DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

サマリー

我々は、高スループットシーケンシング（DamID-SEQ）に、DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ識別（DamID）を結合することにより、本明細書のアッセイを説明します。この改良された方法は、より高い解像度、より広いダイナミックレンジを提供し、可能にする等のChIP-seqの、RNA-配列などの他のハイスループットシークエンシングデータと併せてDamID、配列データを分析します

要約

DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ同定(DamID)アッセイは、局所的およびゲノム全体の両方でタンパク質-DNA相互作用を検出する強力な方法です。これは、クロマチン免疫沈降(ChIP)の代替アプローチです。目的のタンパク質と大腸菌DNAアデニンメチルトランスフェラーゼからなる発現融合タンパク質は、タンパク質-DNA相互作用の部位近くのGATCモチーフのアデニン塩基をメチル化できます。その後、アデニンメチル化DNA断片を特異的に増幅して検出することができます。オリジナルのDamIDアッセイは、DNAマイクロアレイへのハイブリダイゼーションにより、メチル化DNA断片のゲノム位置を検出しますが、これはマイクロアレイの利用可能性と所定のプローブの密度によって制限されます。本稿では、ハイスループットDNAシーケンシングをDamID(DamID-seq)に統合するための詳細なプロトコールについて報告します。DamID-seqから生成される多数のショートリードにより、ゲノム全体のタンパク質-DNA相互作用を高精度かつ高感度に検出および局在化することができます。私たちは、DamID-seqアッセイを使用して哺乳類細胞のゲノム-核ラミナ(NL)相互作用を研究し、DamID-seqがゲノム-NL相互作用の検出に高い分解能と広いダイナミックレンジを提供することに気づきました。DamID-seqアプローチでは、遺伝子構造内のNL関連を精査し、ゲノム-NL相互作用マップをChIP-seqやRNA-seqなどの他の機能ゲノムデータと比較することができます。

概要

DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ識別^{（DamID）1,2 は 、in vivoでの}タンパク質-DNA相互作用を検出するための方法であり、クロマチン免疫沈降（チップ^）3の代替的なアプローチです。それは、細胞の比較的少量を使用して、DNAまたは高度に特異的な抗体を用いてタンパク質の化学的架橋を必要としません。標的タンパク質が緩くまたは間接的にDNAと関連している場合、後者は特に便利です。 DamIDが正常核膜タンパク質^4-10、クロマチン関連タンパク質^11-13、クロマチン修飾酵素^14、転写因子および^15-18補因子とのRNAi機械¹⁹を含む種々のタンパク質の結合部位をマッピングするために使用されています。この方法は 、Sを含む複数の生物に適用可能ですセレビシエ ^13、S。ポンベ ^7、C。エレガンス ^9,17、D。ショウジョウバエ ^5,11,18、20、A。シロイヌナズナ ^21,22と同様に、マウスおよびヒト細胞株^{6,8,10,23,24。}

DamIDアッセイの開発は、内因性アデニンメチル化^2を欠く真核細胞におけるアデニンメチル化DNA断片の特異的検出に基づいていました。関心及びEの DNA結合タンパク質からなる発現された融合タンパク質、 大腸菌のDNAアデニンメチルトランスフェラーゼ（ダム）、ゲノム²中のタンパク質の結合部位に空間的に近接（最も重要な1キロバイト内およびおよそ5キロバイトまで）であるGATC配列中のアデニン塩基をメチル化することができます。修飾されたDNA断片は、特に関心^1,25,26のタンパク質のゲノム結合部位を検出するためのマイクロアレイにハイブリダイズし、増幅することができます。この元DamID方法は、マイクロアレイの可用性および所定のプローブの密度によって制限されていました。そこで我々は、高スループットシーケンシングを統合していますDamID ¹⁰へとDamID-seqのような方法を指定。 DamID-配列から生成された読み取り、短い多数のゲノムワイドタンパク質-DNA相互作用の正確な位置を可能にします。我々はDamID-seqはゲノム核ラミナ（NL）団体^{10を研究するための}マイクロアレイによってDamIDよりも高い解像度と広いダイナミックレンジを提供することがわかりました。この改良された方法は、遺伝子構造¹⁰内NL関連付けをプロービングでき、このようなチップ-seqの、そしてRNA-seqのような他のハイスループット配列決定データとの比較を容易にします。

ここで説明するDamID-seqのプロトコルでは、最初にマッピングゲノム-NL団体¹⁰のために開発されました。我々は、Eに 、マウスまたはヒトのラミンB1を係留することによって融合タンパク質を生成しました大腸菌のDNAアデニンメチルトランスフェラーゼとは、C2C12マウス（データは公開されません^）10とIMR90ヒト胎児肺線維芽細胞を筋芽細胞、3T3マウス胚線維芽細胞内のプロトコルをテストしました。このプロトコルでは、我々は、cで始まりますベクターonstructingおよび哺乳動物細胞²⁴にレンチウイルス感染によってダム係留融合タンパク質を発現します。次に、我々は、アデニンメチル化DNA断片を増幅し、他の生物に適用可能であるべきであるシーケンシングライブラリーを調製の詳細なプロトコルを記述します。

プロトコル

1.生成および融合タンパク質とフリーダムタンパク質の発現

1. DamIDベクターに目的のタンパク質を複製します。
   1. 製造業者のプロトコルに従って、所望の高忠実度DNAポリメラーゼおよび適切なプライマーを使用して、目的のタンパク質のcDNAの（POI）を増幅します。実験インサートの適切な増幅を確実にするために最適な増幅条件を決定します。
   2. アガロースゲルを実行し、製造業者のプロトコルに従ってゲル抽出キットによりPOIの増幅したcDNAを精製します。
   3. 製造業者のプロトコルに従って、BPクロナーゼIIを使用してpDONR201ベクターへのPOIのクローンのcDNA。
   4. POIを融合の所望の方向に応じて、製造業者のプロトコルに従って、LRクロナーゼIIを使用してpLGW-RFC1-V5-EcoDamデスティネーションベクターまたはpLGW-EcoDam-V5-RFC1デスティネーションベクター²⁷へのドナーベクターからPOIのcDNAのクローンを作成N末端または番目にEの E C末端大腸菌のDNAアデニンメチルトランスフェラーゼ^{（EcoDam）27。}
   5. クローニングされたcDNAは、インフレーム融合EcoDamに正しい順序と形式があり、配列決定により確認してください。
2. レンチウイルス株を生成します。
   1. レンチウイルス発現系を用いて、（pLGW-V5-EcoDamベクトル^27から ）ダム-V5-POIとV5-ダムを発現しているレンチウイルス株を生成します。製造業者のプロトコルに従って、前方のトランスフェクション手順を使用します。
      1. トランスフェクションのための製造業者のプロトコルに従って、レンチウイルス株を生成するために、293T細胞およびリポフェクションを使用してください。
      2. 0.45μmのPVDFフィルターの工程を含みます。
3. レンチウイルスを細胞に感染します。
   1. 感染（0日目）の前日に、抗生物質を含まない同じ増殖培地を用いて、6ウェル組織培養プレートにこの細胞型に適切な増殖培地中で培養した接着細胞を渡します感染の日に50％コンフルエンスを達成。 37℃のインキュベーター中で細胞を配置します。
   2. 感染症（1日目）の日に、解凍する37℃の水浴中でCの冷凍庫と場所-80からダム-V5-POIとV5-ダムレンチウイルス上清の両方の2クライオバイアルを取り外します。
      1. 細胞から増殖培地を取り出して、抗生物質を含まない新鮮な増殖培地0.5mlで置き換えます。
      2. （V5-ダムとダム-V5-POIとの2ウェルを有する2つのウェル）を各ウェルに解凍したレンチウイルスの1ミリリットルを追加します。負の対照となる残りの2つのウェル-これに抗生物質を含まない増殖培地の1ミリリットルを追加します。穏やかに混合し、37℃のインキュベーターO / Nに戻って配置する6ウェルプレートを横に振ります。
   3. 感染症（2日目）の翌日には、細胞からのウイルス懸濁物を除去し、抗生物質を含まない2ミリリットルの増殖培地と交換してください。バック48時間37℃のインキュベーター中で細胞を配置します。
4. gDNAを分離してください。
   1. 各ウェルドから吸引するメディア250μlの0.05％トリプシン-EDTAを用いて、タコ細胞。 2分間37℃でインキュベートします。
   2. 1.5mlの微小管に各ウェルから1ミリリットルの増殖培地とピペット細胞をプレートから細胞を洗浄。 RTで5分間、200×gで遠心分離して細胞をペレット化。
   3. 室温で2分間、200×gでペレット化し、500μlのPBSで細胞と遠心分離を洗ってください。
   4. 200μlのPBSでペレット化した細胞を再懸濁します。
   5. 製造業者のプロトコルに従って、血液および組織キットによってのgDNAを分離します。 200μlのBuffer AEで溶出のgDNAおよび分光光度計を用いてOD _{260を測定して}濃度を決定します。
      注：未感染またはモック感染細胞からのgDNAを陰性対照として単離することができます。長期保存のためのより高い濃度までのgDNAを沈殿させます。
      1. 100％エタノール3容量の3 M酢酸ナトリウム（pH5.5）の0.1容量を追加し、チューブを4~6回転倒混和します。
      2. -20°のCO / Nで保存します。
      3. 16,000 xでの遠心分離4℃で15分間、G。
      4. 注意深く上清を除去します。 4℃で5分間、16,000×gで70％（体積/体積）エタノール、遠心分離でペレットを洗浄します。
      5. 注意深くエタノールを除去し、室温で3分間空気乾燥したペレットを可能にします。
      6. /μlの約1μgのにT ₁₀ E _0.1（pHは7.5）でのgDNAを溶かします。各実験試料または陰性対照からプールのgDNAと濃度を測定。 -20℃で保存してください。

2.アデニンメチル化DNA断片を増幅

1. 唯一のアデニンメチル化GATCsをカットDpnIでダイジェストのgDNA。
   1. 2.5μgのgDNAを、1μlの10倍バッファー、0.5μlのDpnIの（20 U /μl）を氷上で反応を設定し、10μlの総体積に、H _{2 Oで}埋めます。そして2ワット（0.5μlの_H 2 OでDpnIのを置き換え、「なしをDpnI」）をDpnIことなく、1 -それぞれのgDNAサンプルについて、3つの反応を準備（「DpnIで」）をDpnI番目。
   2. 37℃でのダイジェストO / Nおよび80℃で20分間をDpnIを不活性化します。
2. DamIDアダプターを連結。
   1. DamIDアダプタを準備します。
      1. 100μMの最終濃度までH _{2 O}で2 DamIDアダプターオリゴ²⁴のそれぞれを再懸濁します。
      2. 、2 DamIDアダプターオリゴの等体積を組み合わせ混合し、密閉チューブに配置します。 90℃の水を満たしたビーカー内のラックと場所に座って、パラフィルムでチューブを密封。チューブのキャップ下の水位を保つが、オリゴミックスの表面の上（チューブに入る水を避けるため）。
      3. そうアダプタアニールをゆっくりと室温に水を低温にしてみましょう。
      4. -20℃でのアニールアダプタ（50μM）およびストアを等分。
   2. 氷上で反応を設定します。 2.1.2から各チューブに、6.2μlのH _{2 O}を追加し、2μlの10倍ライゲーション緩衝液、0.8μlの50μMDamID広告aptors（ 氷上で解凍 ）、および1μlのT4 DNAリガーゼ（5U /μL）。総容量は20μlです。チューブ「DpnIで「二つのうちの一つで、1μlのH _{2 O（「}なしリガーゼ」）とのリガーゼを置き換える各gDNAのサンプルが2つの負のコントロールがあることに注意してください- 。 "ノーをDpnI」と「無リガーゼを」。
   3. 16℃でライゲートO / N、10分間65℃でリガーゼを不活性化します。
3. 非メチル化GATCsが含まれている断片を破壊することをDpnIIでDNAを消化。
   1. 氷上で反応を設定します。 2.2.3から各チューブに、24μlの_H 2 O、5μlの10倍をDpnII緩衝液及び1μlのをDpnII（10 U /μl）を追加します。総容量は50μlです。
   2. 2〜3時間、37℃で消化し、20分間65℃でのDpnIIを不活性化します。
4. アデニンメチル化DNA断片を増幅します。
   1. 2.3.2から5μLをDpnII消化、5μと氷の上での反応を設定しますリットルの10×PCR緩衝液、12.5μlの5μMDamID PCRプライマー^24、4μlの10 mMのdNTPミックス、1μlの50×ポリメラーゼミックス22.5μlの_H 2 O総容量は50μlです。
   2. 次のように、PCRを実行します。68℃を10分間。 1分間94℃、5分間、65℃で、15分間68°C。 1分、1分、65℃、10分間、68°C、94°Cの4サイクル。 1分、1分、2分68℃65℃94℃の17サイクル。
   3. 1％アガロースゲル上の各反応から5μlのPCR産物を分析します。 PCR産物を0.2から2キロバイト（ 図2）までのスメアとして表示されます。 「いいえDpnIの "と"ノーリガーゼ」のコントロールはありません持っているか、明確に少ない増幅する必要があります。
   4. ステップ2.4​​.3の結果が良好であれば、実験サンプルと2つの負のコントロールごとに1つの反応のための2つまたは3つの反応で2.4.1-2.4.3の手順を繰り返します。
   5. 同じからのPCR産物をプールし、精製し製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたは固相可逆固定（SPRI）ビーズを用いた実験サンプル。 「何をDpnI」または「noリガーゼ」のコントロールを浄化しません。バッファーEBでDNAを溶出します。
   6. 周りには0.1μg/μL以上である必要があり、分光光度計を使用して、OD _{260を測定することにより、}精製されたDNAの濃度を測定します。各サンプルの10μgのDNAの最小値を収集します。 PCR精製キットを使用している場合は、1列にそれぞれ50μlのPCR産物を精製し、30μlのBuffer EBで溶出し、溶出液をプール。
5. 配列決定されることからDamID PCRプライマーを防止するためにをDpnIIでDNAを消化し ​​ます。
   1. 2.4.6から5μgの精製されたDNA、5μlの10倍をDpnII緩衝液、1μlのをDpnII（10 U /μl）を氷上で反応を設定し、全量50μlに、H _{2 Oで}埋めます。各サンプルのための2つまたは3つの反応を準備します。
   2. 2〜3時間、37℃でダイジェスト、20分間65℃をDpnIIを不活性化。
   3. 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズと同じサンプルからダイジェストをプールし、精製します。バッファーEBでDNAを溶出します。
   4. 周り0.06μgの/μL以上でなければならない精製されたDNAの濃度を測定します。各サンプルの6μgのDNAの最小値を収集します。 PCR精製キットを使用している場合は、各50μlを1列に消化精製し、30μlのBuffer EBで溶出し、溶出液をプール。

ハイスループットシーケンシング3.ライブラリの準備

1. DNA断片化
   1. 実験的に二本鎖DNA Fragmentaseの各新しいバッチのための適切な消化時間を決定します。酵素活性のような新しい実験を行う前にテストを繰り返し、時間の経過とともに低下することがあります。実際の断片化のために2.5.4からDNAを保存するには、以前のexperimeから2.4.6または余分なDNAから精製されたメチルPCR産物を使用この段階でNTS。
      1. 6μgのDNAとマスターミックス、12μlの10倍Fragmentaseバッファを設定し、114μlの総体積に、H _{2 Oで}埋めます。
      2. 渦3秒間Fragmentaseストックバイアル、マスターミックスに6μlを添加し、3秒のためのマスターミックスをボルテックス。総容積は120μlです。
      3. 小分け5新しい管のそれぞれにマスターミックス20μlの。 10分の増分で5〜55分間37℃で、すべての6のチューブをインキュベートします。反応を停止する5μlの0.5 M EDTAを追加します。
      4. 12.5μlの各反応の（0.5μgのDNAの）だけでなく、アガロースゲル（ 図3）の0.5μgの未消化のDNAを消化分析します。周り0.2キロバイトにスミアの大半を消化するために必要な最小限の時間（Tの_{0.2キロバイト）を}決定します。実際の断片化のために等しい増分で（5分およびT _{0.2キロバイト}を含む）5分とT _{0.2キロバイト}の間の6時間分を選択します。
   2. 実際fragmenを設定3.1.1.1-3.1.1.3に記載されているようテーション。 3.1.1.4で求めた時間分、37℃で反応をインキュベートします。
   3. プール6反応し、製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズとダイジェストを浄化します。 51μlのバッファーEBにDNAを溶出します。最終溶出液は、〜50μlのです。
2. 断片化したDNAの修復が終了
   1. 3.1.3からの溶出液、25μlのHと氷の上での反応を設定し₂ O、10μlの10 mMのATPと10倍のT4 DNAリガーゼ緩衝液、4μlの10mMのdNTPミックス、5μlのT4 DNAポリメラーゼ（3 U /μL） 、1μlのクレノウDNAポリメラーゼ（5U /μL）、および5μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼ。総容量は100μlです。ピペットでよく混ぜます。泡と泡を避けてください。
   2. 30分間20℃でインキュベートします。
   3. 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズにDNAを精製します。 33μlのバッファーEBにDNAを溶出します。最終溶出液は、32〜＆＃です181;リットル。
3. 「A」オーバーハングを追加
   1. 3.2.3からの溶出液と氷上での反応、5μlの10倍クレノウ緩衝液、10μlの1 mMののdNTP、および3μlのクレノウ（3 '→5'エキソ）（5 U /μl）を設定します。総容量は50μlです。ピペットでよく混ぜます。泡と泡を避けてください。
   2. 30分間37℃でインキュベートします。
   3. 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズにDNAを精製します。 22μlのバッファーEBにDNAを溶出します。最終溶出液は〜21μlです。
4. ライゲーションシークエンシングアダプター
   1. シークエンシングアダプター^{28を準備します。}
      1. 10mMのトリス塩酸（pHは7.8）、0.1mMのEDTA（pHは8.0）、50 mMのNaCl中の100μMの濃度に各アダプタオリゴを再懸濁します。
      2. ユニバーサルアダプタ²⁸とインデックス付きアダプタ²⁸の等量混ぜます。
      3. 以下でサーマルサイクラーにアダプターをアニールプログラム：95℃で2分間; 30秒、95℃で開始し、0.5℃、毎サイクルによって減少させるための140サイクル。 4℃で保持します。
      4. -20℃で小分けアダプタとストア。
   2. 3.4.1.4および2.5μlのT4 DNAリガーゼから（氷上で解凍）3.3.3からの溶出液と氷上での反応、25μlの2倍ライゲーション緩衝液、シークエンシングアダプターをアニール1.5μlの50μMを設定します。ピペットでよく混ぜます。泡と泡を避けてください。マルチプレックスシーケンシングが必要な場合は、各試料について異なるインデックス付きのアダプタを使用してください。
   3. 室温で1時間インキュベートします。
   4. 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズにDNAを精製します。 24μlのバッファーEBにDNAを溶出します。最終溶出液は〜23μlです。
5. Y字アダプタ正確DNA断片の大きさ^28を決定可能にするために二本鎖DNAに変換します
   1. 3.4.4からの溶出液を氷上で反応を設定し、12.5μlの_H 2 O、1μlの25μMのプライマー1 ^28、1μlの25μMのプライマー2 ^28、1.5μlの10mMのdNTPを、10μlの5X PCR緩衝液および1μlのDNAポリメラーゼ（1U /μl）を。
   2. 次のように、PCRを実行します。95℃を3分間; 15秒、30秒、63℃、30秒間72℃、98℃の5サイクル; 1分間72°C;保留4°C。
   3. 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズにDNAを精製します。 11μlのバッファーEBにDNAを溶出します。最終溶出液は、約10μlのです。
6. サイズは、ライブラリを選択
   1. 1×TAE緩衝液で2％アガロースゲルを準備します。溶融TAEアガロースソリューションは、エチジウムブロマイドの吸入を避けるために、冷却したときに500 ngの/ mlの最終濃度になるように臭化エチジウム（ 注意！）を追加します。すべてのサンプル、DNAラダーと空のレーンのための十分なレーンを持っていることを確認してください。
   2. 3.5.3からの溶出液に8μlの6×ローディング色素を追加します。
   <李> 1の割合で1キロバイトプラスDNAラダー（1.0μgの/μl）を、6Xローディング色素とH _{2 O}を混合することにより、DNAラダーを準備：1：4。
   3. 負荷6μlのDNAラダー、3.6.2からのサンプルと別の6μlのDNAラダー、それぞれ別々のレーンで、隣接するサンプル/はしごからの少なくとも1つの空のレーンを持ちます。
   4. 60分間、120Vでゲルを実行します。
   5. （紫外線への露出時間を最小限に抑える）UVトランスイルミネーター上でゲルを表示します。安全メガネ及びフェイスシールドを着用してください。 300 bpおよび400 bpのバンド間（3ゲルスライスを切り出すための十分な）適切な間隔とよく実行DNAラダーの少なくとも一つを確認してください。広い間隔を切り出したゲルスライスの体積が増加しながら、狭い間隔は、複数のゲルスライスを切り出しの困難を増加させます。
   6. 各レーンのための新しいメスやカミソリの刃を使用してください。消費税各レーンから300と400bpの間に3つの薄いゲル切片（ 図4）とマイクロ遠心チューブでそれらをそれぞれ配置します。各ゲルSのボリュームをキープできるだけ低いシラミ（<100μL）。
   7. 各ゲルスライスの量を測定する（1μlのゲルは、約1 mgの重さ）、QGバッファの6倍のボリュームを追加し、50℃でインキュベートします。
   8. ゲルスライスが完全に溶解するまでQG-ゲル混合物を2〜3分ごとにボルテックス。イソプロパノールの2倍ゲルボリュームを加え、混合します。
   9. この段階から、ゲル抽出キットからプロトコルに従ってください。 51μlのバッファーEBにDNAを溶出します。最終溶出液は、〜50μlのです。
7. シークエンシングアダプター修飾DNA断片を充実
   1. PCRサイクル²⁹の数を最適化します。
      1. 3.6.10から1μlの溶出液を、1μlの25μMのプライマー1 ^28、1μlの25μMのプライマー2 ^28、7μlのH ₂ Oおよび10μlのSYBRグリーンスーパーミックスと氷の上での反応を設定します。総容量は20μlです。
      2. 以下のように定量PCRを実行します。95℃を3分間; 30秒間95℃の20サイクル、30秒間63℃、730秒間2℃、プレート読み取り。
      3. qPCR分析ソフトウェアを用いてデータを分析し、製造業者のプロトコルを使用して、各サンプルの定量化サイクル（CQ）、または閾値サイクル（CT）を決定します。最終的なPCRサイクル数（N _PCR）としてはCq / CT≤14.最大Cqを（CQ _0）マイナス1（次に高い整数に切り上げ）を持つサンプルを続行します。
      4. 異なるサンプルは、PCRサイクルの同じ数を実行した後にほぼ等しい量に増幅されるように、DNAテンプレートの量を調整します。最高はCq（CQ _0）でサンプル8μlのテンプレートを使用して、以下の式で他のサンプルのテンプレート量を計算します。
         _第 I巻= 8×1.8 ^{Cqを_{私は 0を} -cq}
   2. 1μlの25μMのプライマー1 ^28、1μlの25μMのプライマー2 ^{28、1.5：3.7.1.4}から計算テンプレートボリュームと氷上でのPCR反応を設定しますμlの10 mMのdNTPを、10μlの5×バッファー、1μlのDNAポリメラーゼ（1 U /μL）と、総容量50μlに、H _{2 Oで}埋めます。
   3. 次のように、PCRを実行します。95℃を45秒間、 N _{PCRサイクル}は、15秒、30秒、63℃、30秒間72℃、98℃の（3.7.1.3で決定）。 1分間72°C;保留4°C。
   4. 2％アガロースゲル（ 図5A）に5μlのPCR産物を分析します。明確な「シングル」のバンドが増幅されたDNA断片が狭い長さの範囲内にあり、DNAライブラリーは、さらなる分析を受けることができることをことを示しています。
   5. 選択されたサンプルのための1つの反応を繰り返し、同じサンプルから増幅したDNAライブラリーをプール。
   6. 配列決定のため選択されたDNAライブラリーを精製します。
      1. プライマー/アダプターダイマーは3.7.4で表示されていない場合は、製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズとDNAライブラリーを精製します。 21μlのバッファーEBにDNAを溶出します。ザ・最終溶出液は〜20μLです。ユーザーのシーケンシング機能が溶出バッファー、最終容量などの具体的な手順がある場合は、それに応じてサンプルを調製します。
      2. プライマー/アダプターダイマーは、3.7.4にはっきりと見える場合は、次のようにライブラリを浄化します。
         1. 2％プレキャストアガロースゲル中の3.7.5からの負荷のDNAとDNAラダー。容積を低減するために3.7.6.1に記載または複数のウェルにロードすることができるように、サンプルを精製することができます。適切な電源システムでアガロースゲルを置きます。ゲルを15分間実行を許可します。
         2. 適切なトランスイルミネーターを用いて、各サンプルのクリーンメス/かみそりで所望の帯域をカットし、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにゲルスライスを配置します。
         3. 2つの変更で、製造業者のプロトコールに従ってゲル抽出キットを用いてDNAを分離：37℃のサーモミキサーでバッファQG-ゲル混合物をインキュベートし、30分間1,000rpmで、イソプロパノールの2倍ゲルボリュームを追加します。
8. シークエンシング施設に精製されたDNAライブラリーを提出してください。すべての施設のガイドラインに従ってください。
   注：バイオアナライザー（ 図5B）によって品質分析は、正確なサイズ範囲及びDNAライブラリーの濃度を決定するために、配列決定前に行うべきです。

結果

ダム-V5-LMNB1融合タンパク質は、免疫蛍光染色による内因性ラミンBタンパク質（ 図1）と共局在することが確認されました。

アデニンメチル化DNA断片の成功PCR増幅はDamID-seqのための重要なステップです。無または明らかに少ない増幅（ 図2）をもたらすはずである（リガーゼなしに、またはPCRの鋳型なし、DpnIのなし）ネガティブコントロールしながら2キロバイト-実験サンプルは0.2の汚れを増幅しなければなりません。

NGSライブラリの所望の挿入サイズは200から300塩基対でありながら、メチル化DNA断片を、0.2から2 kbの範囲内にあります。したがって、適切なサイズ範囲にメチルPCR産物を断片化することが不可欠です。それにもかかわらず、それは同時に...

ディスカッション

Damタグ付きタンパク質が内因性タンパク質の機能を保持しているかどうかは、DamID-seq実験の前に調べる必要があります。ダムタグ付き核膜タンパク質の細胞内局在は常に決定し、内因性タンパク質の局在と比較する必要があります。転写因子を研究するために、ダム融合タンパク質が遺伝子発現を調節する内因性タンパク質の機能を救済できるかどうかを調べることが提案されています。この機能試験は、内因性DNA結合タンパク質のノックアウト変異体が利用可能な生物で実行できます。ゲノム工学の進歩により、目的の内因性遺伝子をノックアウトできる可能性があるため、Damタグ付きDNA結合タンパク質の機能を培養哺乳類細胞で調試できます。

このプロトコルの重要なステップは、DpnII消化されたDamID PCR産物を約200 bpにフラグメント化することに成功することです。このステップは、増幅されたアデニンメチル化フラグメントをシーケンシングのために狭いサイズ範囲にレンダリングし、シーケンシングライブラリ内のDNAフラグメントの開始ヌクレオチドをランダム化するように設計されています。非効率的な断片化は、DNAフラグ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ViraPower レンチウイルス発現システム	ライフテクノロジー	K4950-00、K4960-00、K4970-00、K4975-00、K4980-00、K4985-00、K4990-00、K367-20、K370-20、K371-20
ゲートウェイ BP クロナーゼ II 酵素ミックス	ライフテクノロジー	11789-020
ゲートウェイ LR クロナーゼ II 酵素ミックス	ライフテクノロジー	ズ 11791-020
DNeasy 血液 &ティッシュキット (250)	QIAGEN	69506 または 69504
ゲートウェイ pDONR 201	Life Technologies	11798-014
293T細胞	American Type Culture Collection	CRL-11268
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Life Technologies	25300-054
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-065
ウシ胎児血清	Σ	F4135
トリス			ブランドは重要ではない
EDTA			ブランドは重要ではない
200 プルーフ EtOH			ブランドは重要ではない
イソプロパノール			ブランドは重要ではない
酢酸			は重要ではない
DpnI	New England Biolabs	R0176
バッファーDamIDアダプター「AdRt」および「AdRb」	統合DNAテクノロジー		配列;セルフライゲーションを防止するために5'または3'末端のリン酸化はありません。
T4 DNAリガーゼ	ロシュ ライフサイエンス	10481220001	バッファー
付属 DpnII	ニューイングランド・バイオラボ	R0543
付属 DamID PCRプライマー "AdR_PCR"	統合DNAテクノロジー		参考文献24で利用可能
デオキシヌクレオチド(dNTP)ソリューションセット	ニューイングランド・バイオラボ	N0446	dATP、dCTP、dGTP、dTTPの各100mM
アドバンテージ 2 ポリメラーゼミックス	Clontech	639201	バッファー
1Kb Plus DNA	Ladder Life Technologies	10787018	1.0 µg/µl
QIAquick PCR精製キット	QIAGEN	28104または28106
MinElute PCR精製キット	QIAGEN	28004または28006	溶出量が30μ未満の場合;l
SPRIビーズ/ Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63880	は、40 & micro未満の場合は、追加の混合とより多くの溶出時間を適用します。l 溶出バッファーは、
バッファー EB	QIAGEN	19086
NEBNext dsDNA Fragmentase	New England Biolabs	M0348	バッファー
T4 DNA リガーゼ反応バッファー	New England Biolabs	B0202
T4 DNA ポリメラーゼ	New England Biolabs	M0203
DNA ポリメラーゼ I、ラージ (クレノウ) フラグメント	ニューイングランド バイオラボ	M0210
T4 ポリヌレオチドキナーゼ	New England Biolabs	M0201
Klenow Fragment (3' → 5' exo-)	New England Biolabs	M0212	バッファ
シーケンシングアダプター	参考文献28
			3.4.3で使用。Quick Ligation Reaction Buffer および Quick T4 DNA Ligase
Sequencing Primer 1 and 2	Integrated DNA Technologies		Sequences available in ref. 28
KAPA HiFi PCR Kit	Kapa Biosystems	KK2101 または KK2102	KAPA HiFi DNA ポリメラーゼ、5x KAPA HiFi Fidelity Buffer および 10 mM dNTP mix
agarose	Sigma Aldrich	A4679
ethidium bromide	が付属していますSigma Aldrich	E1510-10ML	10 mg/ml
QIAquick ゲル抽出キット	QIAGEN	28704 または 28706
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories	1725121 または 1725122
分光光度計			のブランドは重要ではありません
0.45 μm PVDF フィルター			のブランドは重要ではない
25 ml の Seringe			ブランドは重要ではない
10 cm 組織培養プレートのブランドは			重要ではない
6 ウェル組織培養プレートのブランドは			重要ではない
S1000 Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories		qPCR
Vortex Mixer			ブランドは重要ではありません
Dry Block HeaterまたはThermomixer			ブランドは重要ではありません
Microcentrifuge			のブランドは重要ではありません
		電気泳動システムは	重要ではありません ブランドは重要ではありません
マグネットスタンド			SPRIビーズによるDNAの精製用。1.5〜2mlのチューブを保持する必要があります。ブランドは重要ではありません
UVトランスイルミネーター			ブランドは重要ではありません
E-ゲル電気泳動システム	Life Technologies	G6400、G6500、G6512ST