亜硝酸塩の催奇形性を評価するためのモデルとしてのゼブラフィッシュ

サマリー

催奇形への曝露は、先天性欠損症を引き起こす可能性があります。ゼブラフィッシュは、化学物質の催奇形性を決定するのに有用です。私たちは、亜硝酸塩のも露出の異なる時点で様々なレベルに胚を暴露することによって、ゼブラフィッシュの有用性を実証しています。私たちは、亜硝酸塩は毒性があると重度の発達障害を引き起こす可能性があることを示しています。

要約

環境における高い硝酸塩濃度は、ヒトの先天性欠損または流産になることがあります。おそらく、これは腸および唾液細菌による亜硝酸塩への硝酸塩の転換によるものです。彼らは貧しい生殖成果につながることができますが、しかし、他の哺乳動物の研究では、高亜硝酸塩レベルは、先天性欠損症を引き起こすことはありません。このように、亜硝酸塩の催奇形性は明らかではありません。容易に亜硝酸塩または関心のある他の化学物質の催奇形性を評価するために、脊椎動物モデル系を有することが有用であろう。ここでは、毒性および胚の欠陥のための化合物をスクリーニングするためにゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）の有用性を実証しています。ゼブラフィッシュの胚は彼らに催奇形性研究のための良好なモデルを作り、外部から受精かつ急速な発展を持っています。我々は、亜硝酸塩への暴露の時間を増加させると負の生存に影響を与えることを示しています。硝酸塩がないのに対し、亜硝酸塩の濃度を増加させるとも悪影響、生存に影響を与えます。胚thaのためのトン亜硝酸塩曝露を生き残る、様々な欠陥が心膜と卵黄嚢の浮腫を含め、発生する可能性があり、膀胱noninflation、および頭蓋顔面奇形を泳ぎます。我々の結果は、ゼブラフィッシュは、亜硝酸塩の催奇形性を研究するための便利なシステムであることを示しています。このアプローチは、容易に初期の脊椎動物の発生に対する効果について他の化学物質を試験するために適合させることができます。

概要

催奇形性は重症例¹で恒久的な構造的および機能的な異常、発育遅延、または流産を引き起こすことによって、胚または胎児の正常な発育を妨害するプロセスです。これは、複数の方法²に胚発生を妨害する特定の天然薬剤（催奇形）によって引き起こされ得ます。ヒト胎児開発中に、このような放射線、感染性物質、有害金属、および有機化学物質などの一般的な催奇形は、形態形成のエラーを通じてエピカンスィクひだの欠陥（上眼瞼内の皮膚のひだ）と斜指症（曲がった指やつま先）を引き起こすことが報告されています^1。

奇形発生の分子機構を理解することは、治療と予防の開発に向けた最初のステップです。このようなアフリカのようないくつかの脊椎動物のモデルがteratによって影響を受ける分子経路を決定するために使用されているカエル（ アフリカツメガエル ）とゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）をツメガエルogens。以前の研究は疫学、毒性および催奇形性^3-7のモデルとしてゼブラフィッシュを使用してきました。ショルツら 。環境毒性評価のための「ゴールドスタンダード」としてゼブラフィッシュを検討しました。これは^、8を生じるよう、研究者が発達欠陥を可視化することを可能にするゼブラフィッシュ胚の透明性に一部、起因します。ヒト遺伝子の約70％は、人間の欠陥^9を

プロトコル

このプロトコルで説明する手順は、ペンシルベニア州のインディアナ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

1.ハーベスト胚

1. 28.5°C、pHは7、500〜1,500μSの間の導電率でゼブラフィッシュを維持し、14時間の光と10時間²⁴暗いの明/暗サイクル。このようなTú、ABまたはTU / ABハイブリッドなどの野生型株を使用してください。異なる株は、化学的処理²⁵に異なる反応を示すことがあります。
2. 交配タンクに魚系の水を加えて卵を採取する前に夜を嵌合するための魚を設定します。タンクにオスとメスの魚を追加し、分周器と二匹の魚を分離します。各魚のペアは、50〜300卵の範囲を生成します。十分な卵が生成される保証するために、魚の30ペアを設定します。一般的に、（6-9ヶ月齢）プライム交配年齢で魚のペアの約50％が200ペアごとに卵、最大3の最大値まで、その結果、卵を生産します、この実験のための000の卵。
3. 翌朝ランプが点灯した後に、交配を開始するための仕切りを取り外します。卵のために15分ごとに交配タンクを確認してください。
4. 魚が卵を産むたら、茶こしを使用して、すべての胚を収穫し、E3バッファー（5 mMの塩化ナトリウム、0.17のKCl、0.33mMの_CaCl 2を、0.33 mMの_MgSO 4）しを持....

結果

22時間、300 mMのエタノールへの曝露は、以前の報告^5,23,26と一致生存（データは示していない）には影響を及ぼしませんでした。エタノールが知られている催奇形物質であり、ポジティブコントロールとして役立ったように、これは、期待されています。観察された表現型は、心膜浮腫、スイム膀胱noninflation（ 図1）、頭蓋顔面欠損、及び発達遅延（データは示さず）を含んでいました。

亜硝酸塩での処理は、露光時間に応じて、生存に深刻な影響をマイルドになりました。例えば、94時間深刻な影響を受けた生存のための露光1,000 mg / Lでは、短い露光時間（ 図2）と比較します。

また、生存上の異なる亜硝酸塩濃度の効果を評価しました。胚は、200か.......

ディスカッション

ここで説明する方法は、亜硝酸塩と硝酸塩の催奇形性を評価する際にゼブラフィッシュの有用性を示します。他の脊椎動物と比較すると、ゼブラフィッシュは、高い繁殖力、体外受精、光学的透明性、および急速な発展を含む利点を有しています。 （このようなキャスパーゼブラフィッシュ³⁶など）の色素沈着を欠いている利用可能な変異体はまた、内臓の視認性を高めるのに役立ちます。生きた魚³⁷に分析を容易にするために、レポーター遺伝子を有するトランスジェニックゼブラフィッシュを生成することも容易です。ゼブラフィッシュのゲノムは人間と保存されているので、彼らの研究から得られた情報は、人間⁹の並進の結果につながることができます。この方法は、催奇形物質によって引き起こされる遺伝子の誤調節に関する追加情報を得るために、例えば、in situハイブリダイゼーションのような 、遺伝子発現分析に適用することができます。

エタノール曝露は、生存率を有意に影響しなかったが、それはミリアンペアを引き起こしました以前の報告^5,23,26

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DREL/2010 装置	Hach	26700-03
エタノール	Sigma-Aldrich	E7023
KIMAX ガラス ペトリ皿	VWR	89001-244
	Sigma-Aldrich	E10521
NitraVer 5 硝酸塩試薬	Hach	14034-46
NitriVer 3 亜硝酸塩試薬	Hach	14065-99
パラフィルム	フィッシャー・サイエンティフィック	3-374-10
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	158127
S6E 実体顕微鏡	ライカ	10446294
硝酸ナトリウム	フィッシャー・サイエンティフィ	S343
亜硝酸ナトリウム	フィッシャー・サイエンティフィ	S347
トランスファーピペット	ラボラトリー製品・販売	L320072
ガラスバイアル	フィッシャー・サイエンティフィック	03-338B

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