方法論記事

酵素消化および勾配分離を使用したマウス皮膚から浸潤白血球の単離

DOI：

10.3791/53638

⸱

2016年1月25日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、栄養豊富な培地でのマウス皮膚の酵素的消化と、それに続く白血球を分離するための勾配分離について説明しています。 このようにして得られた細胞は、多様なダウンストリームアプリケーションに使用できます。これは、組織解離機やより過酷なトリプシンおよびディスパーゼベースの組織消化プロトコルに代わる、効果的で経済的、改良された代替品です。

要約

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マウスの皮膚を単一細胞懸濁液に解離させることは、皮膚炎症のげっ歯類モデルにおける浸潤免疫細胞の特性評価など、下流の細胞分析に不可欠です。ここでは、コラゲナーゼDを含む栄養豊富な溶液でマウスの皮膚を消化し、続いて不連続な密度勾配を使用して造血細胞を分離するためのプロトコルについて説明します。このようにして得られた細胞は、in vitro研究、in vivo導入、およびフローサイトメトリーを含むその他の下流の細胞および分子分析に使用できます。このプロトコールは、高価な機械的解離剤、特殊な分離カラム、およびより過酷なトリプシンおよびディスパーゼベースの消化法に代わる効果的で経済的な代替手段であり、表現型の特性評価や細胞機能に関連する表面タンパク質の細胞生存率や密度を損なう可能性があります。ここで私たちの代表的なデータに示されているように、このプロトコルは生存率の高い細胞を産生し、特異的な免疫細胞サブセットを含み、フローサイトメトリー解析で使用される一般的な表面マーカータンパク質の完全性に影響を与えませんでした。

概要

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皮膚接触性皮膚炎、湿疹、乾癬、蜂巣炎、真菌感染症および膿瘍からの非黒色腫皮膚癌が世界50最も一般的な疾患の一つであることが判明した範囲の条件、および2010年1における非致死的疾患の第四世界的なリーディング原因。したがって、多様な皮膚の病変の基礎となる分子・細胞メカニズムの研究は、研究の必要と活性領域です。げっ歯類モデルは、アトピー性皮膚炎2、乾癬3、または黄色ブドウ球菌感染 4のような炎症性皮膚状態の理解に非常に有用でした。マウスの皮膚組織の酵素消化のための、安価で効率的、かつ簡単なプロトコルは、優れた皮膚疾患の病態生理を理解するために、下流の様々な用途に使用することができる細胞の調製物を提供することができます。ここでは、簡単かつ経済的な方法は、マウスの皮膚の酵素消化のために記載されています組織および細胞培養、in vivoでの養子移入のために使用することができる皮膚浸潤白血球の単離は、サイトメトリー分析および選別または遺伝子発現研究を流します。この手順の全体的な目的は、典型的には、カスタムの試薬キットや機械的解離剤に関連するコストを最小限に抑えながら、高い細胞生存率で皮膚浸潤白血球の単一細胞懸濁液を調製することです。

既存の皮膚組織解離方法5-7は、低細胞生存率および表面マーカーの完全性をもたらす、またはカスタム酵素キットや高価な組織解離機8-11が必要な場合があります。マウス耳皮膚組織の消化は、合理的に、12-13流行高度角化皮膚組織を消化し ​​ている間（例えば、サイドから）非細胞破片の大量の汚染された細胞調製物をもたらすことができます。最近の研究では、ザイドらは、2.5 mg / mlのディスパーゼ、follo 90分間マウスの脇腹の皮膚を消化しました3 mg / mlのコラゲナーゼ7で45分までに結婚。別の研究では、これらの研究者は、トリプシン/ EDTA、コラゲナーゼIIIの使用を含む、2.5時間の組み合わせ消化で複数のインキュベーションを使用し、5をディスパーゼ。異なる製造業者からのトリプシン処理は、測定可能な哺乳動物細胞の14-15上の細胞表面タンパク質の完全性に影響を与えることが示されているようにトリプシンの使用は、皮膚の酵素消化には ​​推奨されません。さらに、ディスパーゼは、CD4およびCD8αT細胞の増殖能力に有意な効果を有しており、例えば、CD62L 16などの一般的なT細胞活性化マーカーを含む少なくとも20の分子の表面の存在量に影響を与えることができます。他のプロトコルは、消化媒体6に RPMI 1640を使用しています。しかし、RPMI中のMg 2+およびCa 2+の存在は、大規模な細胞凝集17を引き起こす可能性があります 。

組織解離のための理想的なプロトコルは、低、高細胞生存率を目指す必要があります細胞凝集、および細胞表面タンパク質への最小限の損傷のレベル。高品質のリンパ節間質細胞調製物は、短い酵素インキュベーション、 の Ca 2+およびMg 2+を含まない培地を使用するプロトコルを用いて達成し、トリプシンを回避し、18をディスパーゼされています。しかし、このタイプのプロトコルは、全マウス皮膚の解離のために確立されていません。

ここでは、プロトコルは、解離分離、およびアレルゲンチャレンジマウスの脇腹の皮膚から皮膚浸潤白血球を豊かにするために記載されています。簡単に説明すると、切除された皮膚は、消化のために、組織を柔らかくし、余分な死んだ皮膚または脂肪組織を除去するために、1時間、10％ウシ胎児血清を含むハンクス平衡塩溶液（HBSS）中でプレインキュベートします。これは、0.7ミリグラムで30分間酵素消化工程が続く/ mLのコラゲナーゼD.コラゲナーゼDはそれを作る、細胞表面マーカーの密度、 およびインビトロ16,18 における T細胞の増殖に影響を与えずに最小限の効果を有します表面タンパク質の特徴付けを含む用途に非常に適しています。酵素消化の後、不連続密度勾配遠心分離は、単一細胞懸濁液からの上皮細胞及び破片を除去し、造血細胞を富化するために使用しました。重要なことには、この手順は、高価なカラムベースの磁気細胞分離試薬および組織解離機8-11を回避し 、かつ基本的な生物医学研究室で見つけ機材を用いて行うことができます。ここでは、このプロトコルは、脇腹皮膚から白血球を分離するために使用された（19から適応）以前に増感ND4のスイスマウスにハプテンオキサゾロン（OX）で3回挑戦しました。細胞を、マルチパラメトリックフローサイトメトリーを用いて分析しました。この技術は、最小限の破片と、影響を受けたSKにTリンパ球および好中球の浸潤を測定するために、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって分析された、単離されたリンパ球の> 95％の生存率と細胞懸濁液が得られましたに。

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プロトコル

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注：8-12週齢の雌ND4 Swiss Websterマウスは、従来から食料と水に自由にアクセスさせて飼育、これらの研究のために使用した（B13S1）使用される実験プロトコルは、マカレスター大学のIACUCによって承認されました。

オキサゾロン1.感作とチャレンジ

  1. 0日目
    1. 4 L蓋付きガラス瓶の底にメッシュの下に配置された吸収性タオルに3ミリリットルイソフルランを追加することによって、麻酔室を準備します。被写体が十分に麻酔されるまで、ここで使用ND4雌マウスでは、チャンバー内の時間は30〜60秒です。使用しているマウス株のための麻酔管理を最適化します。
    2. 動物の毛のトリマーを使用して、各麻酔したマウスの背中や脇腹を剃ります。
  2. 1日目
    1. 無水エタノール中の4-エトキシメチレン-2-フェニル-2-オキサゾリン-5-オン（OX）の2％溶液を作製し、インキュベーター内で回転板上で15分間、50℃でインキュベートします。
    2. 簡単に言うと麻酔1.1.1に記載されており、約20μlの各いくつかのシリアル・アプリケーションに戻って剃っに2％牛の100μLを適用するようイソフルラン麻酔を使用してマウス。乾燥するためのソリューションのためのシリアル・アプリケーションとの間に5〜10秒待ってください。
    3. バック以外の領域に2％牛液をこぼすないように注意してください、とアプリケーションの間に乾燥するためのソリューションを待ちます。
  3. 日5-7
    1. 無水エタノール（牛）の1％溶液を作製し、インキュベーター内で回転板上で15分間、50℃でインキュベートします。
    2. 静かにしっかりと（腹腔内注射のために保留に類似）を上向きと首がやや下向きに傾いた腹部と首と尾ベースの首筋にマウスを固定化し、いくつかのシリアル・アプリケーションで剃っ脇腹に1％牛の100μLを適用そして上記のように、その後、皮膚を乾燥させるために時間をかけ。
    3. 対照マウスでは、剃ったフランに無水エタノール車の100μLを適用K。

2.フランクスキン収穫

  1. 二酸化炭素吸入を使用して、マウスを安楽死させる、と慎重に10センチメートル手術用ハサミで脇腹の皮膚の所望の領域（皮膚の〜25ミリメートル×25 mm）を切り出します。
  2. きれいな、鋭い外科用メスを使用して、脇腹の皮膚から余分な脂肪および結合組織を削り取ります。
  3. カルシウムまたはマグネシウムを含まないフェノールレッド、5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いて[10 mlのRT HBSSを含む50 mlのコニカルチューブに3匹のマウスの側腹部皮膚の3枚を配置し、10mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、および10％ウシ胎児血清（FBS）]。

3.事前消化組織洗濯

  1. 37℃に維持し、乾燥非ガス処理インキュベーター中で30分間回転板上の皮膚断片を含む場所チューブ。
  2. インキュベーション期間の終わりに10秒間激しくボルテックス。
  3. 70ミクロンを介してチューブの内容ひずみストレーナーを洗浄緩衝液を廃棄し、組織を収集します。単一ストレーナーは、生物学的治療群内で手順全体を通して再利用することができます。
  4. ピンセットを使用して、（上記のようにEDTA、HEPES、およびFBSを含む）新鮮な、RT HBSS培地の10 mlを含む新しい50 mlのコニカルチューブにストレーナーから脇腹の皮膚を転送します。
  5. 組織の平均ピースが面積約2.2ミリメートルX 2.2ミリメートルになるようにチューブに浸漬し、外科的解剖ハサミ12.5センチペアで、脇腹の皮膚の各部分をミンチ。
  6. 37℃に維持し、乾燥非ガス処理インキュベーター中で30分間回転板上の皮膚断片を含む場所チューブ。
  7. インキュベーションの終わりに10秒間激しくボルテックス

肌の4.コラゲナーゼ消化

  1. 70μmのストレーナーを介してチューブの内容をひずみ、10ミリリットルFREを含む新しい50mlコニカルチューブに脇腹の皮膚片を収集し、転送SH、RT HBSSメディアは、0.7 mg / mlのコラゲナーゼDに補足しました
  2. 37℃に維持し、乾燥非ガス処理インキュベーターで30分間、回転板上で消化培地および皮膚断片を含む場所チューブ。
  3. インキュベーションの終わりに勢いよく10秒間チューブの渦内容。
  4. 新しい50mlコニカルチューブに70μmのストレーナーを通してチューブのフィルタの内容。消化された組織を含むフロースルーを維持し、ストレーナを破棄し、皮膚の破片に隣接しています。
  5. 350×gで5分間、HBSS培地、遠心分離機50mlにフロースルー洗浄し、上清をデカントします。

5.密度勾配遠心

  1. 血清学的ピペットを使用して、各サンプルについての新しい15 mlのコニカルチューブに1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3 mlのRT 67％密度勾配遠心分離媒体を加えます。
  2. 5ミリリットルフェノールレッドとHBSS中のRT 44％の密度勾配遠心分離培地で細胞ペレットを再懸濁します。
  3. ヘント血清学的ピペットを使用して67％の密度勾配遠心分離媒体試料の上に細胞を含む44％の密度勾配遠心分離媒体のLY層5 mlです。最も遅い速度にピペッターを設定し、円錐管の壁に沿ってピペットを配置することを確認します。 、振る崩壊させる、またはグラデーションの色を反転しないように注意してください。
  4. 最も低い設定に設定し、加速、ブレーキを解除し、遠心分離器がバランスであることを確認し、室温で20分間、931×gで勾配を遠心します。
  5. 遠心分離した後、慎重に遠心分離機からグラデーションを削除して、静かに直立管を保持する実験台に運びます。 5 mlのプラスチック製トランスファーピペットを用いて、新しい15 mlのコニカルチューブに44％および67％密度勾配遠心分離媒体および転写の界面で細胞層を除去します。インターフェイスが表示されない場合は、単純に67％-44％の境界で液体の約2mlを削除します。
  6. INTEから細胞を含むコニカルチューブを埋めます2％1X氷冷PBSでFBS、350×gで5分間遠心分離細胞、上清をデカントでrface。
    注：消化工程は37℃であり、密度勾配遠心分離媒体のステップは室温であるので、これは、セルを冷却することができることが初めてでは、/コールド保ちます。細胞を1に再懸濁することができる：1トリパンブルーに希釈し、計数し、生存率情報は、この時点で得ることができます。

フローサイトメトリー分析のための6ブロッキングと染色

  1. ブロックのFcγRII/ IIIは、非特異的な抗体染色を防ぐために、細胞上の受容体。非コンジュゲートと結合するCD16 / 32（2.4G2）に対する抗体とブロックのFcγRII/ III受容体の100倍希釈：ここで説明する実験のために、1を含む2％FBSを含むPBS中の抗体のマスターミックスを作ります。
  2. CD3ɛ（145-2C11）、CD4（RM4-5）、CD8α（53-6.7）、のCD11b（M1 / 70）、のCD11c（N418）、CD44（IM7）、CD45（に対する抗体の適切なマスターミックスでブロックされた細胞をインキュベート30-F11）、CD45R（RA3-6B2）、CD62L（MEL-14）、およびLY-6G / LY-6C（GR-1）（RB6-8C5）と同様に、ブリリアントバイオレット死んだ細胞を同定するために510生/死染色。希釈メーカーが推奨する、または以前の研究者によって最適化ですべての抗体のいずれかを使用してください。 100希釈：ここで説明する実験のために、1ですべての抗体を使用しています。
  3. 2％FBSを含む50μlの1×PBSの染色緩衝液中で細胞を再懸濁を洗ってください。蛍光データは、フローサイトメーターで取得できるようになるまで氷上で保管してください。
    注：これは、蛍光データの取得の前にリンパ組織および（CD4またはCD8のような）一般的な細胞表面抗原で事前に最適化された補償パラメータを有することが重要です。
  4. 下流のフローサイトメトリー分析のために細胞の数を増加させるために、染色された細胞の全サンプルからデータを取得します。

7.以下の手順を解決するための標準的な方法を用いて、フローサイトメトリーデータの分析

  1. 前方散乱のリンパ球領域上にまず、ゲート側方散乱（面積）のプロットにより（面積）。
  2. 次に、二重の分析を避けるために、側方散乱（幅）によって前方散乱（幅）を使用して単一のセルを選択します。これはまた、側方散乱高プロットによって前方散乱の高さを用いて達成することができます。
  3. 目標がある場合はその後、それぞれマクロファージ、樹状細胞、およびB細胞を排除する系統のゲート（のCD11b、CD11cの、およびCD45R / B220）陰性およびCD3陽性のイベント、および閉じ込めるは、T細胞区画に分析しますそれがここにあるように、T細胞の浸潤を評価します。
  4. 次に、生/死染色を排除し、生細胞上のゲート。
  5. 最後に、目的の細胞集団上にゲート（代表的な結果を参照）。

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結果

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コラゲナーゼDは 媒体処置対照と比較した場合、 脾臓細胞は、T 細胞上の CD4及びCD8αの同様のレベルを示して扱わ
まず、T細胞サブセット上の系統及び活性化マーカーの頻度及び表面豊富にコラゲナーゼDの任意の潜在的な影響は、対照としての二次リンパ組織を使用して評価しました。脾臓細胞の懸濁液を、ND4マウスから得て、HBSS培地で1時間洗浄しました。次に、細胞の半分は0.7 mg / mlのコラゲナーゼD（上記のセクション4で説明したように）を行いました。残りの細胞は、コントロールHBSS培地中に再懸濁しました。次に、両方の脾細胞画分は、上記セクション5に記載されるように密度遠心分離勾配を用いて処理しました。次いで、細胞を表面にCD4およびCD8αに対する抗体で染色し、フローサイトメーターで分析しました。シングル、ライブ

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ディスカッション

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このようなアトピー性皮膚炎や乾癬などの皮膚疾患のげっ歯類モデルにおいて皮膚常駐白血球の変化を特徴づけることは炎症性細胞の流入および疾患の病理との間に機械的な接続を理解するために重要です。ここでは、ほとんどの生物医学研究室で見つかった基本的な機器を用いて皮膚組織から白血球を分離するために経済的な手法について説明します。この比較的急速な技術は実験台でハンズオンタイムを最小限に抑えながら、資源の節約に貢献し、高価な組織解離機やカスタムチューブおよび試薬の使用を回避します。穏やかな酵素消化及び不連続勾配分離上皮細胞および破片の大部分を除去し、単離された細胞は、フローサイトメトリー分析、細胞選別、転写、細胞培養およびインビトロ刺激アッセイを含む下流の種々の用途に使用することができます。コラゲナーゼDによる酵素消化は、T細胞表面マーカーの完全性に影響を及ぼさない、とPRESERVESの細胞生存率。このプロトコルは、簡単にフランク以外の領域からの皮膚を処理するために修正することができます。

この手順の中で最も重要なステップは、細胞死を最小限に抑えながら、細胞収率を浸潤最大にする...

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開示事項

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著者らは、開示する金銭またはその他の利害関係はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

国立衛生研究所（NIH R15 DCへNS067536-01A1）、国家外陰部痛協会（DCへの賞）、およびマカレスター大学は、この作品を支持しました。 CBはアーノルドとメイベルベックマン財団によって資金を供給マカレスター大学ベックマン学者プログラムからのフェローシップを受けました。 BTFとTMはJDRF 2-2011-662によってサポートされています。我々は、技術的な助言のために博士ジェイソン・シェンケル博士ジュリアナ・ルイスに感謝し、彼らの助けと支援のためのChatterjeaラボのすべての現在および元メンバー。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
HBSS フェノールレッド、カルシウムなし、マグネシウムなし、液体シグマアルドリッチ55021C使用日まで無菌状態に保ちます。
HEPES、≥99.5% (滴定型)Sigma AldrichH3375
EDTA 二ナトリウム塩溶液Sigma AldrichE7889使用日まで無菌状態に保ちます。
ウシ胎児血清、USDA、熱不活性化、プレミアムセレクトMidSciS01520HI使用日まで無菌状態に保ちます。
パーコール、pH 8.5-9.5 (25°C;C)シグマアルドリッチP1644菌状態に保ちます。Percollは、使用前に滅菌済みの10X PBSで等張性にする必要があります。
トリマーコンボキットケントサイエンティフィックCL9990-1201 側面と背中を剃るには、大きい方のトリマーを使用します。
4-エトキシメチレン-2-フェニル-2-オキサゾリン-5-オンシグマアルドリッチE0753-10Gは、50°Cで100%EtOHに溶解します。回転プレートで15分間Cします。
精製抗マウスCD16/CD32 (2.4G2)Tonbo Biosciences70-0161フローサイトメトリー用抗体染色時に非特異的抗体結合を阻害する抗体
抗CD3ε-BV650 (145-2C11)Becton Dickinson564378フローサイトメトリー用細胞染色
抗体 抗CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)eBioscience47-0042-80フロー用細胞染色抗体サイトメトリー
anti-CD8&α;-BV785 (53-6.7)BioLegend100749フローサイトメトリー用細胞染色用抗体
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)eBioscience48-0112-80フローサイトメトリー用細胞染色用抗体
anti-CD11c-eFluor450 (N418)eBioscience48-0114-80フローサイトメトリー
用細胞染色用抗体 抗CD44-BV711 (IM7)Becton Dickinson563971Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11)Tonbo Biosciences35-0451-U025Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)eBioscience48-0452-80Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)BioLegend104431フローサイトメトリー用細胞の染色に使用される抗体
抗Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)BioLegend108407フローサイトメトリー用細胞の染色に使用される抗体
Ghost Dye-BV510Tonbo Biosciences13-0870-T100フローサイトメトリー用生存率色素
LSR FortessaBecton DickinsonN/ACell analyzer (18 parameters)
Clostridium由来のコラゲナーゼDhistolyticumRoche Applied Science110888580015 mg/ml の HBSS でアリコート凍結乾燥酵素を HBSS にフェノールレッド、カルシウムなし、マグネシウムなしで 1 mL アリコートに添加します。 -20°Cですぐに保管してください。Cは最長6ヶ月間。
ND4 スイスの雌マウスHarlan0-328-12週齢;従来は食物と水への自由なアクセスで飼育され、マカレスター大学のIACUCガイドラインに従って使用されました。 
無用

参考文献

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