近赤外Photoimmunotherapy法を用いた混合3D文化からの選択的な細胞除去

サマリー

特定の細胞を他の細胞を傷つけずに除去することは、特に確立された組織において非常に困難ですが、組織工学の分野では細胞除去法が緊急に必要とされています。ここでは、近赤外光免疫療法(NIR-PIT)を用いて、混合3D細胞培養から特定の細胞を除去する方法を紹介します。

要約

最近の組織工学の発展は、多くの疾患に対する革新的な解決策を提供します。例えば、再生医療における新たな手法として、人工多能性幹細胞(iPS)を用いた組織工学が浮上しました。この組織再生は有望ですが、組織培養中の不要な細胞による汚染が大きな懸念事項です。また、移植後の腫瘍原性については安全性に懸念があります。したがって、特に確立された組織において、保護が必要な他の細胞を損傷することなく、特定の細胞を排除することが急務です。ここでは、近赤外光免疫療法(NIR-PIT)を用いたin vitro混合3D細胞培養から、非標的細胞にダメージを与えることなく特異的な細胞を除去する方法を紹介します。この技術により、混合細胞培養または組織から特定の細胞を除去できます。

概要

他の細胞に損傷を与えることなく、特定の細胞を除去することは、特に確立された組織に、非常に困難であり、組織工学の分野における細胞除去方法に対する緊急の必要性があります。 ^{3 -}最近再生医療の分野では、胚性幹細胞（ES）、多能性幹細胞（のPSC）、または誘導多能性幹細胞（IPS）を使用して、組織培養、材料^1が期待されています。

この組織再生が有望であるが、望ましくない細胞による汚染が主要な関心事です。また、移植^4,5後の腫瘍形成能の安全性の懸念があります。多くの研究は、これらの問題に焦点を当ててきたが、特に再生医療⁶で、特定の細胞を排除するために^{- 8、}実用的な方法が開発されていません。

近赤外photoimmunotherapy（NIR-PIT）は、抗体の光吸収conjugatに基づく治療法ですE（APC）。 APCは、細胞特異的なモノクローナル抗体（mAb）と光吸収、IR700で構成されています。 IR700は、親水性シリカ、フタロシアニン誘導体であり、それ自体⁹によって光毒性を誘発しません。 IR700は、共有リジン分子の側鎖のアミド残基を介して抗体に結合されます。 APCは、細胞膜上の標的分子に結合し、その後、690 nmの近赤外光への曝露後に....

プロトコル

注：以下のプロトコルは、NIR-PITを使用して、特定の細胞を排除するために必要な手順を説明します。コントロールとNIR-PITと細胞生存率に関するその他の詳細は、別の場所で¹⁸見つけることができます。

モノクローナル抗体にIR700の1コンジュゲートモノクローナル抗体（mAb）

1. 0.1 MのNa ₂ HPO _4（pHは8.6）溶液中の2-5 mg / mlとに関心のmAbを準備します。
2. マイクロ遠心チューブ中の0.1MのNa ₂ HPO ₄溶液（pHは8.6）中の10mM IR700の30.8ナノモルとmAbの6.8ナノモルを混合し、アルミ箔で覆われて1時間、室温でインキュベートします。
3. 二回、15ミリリットルのPBSでPD-10カラム（材料/機器の表を参照）を洗浄します。ステップ1.2からサンプルをロードします。
4. 製造業者の指示に従ってPBS溶出により、PD-10カラムを介して混合物を精製します。
   注：ここでは、溶出はIR700のバンド色に沿っていました。 300μlのサンプルについて、PBS溶出画分4.4 mlを典型的には2.5〜mlです。
5. 決定します分光光度計⁹で595nmの吸収を測定することによりクマシー染色でタンパク質濃度。各mAb分子⁹にコンジュゲ....

結果

光学NIR-PITの効果を監視するには、EGFRを過剰発現するA431細胞株は、遺伝的にもGFPおよびルシフェラーゼ（A431-LUC-GFP）を発現するように変更されました。 NIR-PITの非標的として、のBalb / 3T3細胞株を光学的にRFP（3T3-RFP）を発現するように改変しました。 APC、パニツムマブ-IR700（パン-IR700）を合成しました。細胞（A431-LUC-GFPおよび3T3-RFP）の種々の比率で構成された混合スフェロイドは、このプロトコル（ 図1）に従って作製しました。繰り返しNIR-PITがpan-IR700（ 図2A中のレジメンを参照）のインキュベーションを行いました。この混合3D培養からの標的細胞の除去を達成し、蛍光およびルシフェラーゼ活性（ 図2B、C）でモニターしました。一方、非標的細胞は、成長し続けました。

ディスカッション

我々は、NIR-PITを用いて、非標的細胞に損傷を与えることなく、混合三次元細胞培養物から特定の細胞除去の方法を示します。これまでのところ、実用的な細胞除去の方法組織が確立されるか、移植後はありません。したがって、NIR-PITは、これを達成するための有望な方法です。 APCはモノクローナル抗体自体と同様の薬物動態を示すので、この技術は、 インビボ ^18,22 に利用することができます。標的細胞型は、種々のAPCで適合させることができます。 ^{21 -}抗EGFR、抗PSMA抗メソテリン、および抗CEAを含む様々な抗体または抗体フラグメントは、既にAPCを¹⁵としました。また、NIR照射領域を変更すると、処理された領域を最小限に抑えることができます。ここでは、標的細胞のルシフェラーゼ活性の定量化と蛍光と、特定の細胞の完全な消失を確認しました。

NIR-PITは、このように臨界点がtである、光ベースの治療法であります光エネルギーと逆二乗法則に従っ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
IRDye 700DX Ester Infrared Dye	LI-COR Bioscience (米国ネブラスカ州リンカーン)	929-70011
Na2HPO4	>SIGMA-ALDRICH (米国ミズーリ州セントルイス	S9763
Sephadex G25 カラム (PD-10)	GE Healthcare (米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)	17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay	Thermo Fisher Scientific Inc (米国マサチューセッツ州ウォルサム)	PI-23200
Perfecta3D 96-Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix Inc (米国ミシガン州アナーバー)	HDP1096-8
光パワーメーター	Thorlabs (米国ニュートン州ニュートン)	PM100
LED: L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix (パニツムマブ)	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mmガラス底皿、皿サイズ35 mm、井戸サイズ10 mm	Cellvis (米国カリフォルニア州マウンテンビュー)	D35-10-0-N

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