Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

Summary

我々は、分子機械のその場構造で高解像度を決定するために、ハイスループット低温電子断層撮影法を利用する方法のプロトコルを提示します。プロトコルは、処理すべき大量のデータを可能にし、一般的なボトルネックを回避し、ユーザは、重要な生物学的問題に集中することができ、リソースのダウンタイムを減少させます。

Abstract

クライオ電子線トモグラフィー(Cryo-ET)は、高分子複合体を分子レベルでの本来の状況で視覚化するための強力な3次元(3D)イメージング技術です。この手法では、まず試料をガラス質の氷で急速に凍結して試料を本来の状態に保ち、次にさまざまな角度から高倍率で一連の顕微鏡写真を収集し、最後に3D密度マップを計算で再構築します。凍結水和した試料は電子ビームに非常に敏感であるため、放射線損傷を制限するために、非常に低い電子線量で顕微鏡写真が収集されます。その結果、生のクライオ断層撮影は、本質的にノイズの多い画像を特徴とする非常に低い信号対雑音比を示します。関心のある被写体をよりよく視覚化するために、従来の画像解析と、被験者のサブトモグラムを初期トモグラムから抽出し、位置合わせして平均化するサブトモグラム平均化を利用して、コントラストと解像度の両方を改善します。傾斜系列の大規模なデータセットは、さまざまな状態、条件、または突然変異の複合体を理解して解決し、平均化と分類に十分な大きさのサブトモグラムのコレクションを得るために不可欠です。このデータの収集と処理は、さらなる分析を妨げる大きな障害になる可能性があります。ここでは、コンピュータ制御の300kVクライオ電子顕微鏡、直接検出装置(DDD)カメラ、および自社開発の高効率な半自動画像処理パイプラインソフトウェアラッパーライブラリtomoautoをベースにしたハイスループットクライオETプロトコルについて紹介します。このプロトコールは、赤痢菌ミニセルにおける無傷のIII型分泌システム(T3SS)を可視化するために効果的に利用されています。クライオETに適したあらゆるプロジェクトに適用できます。

Introduction

III型分泌系（T3SS）多くのグラム陰性病原体に不可欠な病原性決定因子です。また、針複合体として知られているinjectisomeは、真核生物の宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質の直接転座^1、2に必要な中央T3SS機である。injectisomeが外針、基礎体温、また既知の細胞質複合体を含みますソート複雑な³など。以前の研究では、主要な基礎体タンパク質^4、5の原子構造とともに、 サルモネラ菌や赤痢菌から精製injectisomesの3次元構造を解明した。 サルモネラ 、 赤痢菌 、およびエルシニアからinjectisomesのその場構造の最近の -ETクライオ⁶によって明らかにされました^7。しかし、エフェクターの選択と針アセンブリのための本質的な細胞質複合体は、それらの構造において可視化されていません。

クライオETはモスです（ その場で ）その本来の細胞のコンテキスト内でナノメートルの分解能で分子機構を画像化するための適切な技術をtは。それにもかかわらず、クライオETによって達成可能な解像度は、試験片の厚さによって制限されます。欠点を克服するために、我々は遺伝的に凍結ETのために十分に薄いミニ細胞を産生するように改変された病原性

Protocol

1.ミニ細胞の準備

1. S.を作成するにはフレクスナーミニ細胞は、構成的にスペクチノマイシン耐性プラスミド5μlのエレクトロストレプトマイシン耐性血清型5aの（M90T-SM）、エレクトロポレーションによって細胞に低コピーから大腸菌細胞分裂遺伝子ftsQ、ftsA、とのFtsZを発現するプラスミドpBS58、1μlのを変換します1ミリメートルのキュベット中で5ミリ秒のために2.5 kVの時。
2. 1.5ミリリットル極低温マイクロチューブ中で15％グリセロール中で-80℃で保存するミニ細胞のサンプル。スペクチノマイシンとするとき使用するための準備ができて、ピペットチップを使用して解凍していないマイクロチューブからの細胞の約5μLをこすりし、4ミリリットル中に細胞を懸濁トリプシン大豆ブロスを、100μg/ mlの濃度に加えました。 37℃でO / Nを成長させます。
3. ピペット再び100μg/ mlの濃度になるように追加されたスペクチノマイシンと1.2 200ミリリットルにトリプシン大豆ブロスからの培養の2ミリリットル。後期対数期に37℃で成長します。
4. ミニセル、遠心分離機を豊かにします5分1,000×gで1.3からの培養の200ミリリットル。慎重に10分間20,000×gで新しい遠心チューブと遠心分離機に上清画分を注ぎます。慎重にオフ注ぎ、上清画分を廃棄し、静かにピペットチップを使用して残りの液....

Results

ミニ細胞Sのサンプルフレクスナーを回収し、 図2に詳述され、パイプラインを使用して、次のtomoauto概略図を図1に示したように処理しました。 傾斜シリーズは、低倍率のモンタージュマップ上でユーザにより指定されたポイントでの高スループット傾斜シリーズ取得を可能SerialEM ^10（ 図3）を用いて収集しました。顕微鏡写真は、ビーム誘起運動^22（ 図4）を低減するために直接検出素子カメラに対する用量分画モードを使用して収集しました。 TomoautoはMOTIONCORR ^22、さらに（動画1）を処理することがチルトシリーズに結果を組み立てて、それぞれの処理用量分画した顕微鏡写真のコレクションを取って動き補正を調整します。

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Discussion

ここで説明するハイスループット法は、1917クライオチルトシリーズを処理し、そのままSの 4,500を超えるサブ断層像を生成することができましたフレクスナー injectisome ^19は、収集されたデータは、複雑なソート細胞質を含め、 その場 injectisome での詳細な特性評価につながりました。この方法はまた、injectisomeの選別プラットフォームの組成を解明する助け推定上のタンパク質成分の特定の欠失を有するいくつかの変異体細胞を可視化するために利用されました。我々の方法はinjectisomeの構造 - 機能関係を研究するための新しい手段を提供しました。その結果、新たなステージをT3SS媒介分泌および病原性のメカニズムのさらなる解剖のために設定しました。

ここで紹介するプロトコルは、完全なSの高スループットクライオ-ETを説明フレクスナー、しかし凍結ETに適した任意のプロジェクトに適用可能です。この方法は、struct.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
グリセロール	Sigma-Aldrich	G9012
チロプチン酸醤油	Sigma-Aldrich	22092
スペクチノマイシン	Sigma-Aldrich	S0692
エレクトロポレーション装置	Bio-rad	165-2100
1 mm Cuvette	BTX	45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube	Thermoscientific	5000-1020
1.5 ml 微量遠心分離機 チューブ	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device	In-House		Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016	自社製グロー放電装置に使用
高周波発生器	電機	BD-10A	注意: このデバイスは高電圧を生成します。
遠心分離
機鉗子	Dumont (Electron Microscopy Sciences)	72705-D	スタイル 5 反磁性
コリオダル金	Aurion		BSA 10nm
濾紙	Whatman		#2
Ethane	Matheson Tri-Gas	UN1035
窒素	Matheson Tri-Gas	UN1977
プランジャー装置	社内		商用 代替
利用可能な 極低温グリッド 収納ボックス	電子顕微鏡 科学	71166-30
透過型 電子顕微鏡	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
直接検出装置カメラ	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM 代替品UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software	が必要IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD 代替ソフト:XMIPP、Protomo
自動基準マーカーモデリングソフト	IMOD		の代替品:RAPTOR (IMOD0 に付属(tomoautoで使用可能)
CTF判定ソフト	IMOD		の代替品:CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (tomoautoで使用可能)
チルトシリーズ再構成ソフトウェア	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d 代替ソフト:IMOD、XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es、Protomo
チルトシリーズ自動処理ソフト	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
パーティクルピッキングソフト	i3		http://www.electrontomography.org 代替品:IMOD
サブボリューム平均化ソフトウェア	i3		の代替品: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET、Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch、PyTom http://pytom.org