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方法論記事

パルスレーザー励起時の金ナノ粒子の統合フォト応答性リポソームとそのマイクロバブルキャビテーションの測定の合成

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DOI：

10.3791/53619

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2016年2月24日

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1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, 2Division of Physics, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 3NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine, Nanyang Technological University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、市販の材料で光応答性リポソームを統合し、金ナノ粒子のための簡単​​な製造方法を説明します。また、パルスレーザーの治療の際に合成されたリポソームのマイクロバブルキャビテーションプロセスを測定する方法を示しています。

要約

光応答性ナノ粒子(NP)は、薬物放出に対する空間的、時間的、および投与量の制御を提供する可能性のために、かなりの注目を集めています。しかし、関連する技術のほとんどはまだ開発過程にあり、クリニックでは調達できません。ここでは、市販の金NPと熱応答性リポソームを使用して、これらの光応答性NPを容易に製造する方法について説明します。カルセインは、熱/光刺激によるカプセル化効率と放出速度プロファイルを評価するためのモデル医薬品として使用されます。最後に、この光トリガー放出がマイクロバブルキャビテーションによって引き起こされる膜の破壊によるものであることを示します。これはハイドロフォンで測定できます。

概要

外部刺激を用いた薬物放出をトリガーする可能性が最大化された特異性と最小限の副作用で、spatial- temporal-および用量制御ファッションで薬物を送達するための魅力的な方法です。外因性の刺激応答システム（光、磁場、超音波、マイクロ波放射）の広い範囲の中で、光トリガ型プラットフォームは、診療所での非侵襲性、シンプルさと適応性に起因して、魅力的である。過去10年間に1広範な研究薬、3および自己組織porphysomeのnanovesiclesと結合したスマートポリマー、2光不安定性、ポリマーナノ粒子（NPS）で被覆された近赤外光を担当する金（Au）などのプラットフォーム技術、ナノケージのさまざまなを提供してきました。4しかし、 、これらの技術は、開発の前臨床段階にまだある、と開始および続きのプロセスに関与するパラメータの明確な理解と最適化が必要薬物放出をローリング。

このようなシステムを製造するための最も簡単かつ容易にアクセスできる方法の一つは、市場で広く入手可能であり、広範囲に前臨床、さらには臨床試験で研究されてきたどちらも熱感受性リポソーム5,6と金のNPを統合することです。近赤外活性化のAuナノ構造体（ 例えば、ナノケージ）と比較すると小さな動物またはヒトにおける局所送達のために使用される場合、それらのプラズモン波長でのAu NPの深部組織の活性化の限界にもかかわらず、このシステムは、依然として非常に有望です。 7光点弧のリリースのためにリポソームとのAuのNPを組み合わせることでいくつかの初期の努力があります。8月11日に 、それらのほとんどは材料の新規性に焦点を当てながら、アクセシビリティとスケーラビリティの問題に対処する必要があります。また、これらのナノキャリアを使用して、放出機構に関する報告はまだ限られています。

ここで、光応答性の製作同時に薬物や親水性のAuのNPが装填されたリポソームは、記載されています。カルセインは、カプセル化効率及びシステムの放出プロフィールを評価するために、モデル化合物として使用されます。また、このシステムでは、金のNPによって吸収された光は、局所的な温度の上昇をもたらす、熱の形で周囲の微小環境に消散します。空気の微小気泡は、レーザー加熱時に生成されたリポソーム（ 図1）の機械的破壊を引き起こしています。マイクロバブルキャビテーションのメカニズムは、ハイドロホンの測定によって確認されます。

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プロトコル

1.準備

  1. 王水（濃硝酸（HNO 3）を1部、濃縮塩酸（HCl）の3部）を使用してクリーンな100mlの丸底フラスコに、DI水でフラスコを洗浄します。フラスコをオートクレーブし、15分間100℃の熱風オーブン中でそれらを乾燥させます。ラップし、使用するまで無菌フラスコを格納します。
  2. 70％エタノールを用いてハンドヘルドミニ押出機のセットを滅菌します。
  3. 回転蒸発器をオンにして、それぞれ37℃と4℃の湯浴と冷却塔の温度を設定します。
  4. 10 mlの0.1 mMのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.4）中のカルセインの374ミリグラムを溶解することによって原液をカルセイン60mMのを準備します。 1 M水酸化ナトリウム（NaOH）溶液を用いてpHを7.4に調整します。

リポソームの2.合成

  1. 脂質を除去（1,2- Dipalmitoyl- のsn -glycero-3ホスホコリン（DPPC）、1-パルミトイル-2-ヒドロキシSN -glycero-3-phosphochoライン（MPPC）及び1、2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanol -アミンN - [カルボキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（アンモニウム塩）（DSPE-PEG2000））冷凍庫から（-20°C）そしてRTにそれらを解凍。
  2. 15.9 mgのDPPC、1.3 mgのMPPC、および2.8 mgのDSPE-PEG2000を秤量します。 2ミリリットルのクロロホルムにそれらを一緒に溶かします。
  3. 滅菌した丸底フラスコにクロロホルム溶液を移し、薄い、乾燥した脂質層を形成するために、減圧下でロータリーエバポレーターを用いて溶媒を蒸発させます。
  4. 2ミリリットルでステップ1.4および50μlの金のNP（3.36×10 16粒子/ ml）で調製した1.95ミリリットルの60mMカルセインを含む30分間の水溶液を45℃での脂質層を水和。
  5. 45°Cに加熱ブロックを予熱。フィルタ支持体間200nmのポリカーボネートメンブレンフィルターを置き、ミニ押出機のセットを組み立てます。 DI水との潜在的な漏れをチェックします。
  6. ステップ2.4​​とextruからリポソーム溶液1ミリリットルと注射器のいずれかを記入組み立てミニ押出機のもう一方の端にシリンジに溶液を通過させることにより、サンプルド。 11回繰り返します。
  7. 製造業者のプロトコルに従って溶離液としてPBSを使用して自由にAuのNP、脂質およびカルセインを除去するために、PD-10脱塩カラムを経て合成リポソームを実行します。
  8. 4℃で滅菌チューブ内のサンプルを保管し、2日後に使用します。

ヒーターを有するリポソームから3カルセインリリース

  1. ステップ2.2でDPPC、MPPC、およびDSPE-PEG2000のモル濃度を追加することにより、原液の脂質モル濃度を計算します。 0.1 mMのPBS緩衝液（pH7.4）を使用して、5 mMの脂質濃度にリポソーム原液を希釈します。遠心管（2ミリリットル）にサンプルを転送します。
  2. 湯浴中でチューブを置き、25から70℃まで徐々に温度を上昇させます。ここでは1℃/分の速度で温度を上げます。
  3. 異なる温度点（27、32、37、39、41でアリコート（10μl）を収集し、43、45、52、57、62、67及び70℃）。
  4. RTで10分間リポソームを消化し、カルセインの完全な放出を達成するためにリポソーム溶液の2％トリトンX-100〜2ミリリットルのアリコート10μlのを追加します。
  5. 96ウェルマイクロプレートの各ウェルにリポソーム溶液200μlを移し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて収集されたサンプルの蛍光強度を測定します。カルセインの励起および発光波長は、それぞれ480および515 nmです。
  6. 100％放出としてトリトンX-100処理されたサンプルの蛍光強度を取って、数式を使用して、各時点で放出されたカルセインの割合を計算します。
    figure-protocol-1
    FTは、所与の時点での溶液の蛍光強度です。 F iとF xは、それぞれ溶液の正規化された最初と最後の蛍光強度です。

4.カルセイン再パルスレーザーを用いたリポソームからリース

  1. 石英キュベットに100μlのリポソーム溶液を移し、キュベットホルダーに入れてください。光源として波長532nmでの6ナノ秒のパルス持続時間を持つ：YAGレーザーパルスのNdを使用してください。次のレーザーパラメータを使用してください - 繰り返しレート：1 Hzの。レーザーエネルギー密度：1ミリジュール/ cm 2で、ビーム径0.5 mmです。
  2. 光はリポソーム溶液を通過するように、キュベットを介して平行レーザビームを案内し、様々なパルスの後に一定分量を収集します。
  3. RTで10分間リポソームを消化し、カルセインの完全な放出を達成するためにリポソーム溶液の2％トリトンX-100〜2ミリリットルのアリコート10μlのを追加します。
  4. カルセインを考慮すると、光に敏感であり、レーザー実験中に漂白することができ、リポソームのリリースからデータを正規化するために、カルセイン液にパルスレーザーの漂白効果を事前に測定します。
    1. 具体的には、カルセイン溶液（60 mM）のパルスレーザのwiへを公開パルス数（0、25、50および100）を変化させるための1ヘルツの番目の周波数。前とレーザー露光した後、それぞれ480および515 nmでの励起および発光波長のカルセインの蛍光強度を測定します。
    2. 漂白の量（レーザー露光/特定のパルス数の後にカルセインの蛍光強度の前にカルセインの蛍光強度）を計算します。因子を有するリポソームの蛍光強度を乗算することにより、リポソーム試料から得られた値を正規化するためにこの係数を使用。
  5. それぞれ480および515 nmでの励起および発光波長で蛍光マイクロプレートリーダーを使用して採取された試料の蛍光強度を測定します。
  6. 100％放出としてトリトンX-100で処理した試料の蛍光強度を取って、それぞれのパルス数で放出カルセインの割合を計算し、式を用いて。
    figure-protocol-2
    Ftが正規化後の所定のパルス数での溶液の蛍光強度です。 F iとF xは、それぞれ溶液の正規化された最初と最後の蛍光強度です。

圧力インパルスの5測定

  1. 顕微鏡スライド上に100μlの試料を置き、サンプルにレーザの焦点を設定します。
  2. 溶液中に針ハイドロホン（直径1mmおよび450はnV / Paの感度）を浸し。
    注意：ハイドロホンは、損傷を避けるために、レーザー光を照射することはできません。
  3. 様々なパルス数（0-100）とパルスエネルギー（20から160μJ/パルス）でパルスレーザーを試料に照射します。
  4. デジタルオシロスコープを使用して圧力信号を記録します。

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結果

10：4または7.95：リポソームは86のモル比でDPPC、MPPCおよびDSPE-PEG2000を有する従来の薄膜水和法を用いて調製した0.65：1.39 mg / mlで12のAu NPのサイズは、光を決定することが重要です以下のレーザー励起実験中の変換効率を加熱します。金NPのサイズ、より高いが、変換効率である。13したがって5nmの金のNP小さく、ベンダーからの最小のサンプルは、カプセル化のために選択しました。合成の間、金のNPおよびカルセインを含む水和培地は、その後自由にAuのNPとカルセインを除去するためにサイズの押出およびゲルろ過クロマトグラフィーに供したマルチラメラ小胞を、生成するために追加されました。

カルセインは、親水性の蛍光色素が60 mMの濃度でリポソームの水性コア内にカプセル化されています。 Cのような高濃度では、蛍光自己クエンチをalcein。それは、リポソームから放出されるが、...

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ディスカッション

薄膜水和は、リポソームを調製するための従来の方法です。有機溶媒（この場合はクロロホルム）まず、脂質を溶解するために使用し、次いでフラスコに脂質薄膜を生成するために、37℃でロータリーエバポレーターで除去しました。この脂質膜は、60mMのカルセインと5nmの金のNPを含有する水溶液で水和しました。水和プロセスの間、温度を約50℃に維持し、フラスコを常にフラスコを回転させて撹拌しました。この段階で鍵が蒸発し、水和がそれぞれ行われた時に温度の選択です。 DPPCリポソームの主成分の相転移温度（T m）は、41°Cです。脂質の形成時にフィルム、温度は乾燥した脂質の凝集した塊の形成を防止するために、41℃以下であるべきだと思います。水和中、T mより高い温度は、リン脂質を駆動するために選択されました球状​​の多層構造に自己集合します。薄膜水和法を実行するのは簡単であるが、それは、水溶液中のカルセイン及びAu NPの乏しいカプセル化効率（<1％）によって制限されます。将来的には、カプセル化は、凍結融解サイクルにより改善される可能性があります。

...

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開示事項

利害の競合が宣言されていません。

謝辞

この作品は、部分的に教育のシンガポール省（CXへRG 12分の64）とナノメディシンのNTU-北西部研究所がティア1学術研究資金によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)850355PPowder, Store at -20 °C
1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (MPPC)Avanti Polar Lipids (アラバマ州、米国)855675P粉末、-20°Cで保存;C
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノール-アミン-<>N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩)(DSPE-PEG2000)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)880120PPowder, Store at -20 °C
金ナノ粒子シグマアルドリッチ752568-100mL5 nm粒子、0.1 で安定化;mM PBS
カルセインシグマ アルドリッチC0875-10g60 mM, pH 7.4 (NaOHで調整)
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Sigma AldrichP54930.1 mM, pH 7.4
二度蒸留水ミリポア Milli-DI浄水システム
Triton X100  シグマ、ライフサイエンスX-100リポソームを破壊して総カプセル化
を計算する ロタバポラポロ  Buchi(スイス)R 210リポソスメ調製に使用
ヒーティングバスBuchi(スイス)B 491リポソスメ調製に使用
真空コントローラー  Buchi(スイス)V-850Lipososme調製に使用
真空ポンプBuchi(スイス)V-700Lipososme調製に使用
温度調節器付き再循環槽PolyscienceLipososme調製に使用
加熱ブロック付きミニ押出機アセンブリ Avanti Polar Lipids (アラバマ州、米国)610000リポソームの押出成形に使用
シリンジ、1,000 μlAvanti Polar Lipids(アラバマ州、米国)610017リポソームの押出に使用
ポリカーボネートフィルターメンブレン、200 nmWhatmann800281リポソームの押出に使用
フィルターサポート AvantiPolar Lipids(アラバマ州、米国)610014リポソームの押出に使用
PD 10 脱塩クーラム、Sephadex G-25 中GEヘルスケア、ライフサイエンス17-0851-01リポソームの精製に使用
遠心分離機  Sigma Laboratory Centrifuges3K30リポソーム溶液の濃縮に使用 
ローターシグマ19777-Hリポソーム溶液の濃縮に使用 
ゼータサイザー  ナノZSマルバーンリポソームサイズとゼータ電位の測定に使用
紫外可視分光光度計島津製作所 UV-2450サンプルの吸光度を測定するために使用
蛍光分光蛍光光度計  Molecular DevicesSpectraMax M5サンプルの蛍光発光を測定するために使用されます
Nd:YAG レーザーNewWave Research532 nm;最大電力:17 mJ;幅:406 NSCの;サンプル照射
HNRハイドロフォンONDAHNR-10001 mm、感度450 nV / Paに使用、適切な動作周波数範囲:0.25-10 メガヘルツ;キャリブレーション:50 mV/バー;音響信号の測定に使用
デジタルオシロスコープLECORY - Wave Runner 64Xi-A周波数:600MHz;最大サンプルレート:10 Gs/sec (2チャンネル時)測定された音響信号を記録するために使用されます
直径

参考文献

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