルを通じて染色体と物理的に相互作用します。染色体を正しく分布させるには、姉妹動原体が二配向していること、つまり、各姉妹が反対の紡錘体極に由来する微小管に関連付けられている必要があります。バイオリエンテーションコンフォメーションにない動原体微小管(kt-MT)アタッチメントは、迅速かつ効率的に不安定化され、エラー訂正として知られるプロセスでバイオリエンテーションを確立する機会を提供します。以前に哺乳動物細胞⁵で確立された誤り訂正アッセイ5では、Eg5(キネシン-5)に対する可逆的な低分子阻害剤を使用して単極性紡錘体を組み立てる必要があります。薬物治療は、両方の姉妹動原が同じ紡錘極に付着する多数の誤ったシンテリックアタッチメントを生成します。その後の薬物のウォッシュアウトにより、エラー訂正プロセスを視覚化できます。エラー訂正アッセイは、低分子阻害剤またはノックダウンの存在下で実施し、候補タンパク質が誤ったkt-MT付着の修正に寄与する様子を研究することができます。

生きた細胞のエラー訂正を可視化する能力は、この複雑なプロセスに関与する分子メカニズムをさらに理解するための強力なツールです。しかし、ほとんどの細胞株には多数の染色体が存在するため、個々のkt-MT接着を観察する際に課題が生じます。ショウジョウバエ S2細胞は、染色体⁶が4つしかないため、エラー訂正アッセイの適用に理想的ですが、S-トリチル-L-システイン(STLC)やモナストロール^7-9などのキネシン5の低分子阻害剤は、ショウジョウバエ細胞の紡錘体アセンブリやキネシン-5の運動機能に影響を与えません。したがって、キネシン-5阻害剤に感受性のある誘導性プロモーターの下でヒトキネシン-5を発現するショウジョウバエS2細胞株を作製しました。このプロトコルは、内因性ショウジョウバエキネシン-5相同体Klp61Fをノックダウンし、この細胞株を細胞ベースのエラー訂正アッセイで使用する方法について説明します。

プロトコル

1. S2細胞のトランスフェクション

1. 以前に培養した25 cm²フラスコから、GFP-α-tubulin発現S2細胞¹⁰を最終容量2 mLまで100%コンフルエンシーで加え、35 mm組織培養皿の底に約1時間半接着させます。
2. メディアを皿から取り出します。Eg5-mCherryコンストラクト¹¹の2μgを、10%FBS(以下、シュナイダー培地と呼ぶ)およびトランスフェクション試薬を添加した1 mLのシュナイダー培地とともに、メーカーのプロトコールに従ってトランスフェクションします。皿をParafilmで密封し、細胞を25°Cで16〜18時間インキュベー
トします。
3. シュナイダー培地1mlを加えます。細胞を25°Cインキュベーターに戻します。
4. トランスフェクション後3日目に、トランスフェクションした細胞500 μlを、1.5 mLのSchneider培地を含む新しい35 mm組織培養皿に移し、試験導入を行います。CuSO₄を最終濃度500 μMまで添加してEg5-mCherryの発現を誘導し、ディッシュをパラフィルムで密封し、25°C O/Nでインキュベートします。
5. コンカナバリンAコーティングカバースリップを作るには、酸洗浄されたカバースリップをコーティングするのに十分な量のコンカナバリンA溶液(H₂Oに溶解した0.5 mg / ml)をピペットで動かし、余分なものを取り除き、カバースリップを風乾させます。.
6. 22 mm x 22 mmのコンカナバリンAコーティングカバースリップを清潔な35 mm組織培養皿に入れ、誘導した細胞の100%の密度で500 μlをカバーガラスに播種し、細胞をRTで1時間接着させます。
7. Eg5-mCherryの発現を確認するには、カバーガラスをローズチャンバー(または適切なイメージング容器)に組み立て、蛍光顕微鏡でRTでイメージングするための培地を入れます。適切な光源とフィルターセットを使用して、セルを視覚化します。例えば、本研究で用いた顕微鏡は、LED白色光源とEGFP(FITC/Cy2)およびDSRed(TRITC/Cy3)フィルターキューブを備えています。Eg5-mCherryは微小管に局在し、紡錘体極の近くで濃縮されます。
8. 細胞がEg5-mCherryとGFP-α-チューブリンの両方を発現していることを確認した後、トランスフェクションした未誘導細胞の残りを、4 mLのシュナイダー培地を含む25 cm²組織培養フラスコに移します。
9. トランスフェクションした細胞のフラスコに最終濃度25 μg/mLのブラストシジンS HCLを添加し、細胞死が止まるまで25 μg/mLのブラストシジンS HClの存在下で分裂を続け、Eg5-mCherryの発現を定期的にチェックします。細胞株を25°Cインキュベーターでインキュベートします.
   注:Eg5-mCherryを発現する細胞の割合は、時間の経過とともに増加します。
10. 細胞が安定してトランスフェクションされたら、薬物なしで分裂を続け、将来の使用のために¹²個の細胞を凍結します。

2. RNA干渉

1. PCRは、dsRNA合成のテンプレートとして使用するT7プロモーター配列(材料リストに記載されている配列)を添加したプライマーを使用して、cDNA(LD15641)からKlp61Fの~500 bp領域を増幅します。
   1. 100 ngのテンプレートDNA、各プライマー25 μM、適切なバッファー、およびポリメラーゼを含む4つのPCR反応(各50 μl)を設定します。ポリメラーゼの製造元のプロトコルに従って、サーモサイクラーにPCRプロトコルを設定します。
   2. PCRクリーンアップキットを使用して、メーカーのプロトコルに従って4つのPCR反応をプールし、洗浄します。クリーンテンプレートは-20°Cで保存してください。
2. T7 RNA転写キットを使用して、テンプレートから二本鎖RNA(dsRNA)を調製します。これは、製造元の指示に従ってください。dsRNAの濃度は~5-15 mg/mLと予想されます。dsRNAは-20°Cで保存します。
3. dsRNAでKlp61Fをノックダウンするには、Eg5-mCherryを25%のコンフルエントで発現するS2細胞を、35 mm組織培養皿の底に1時間半接着させます。
4. 培地を皿から取り出し、Klp61F(ショウジョウバエキネシン-5)に対するdsRNA5 μgを1 mLの無血清シュナイダー培地に希釈して加えます。
5. RTで1時間インキュベートした後、10% FBSを含むSchneider培地1 mLを加えます。細胞を25°Cでインキュベートします。
6. dsRNA処理の24時間後、CuSO₄を最終濃度500μMまで添加してEg5-mCherryの発現を誘導し、細胞を25°Cでさらに24時間インキュベートします。

3. ライブセルイメージング

1. 22 mm x 22 mmのコンカナバリンAコーティングカバースリップを清潔な35 mm組織培養皿に入れます。
2. dsRNAで処理し、O/Nを誘導した細胞500μlをコンカナバリンAコーティングカバースリップに播種し、約1時間接着します。
3. カバーガラスをバラチャンバー(または適切な容器)に組み立ててイメージングします。
4. Eg5-mCherryとGFP-α-tubulinの両方を発現する有糸分裂細胞を見つける
   注:GFP-α-チューブリンのみを発現する有糸分裂細胞は、紡錘体の双極性に必要なKlp61Fがノックダウンされるため、単極性紡錘体を持つ必要があります^10,13。
5. Eg5-mCherryとGFP-α-tubulinの両方を発現する細胞内のバイポーラ紡錘体のタイムラプス画像(例:1分あたり1フレーム)を収集します。
6. イメージング中に、ローズチャンバーから培地を取り出し、1 μM STLCを含むシュナイダー培地と交換し、3回連続して培地交換(合計~5 mL)してチャンバーに入れ、スピンドルの崩壊を視覚化します。
7. 薬物を洗い流し、紡錘体の崩壊を元に戻すには、STLC含有培地をローズチャンバーから慎重に取り出し、シュナイダーの培地を4回(合計6〜8 ml)洗浄してから、ローズチャンバーに最後にもう一度新鮮な培地を補充します。イメージングを続けます。

4. エラー訂正アッセイ

1. 22 mm x 22 mmのコンカナバリンAコーティングカバースリップを清潔な35 mm組織培養皿に入れます。
2. Klp61F dsRNAで処理した細胞500 μlをconcanavalin Aコーティングカバースリップに播種し、接着させます。
3. 細胞を接着した後、各ディッシュに1.5 mLのシュナイダー培地を加えて、最終容量を最大2 mLにします。
4. 有糸分裂で細胞を停止させるには、MG132を各皿に最終濃度10μMまで加え、1時間インキュベー
トします。
5. 1 μM STLCを添加し、1時間インキュベートしてモノポールが形成されます。
6. 毎回2mlの新鮮なシュナイダー培地でカバースリップを3回すすいで、STLCを洗い流します。
7. シュナイダー培地に加えて、薬理学的薬物(Auroraキナーゼ阻害剤など)またはDMSOをコントロールとしてカバースリップをインキュベートします
   注:阻害剤の濃度はさまざまであり、適切な最終濃度は実験者が決定する必要があります。ストック溶液は通常、阻害剤が培地に1:1,000に希釈されるように作られます。この場合、1:1,000 に希釈した DMSO (または適切な溶剤) が車両制御として機能します。Aurora B阻害剤Binucleine 2を最終濃度40 μMで使用します。
8. 細胞を異なる時点で固定して、双極性紡錘体形成の進行を観察し、動原体の付着状態を評価します。修正するには:
   1. カバースリップを2mlの1x BRB-80ですばやくすすぎます。
   2. 1x BRB-80で希釈した10%パラホルムアルデヒド2 mLを10分間加えて細胞を固定します。
   3. 2 mLの1x PBS + 1% Triton-Xで細胞を8分間透過処理します。
   4. スライドを2 mLの1x PBS + 0.1% Triton-Xで3回洗浄します。
   5. カバースリップをセル側を上にして、150mmのペトリ皿内のパラフィルムのシートに移します(スライドを追跡するために、マーカーを使用してパラフィルムに適切にラベルを付けます)。
   6. カバースリップを150 μlの煮沸ロバ血清(BDS)で覆い、RTで1時間インキュベートして非特異的抗体の結合をブロックします
      注:ここでは、固定プロトコルを停止して、後で続行することができます。カバーガラスは、4°Cのモイスチャーチャンバーに最大24時間保存できます。モイスチャーチャンバーを作るには、150mmのディッシュの縁にウェットラボラトリーワイプを敷き、ペトリディッシュの蓋で覆います。
   7. ブロックをはがし、BDSで適切に希釈した一次抗体150 μlとRTでカバースリップを1時間インキュベートし、動原体および微小管の最終濃度をそれぞれ2 μg/ml(またはメーカーの推奨による)および1 μg/mlまで染色します
      注:ここでは、固定プロトコルを停止して、後で続行することができます。カバーガラスは、4°Cのモイスチャーチャンバーに最大24時間保存できます。
   8. カバースリップを500 μlの1x PBS + 0.1% Triton-Xで3回洗浄します。
   9. カバースリップをRTで30〜60分間インキュベートし、BDSで希釈した適切な蛍光色素標識二次抗体とインキュベー
   トします。
   10. カバースリップを500 μlの1x PBS + 0.1% Triton-Xで3回洗浄します。
   11. カバースリップを、DAPI最終濃度1 μg/mlのBDS150 μlと5分間インキュベートします。
   12. カバースリップを1x PBS + 0.1% Triton-Xで2倍に洗浄し、セル側を下にして3x1インチスライドに8μlの封入剤をセットします。角をマニキュアでペイントして、カバースリップをスライドに固定します。
9. Eg5-mCherryを発現しているバイポーラスピンドルを持つ細胞を画像化します。100倍の対物レンズを使用して、すべてのチャンネルで0.2μm間隔で30の平面で構成されるZシリーズを取ります。動原体と微小管を慎重に分析して、付着状態(両配向またはシンテリック接着)を決定します。

結果

Klp61Fは、バイポーラスピンドルを形成するために必要です。ヒトキネシン-5(Eg5)は、ショウジョウバエS2細胞のKlp61Fの機能を救うことができます(図1AおよびD)。キネシン-5阻害剤(STLC)を添加すると、モーターの微小管関連レベルが低下し(図1BおよびE)、紡錘体が崩壊し、RNAiが成功すると内因性Klp61Fを欠損した細胞にモノポール(図1CおよびF)が生じます(補足動画1)。ヒト化S2細胞にSTLCを添加すると双極性紡錘体が崩壊することは注目に値します。これは、ヒト細胞の紡錘体双極性を維持するためにキネシン-5活性が必要ないためです。この興味深い不一致は、2つのモデルシステム¹⁴における極間微小管のオーバーラップおよび/または安定性の違いの結果である可能性がある。キネシン-5阻害(図2AおよびE)は、薬物を洗い流すことで元に戻すことができ、バイポーラ紡錘体の回復を経時的に追跡することができます。阻害剤を除去すると(図2BおよびF)、バイポーラ紡錘体が集合するとEg5-mCherryが微小管に再結合し(図2CおよびG)、細胞はバイポーラ後期に進行することができます(図2DおよびH、補足動画2)。

図 1.1 μM STLCを添加すると、ショウジョウバエS2細胞のモノポーラスピンドルが得られます。1 μM STLCを添加した際にEg5-mCherry(A-C)とGFP-α-tubulin(D-F)を発現するショウジョウバエS2細胞のタイムラプスイメージングからの代表的な画像。Eg5阻害剤を3分で添加しました。スケールバー = 5 μm. タイムスタンプ = 分:秒 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図 2.バイポーラスピンドルは、STLCの除去時に再形成されます。STLCウォッシュアウト実験中にEg5-mCherry(A-D)とGFP-α-tubulin(E-H)を発現するショウジョウバエ2細胞のタイムラプスイメージングからの代表的な画像。STLCは5分で洗い流されました。バイポーラスピンドルは、STLCを取り外してから1時間以内に再形成されます。スケールバー = 5 μm. タイムスタンプ: min:sec. この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

補足ムービー 1.(右クリックしてダウンロードします)。Eg5-mCherryを発現するショウジョウバエS2細胞(左)とGFP-α-tubulin(右)を発現する細胞の代表例の広視野蛍光イメージング。1 μM STLCを2分後に添加し、阻害剤の添加後10分以内にスピンドルがモノポールを形成します。画像は1分ごとに取得され、1秒あたり10フレームの速度で再生されました。スケールバー = 5 μm。

補足ムービー2。(右クリックしてダウンロードします)。Eg5-mCherryを発現するショウジョウバエS2細胞(左)とGFP-α-tubulin(右)を発現する細胞の代表例の広視野蛍光イメージング。1 μM STLC を含む培地を取り出し、5 分ですすぎました。バイポーラスピンドルは、阻害剤を除去してから1時間以内に再形成されます。画像は1分ごとに取得され、1秒あたり10フレームの速度で再生されました。スケールバー = 5 μm。

ディスカッション

エラー訂正の視覚化は、この重要で複雑な細胞プロセスに関連するステップを研究するための貴重な手法です。そのために、可逆的な阻害剤を使用して誤った付着が生成され、薬物のウォッシュアウト時にエラー修正が観察されます。このアッセイはもともと哺乳類組織培養細胞⁵を使用して開発されました。しかし、多くのモデル哺乳類細胞型に多数の動原体が存在するため、個々の誤り訂正イベントを観察する上で課題が生じます。 ショウジョウバエ S2細胞は動原体をわずか4対しか持たないため、誤り訂正を観察するためのより好ましい細胞株です。ただし、大きな欠点は、多くの阻害剤が ショウジョウバエ S2細胞では効果がないことです。したがって、ヒトキネシン-5を発現するヒト化 ショウジョウバエ S2細胞株を生成する能力は、エラー訂正を研究するための貴重なツールを提供します。

ショウジョウバエS2細胞は、エラー訂正を研究するためのより良い細胞株になり得ますが、細胞株の取得と必須遺伝子のノックダウンに関連する複数のステップは、この技術にいくつかの課題をもたらします。たとえば、トランスフェクション効率は非常に低い場合があります。Eg5-mCherryを発現している細胞が20%未満の場合は、選択プロセスに時間がかかるため、トランスフェクションを繰り返す必要があります。また、両方の蛍光タンパク質を発現する細胞の割合は、時間の経過とともに減少する可能性があります。これは、ブラストチジンS HClおよびハイグロマイシンBの存在下で細胞を分割し、それぞれEg5-mCherryおよびGFP-α-チューブリンを発現する細胞を選択することによって克服できます。ショウジョウバエS2細胞は多くのヒトタンパク質とオルソログを持っていることに注意することも重要です。したがって、内因性タンパク質のノックダウン条件を最適化することが重要です。最適なノックダウン条件は、dsRNAの量と処理期間によって異なる場合があります。CRISPR-Cas9技術の出現と急速な改善を考慮すると^15-17、Klp61F遺伝子をヒトEg5に置き換えたショウジョウバエ細胞株の生成は、トランスフェクションとノックダウンアプローチの限界を克服する強力な代替手段を提示します。私たちの研究は、ショウジョウバエS2細胞でそれを行うために必要な試薬が現在開発中ですが、この場合、ハエからヒトへの遺伝子置換が実行可能な選択肢であるべきであることを示しています。

この手順はEg5に限定されず、他の目的タンパク質の機能を研究するために適用できます。ショ ウジョウバエ S2細胞では効果がないことが以前に確立されている阻害剤を使用する場合、このプロトコルを変更して、オフターゲット効果を心配することなく、生細胞における阻害剤の直接効果を研究することができます。このプロトコルを使用して作製された細胞株は、エラー訂正に関与するタンパク質を標的とする潜在的な薬物を特定するためのハイスループットスクリーニング分析にも使用できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エフェクチントランスフェクション試薬	Qiagen	301425
Klp61F cDNA	ショウジョウバエ ゲノムリソースセンター	13690	遺伝子名 LD15641
Schneider's Media	Invitrogen	21720-024
ウシ胎児血清、認定	Invitrogen	10082-147	熱不活性化、米国原産
硫酸銅(II) (CuSO4)	Sigma	C8027-500G	500 mMストック
S-トリチル-L-システイン	シグマ	164739-5G	1 DMSO
Blasticidin HCl	Invitrogen	R21001	5 1x PBS
Hygromycin B	Invitrogen	10687010
T7 大規模 RNA 生産システム	Promega	P1320	の各反応からのおおよその dsRNA 濃度は約 5-15&;&マイクロ;g/µl
Klp61F RNAi F プライマー	Invitrogen		TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA
Klp61F RNAi R primer	Invitrogen		TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC
PCR クリーンアップキット	Mo Bio Laboratories, Inc	1250
Concanavalin A	Sigma	C5275	0.5 1x PBSに溶解して作製したmg/ml溶液。
Boiled Donkey	Serum Jackson ImmunoResearch Labs	017-000-121	1x PHEM緩衝液に5%ストック溶液を入れ、溶液を沸騰させます。4  に格納°C.
封入メディア			20 mMトリス pH 8.0, 0.5%N-プロピルガレート、90%グリセロール。4  に格納°C.
1x BRB-80			80 mM パイプ pH 6.9; 1 エグタ;1 mM MgCl2
>白色光源	Lumencor Inc
ET EGFP Filter Cube	Chroma	49002
DSRed Filter	Cube Chroma	49005
anti-NDC80 anti-NDC80 anti-body			Maresca Lab
DM1&alphaによるカスタムメイド。(抗-α;-チューブリン)	Sigma	T6199
抗 CID 抗体	AbCam	ab10887