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方法論記事

携帯マイトファジーのマーカーとしてEYFP-パーキン集計の評価のためのタイムラプスビデオ顕微鏡

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DOI：

10.3791/53657

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2016年5月4日

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1Department of Cancer Biology, Thomas Jefferson University, SKCC, 2Department of Medical Oncology, Thomas Jefferson University, SKCC, 3Kazan Federal University

この記事について

サマリー

ここでは、損傷したミトコンドリアの選択的除去中のEYFP-Parkinの時間的動員を測定するためのタイムラプスビデオ顕微鏡アプローチについて詳しく説明します。EYFP-パーキン依存性で損傷したミトコンドリアを除去するこのダイナミックなプロセスは、さまざまな実験条件下で細胞の健康の指標として使用できます。

要約

Time-lapseビデオ顕微鏡は、生細胞のリアルタイムイメージングとして定義することができます。この手法は、さまざまな時点での画像のコレクションに依存しています。時間間隔は、顕微鏡に統合されたカメラを制御するコンピューターインターフェースを介して設定できます。この種の顕微鏡検査には、非常に迅速なイベントを取得する能力と、これらのイベント中に観察された細胞構造によって生成されるシグナルの両方が必要です。画像が収集された後、実験全体のムービーが組み立てられ、関心のある分子イベントのダイナミクスが表示されます。タイムラプスビデオ顕微鏡は、生物医学研究分野で幅広い用途があり、細胞イベントのダイナミクスをリアルタイムで追跡するための強力でユニークなツールです。この手法により、移動、分裂、シグナル伝達、成長、死などの細胞イベントを評価できます。さらに、蛍光分子プローブを使用して、DNA、RNA、タンパク質などの特定の分子をマークし、それらの分子経路と機能を追跡することができます。タイムラプスビデオ顕微鏡には複数の利点があり、その主なものはシングルセルレベルでデータを収集できることであり、細胞生物学の分野でのユニークな研究技術となっています。しかし、タイムラプスビデオ顕微鏡法には、高品質の画像の取得を妨げる可能性のある制限があります。画像は、両方の外部要因によって損なわれる可能性があります。温度変動、振動、湿度、内部要因。pH、細胞の運動性。ここでは、タイムラプスビデオ顕微鏡法を用いて、損傷したミトコンドリアの選択的除去を追跡するために、強化された黄色蛍光タンパク質(EYFP)と融合した特定のタンパク質Parkinを動的に取得するためのプロトコルについて説明します。

概要

マクロオートファジーは、細胞小器官やタンパク質などの損傷した細胞成分や機能不全の細胞成分の両方を、リサイクルやエネルギー生産のために異化分解する細胞内プロセスです。この代謝プロセスを開始するために、細胞は損傷した細胞成分をオートファゴソームとして知られる二重膜構造に飲み込み、リソソームと融合してその内容物を分解してリサイクルします1,2。オートファジーには、非選択的と選択的の2つの主要なタイプがあります。非選択的オートファジープロセスは、細胞が栄養欠乏状態にあり、必須栄養素とエネルギーの両方を清掃する必要がある場合に発生します。しかし、選択的オートファジーは、機能不全や損傷を受けたオルガネラと、毒性を持つ可能性のあるタンパク質の両方の除去を媒介するために起こります。最も研究されている選択的オートファジープロセスの1つは、マイトファジー1,3-5と呼ばれるミトコンドリアの除去です。

ミトコンドリアは細胞代謝の中心的な細胞小器官であり、電子伝達鎖を介した酸化的リン酸化、脂肪酸酸化、およびトリカルボン酸(TCA)サイクルを介したアデノシン三リン酸(ATP)の主要な供給源です。さらに、ミトコンドリアは活性酸素種(ROS)の産生を調節し、細胞死経路6-8に関与するタンパク質を放出します。

PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)とParkin RBR E3ユビキチンリガーゼ(Parkin)は、マイトファジープロセスに関与する主要なタンパク質です。パーキンは、ミトコンドリアの品質管理を通じて細胞を健康に保つことにより、細胞死から保護することができます9。ミトコンドリア膜電位が失われると、細胞質のパーキンはPINK1によってミトコンドリアに動員されます。この募集は、マイトファジー10の連続的なイベントを引き起こします。マイトファジーが基本的なミトコンドリアの品質管理プロセスであり、このプロセスの異常が病気を引き起こすという幅広い証拠があります7。例えば、常染色体劣性パーキンソン病は、パーキンおよびPINK1(それぞれPARK2およびPINK1)をコードする遺伝子の突然変異と関連している11。ミトコンドリアの健康の品質管理は、ROS12の蓄積に寄与するミトコンドリアの除去に不可欠です。細胞内にROSが過剰に存在すると、核DNAとミトコンドリアDNA(それぞれDNAとmt DNA)の両方が損傷する可能性があります。

ここでは、不死化マウス胚性線維芽細胞におけるパーキン媒介性マイトファジーの誘導後のパーキンの凝集を追跡するためのタイムラプスビデオ顕微鏡アプローチを示します。これは、カップリング解除剤であるシアン化カルボニル4-(トリフルオロメトキシ)-フェニルヒドラゾン（FCCP）のインビトロ投与によるものです。FCCPは、プロトンを外側のミトコンドリア膜を横切って短絡させ、したがって電子伝達鎖13からの酸化的リン酸化を切り離すことにより、ATP合成を妨害する。ミトコンドリア膜の脱分極を誘発すると、ミトコンドリアが破壊され、パーキン依存性の選択的な除去が起こります。したがって、蛍光マーカー(強化された黄色蛍光タンパク質、EYFP)と融合したParkinをコードする発現ベクターを目的の細胞にトランスフェクションすると、マイトファジー過程におけるParkinの動員を追跡するための蛍光タグとして使用できます。ミトコンドリアを可視化するために、シトクロムcオキシダーゼサブユニットVIII(Mito)のミトコンドリア標的配列を含む赤色蛍光タンパク質(DsRed2)をコードするpDsRed2-Mitoを共トランスフェクトしました。pDsRed2-Mitoは、ミトコンドリア14の蛍光標識用に設計されています。パーキンがミトコンドリア膜に移動するのに必要な時間を測定することができ、細胞の健康状態を間接的に測定することができます。例えば、特定の目的遺伝子をノックアウトした細胞株が、FCCPによるマイトファジーの誘導後にパーキンの動員が速いまたは遅い場合、その遺伝子産物は細胞の代謝率を生理学的状態に保ち、疾患の発症を防ぐための重要なプレーヤーになると言えます。したがって、タイムラプスビデオ顕微鏡は、分子プロセス中の標識タンパク質のダイナミクスを追跡し、病的状態中にこれらのプロセスがどのように影響を受けるかを理解する上で、基礎研究と臨床研究の両方のアプリケーションに非常に強力なツールを提供します。

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プロトコル

両発現ベクターEYFP-パーキンとpDsRed2-水戸での線維芽細胞の1エレクトロポ

  1. 100 mg / mlでDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）、10％ウシ胎児血清、2ミリモル/リットルのL-グルタミン、100 U / mlペニシリンを添加した培地を用いて10センチメートルの組織培養プレートに不死化マウス胚性線維芽細胞成長、および37℃、5％CO 2を含む加湿雰囲気中ストレプトマイシン。
    1. 80％の細胞集密度で、無菌吸引によって完全DMEM培地を捨て、滅菌1×リン酸緩衝溶液（PBS）10 mLを加え（塩化ナトリウム80gを、塩化カリウム2.0gを、のNa 2 HPO 4 14.4 gのKH 2.4gの7.4）2 PO 4、1 LのH 2 O、PHを蒸留しました。
    2. 無菌吸引によってPBSを捨て、トリプシンEDTA、0.25％の1ミリリットルを追加します。 （ - 3分2）細胞が分離されるまで、37℃でプレートをインキュベートします。 _、完全DMEM培地の4ミリリットルを加え、細胞を再懸濁し、10を取り出します6;血球計カウントのための細胞懸濁液リットル。
      注：16角の正方形の一組のセルの数は、細胞×10 4 / mlの数に相当するように、血球計数器を設計します。
  2. エレクトロポレーションプロセスの24時間前に10cmの組織培養皿上にシード1×10 6細胞。
  3. 無菌吸引によって完全DMEM培地を捨て、滅菌PBSの10ミリリットルを追加します。無菌吸引によってPBSを捨て、トリプシンEDTA、0.25％の1ミリリットルを追加します。 （ - 3分2）細胞が分離されるまで、37℃でプレートをインキュベートします。完全DMEM培地4mlを加え、15 mlチューブに細胞を再懸濁。
  4. 冷蔵遠心分離（4℃）を用いて5分間250×gで細胞をスピンダウン。無菌吸引によって上清を捨て、滅菌PBS 1 mlにペレットを再懸濁。 4℃で5分間、250×gで細胞をスピンダウン。
  5. 無菌吸引によって上清を捨て、そして100μlのOを追加エレクトロポレーションのためのF溶液ミックス細胞ペレットに（82補足ソリューション1のエレクトロポレーションソリューションV + 18マイクロリットルのμl）を、穏やかにピペッティングしてペレットを再懸濁（詳細については、ユーザーのガイドを参照してください）​​。 EYFP-パーキン（励起/発光527分の514）2μgのを追加し、細胞懸濁液で1μgのpDsRed2-水戸（励起/発光620分の565）。
  6. 使い捨てのパスツールを使用して、無菌のキュベットへの解決策を（両方のツールは、キットで提供されています）転送し、予め設定されたプログラムNIH / 3T3 U-030（シングルパルス、電圧200 V、容量960μF、パルス時間20ミリ秒を使用して、エレクトロポパルス番号：1）。
  7. 電気穿孔直後に、予め温めておいた新鮮な完全DMEM培地500μlのを追加し、6センチメートル組織培養プレートライブイメージンググレード上の細胞に接種し、37℃で5％CO 2を含む加湿雰囲気中でそれらをインキュベート24時間。

2.タイムラプスビデオ顕微鏡

  1. は使用前に37℃での顕微鏡のチャンバーの温度を設定します。
  2. この時点で、実験手順を続行するために特定のライブイメージング媒体を準備します。次のようにライブイメージング媒体を準備します。混合DMEMフェノール不含の10％ウシ胎児血清、2ミリモル/リットルのL-グルタミン、100 U / mlペニシリン、および100mg / mlストレプトマイシンを補充しました。水浴中で37℃でライブイメージング媒体を事前に温めます。
  3. 無菌吸引によってエレクトロポレーションした細胞の培地を捨て、予め温めておいたライブイメージング媒体の1ミリリットルを追加し、P1000ピペットを用いて、37℃で30分間静置します。
  4. プレートのインキュベーション期間中に流入、5％CO 2顕微鏡のチャンバ内にすでに37℃で安定した温度で実施されます。
  5. 主要な動きや振動を避けて、顕微鏡のチャンバ内へのエレクトロポレーションした細胞でプレートを置きます。
  6. ソフトウェア・インターフェースを使用して、両方のfluoreを検出するために顕微鏡を設定します同時トランスフェクトするベクター、EYFP-パーキン（510 nmおよび放射範囲520〜550 nmの励起範囲495、緑）、pDsRed2-水戸（励起最大558 nmおよび放出によって、最大583 nmでのコードされた融合タンパク質からのscence信号、赤）。
    1. タイムラプスビデオ顕微鏡ソフトウェアを開きます。上部のメニューでpDsRed2-水戸のためのEYFP-パーキンおよびローダミンのためのFITCを選択します。上部のメニューで倍率（20X）を選択します。
  7. ソフトウェアインターフェイスを使用して、両方の同時トランスフェクトするベクターを発現する単一のセルを探し、位置を登録します。 10細胞の最小値は、すべての実験条件（実験群）のために収集されるまで、この手順を繰り返します。
    1. メニュー「アプリ」を選択し、多次元の取得をクリックしてください。多次元取得ウィンドウでは、このような買収の数、それぞれ取得し、記録セルの位置との間の時間間隔として必要なパラメータを選択します。取得」をクリックします。「取得プロセスを開始します。
  8. EYFP-パーキンと15分の合計の間隔で5分ごとに画像を収集DsRed2の-水戸蛍光信号の両方の基底取得を開始します。
  9. 最終的な作業濃度の2倍FCCPの濃度で予熱したライブイメージング媒体を準備する（0.1から10μM、細胞型に依存します）。
  10. 取得処理を中断し、P1000ピペットを用いて顕微鏡のチャンバ内のプレートにFCCPで予め温めておいたライブイメージング媒体の優しく1ミリリットルを追加します。
  11. 以前に記録された位置を使用して、3時間の全期間のために、説明したように取得プロセスを再起動します。それらを分析し、買収が終わったときmitophagicプロセスのビデオを作成するために取得したすべての画像を保存します。

3.分析

  1. パソコン上で「.TIFF」の形式で取得したすべての画像を収集
  2. グラフィックソフトで画像を開きます。ウェアおよび時間的間隔を定義するには（画像は5分ごとに取得される）ミトコンドリア膜にパーキンの動員を示す第1の画像にFCCPとミトコンドリア誘起脱分極から発生しました。実験群内の各セルのために、この分析を繰り返します。
  3. 実験グループ名を持つスプレッドシート上の列の最初のセルにラベルを付けます。各実験群について、10セルの最小のパーキン募集のための時間的間隔を測定します。 Parkinの募集のための計算された時間的間隔の平均を作成し、各実験群の標準偏差定義（平均値±SDを、N = 10）。
    1. 列に単一の計算された時間的間隔を整理します。すべての列は、n =実験群の10の測定値が含まれています。
    2. 数式パレットメニューから「平均」機能を選択します。列のデータを選択します。関数式ビルダのメニューから「標準偏差」を選択します。セレ列内のデータのct。
  4. 統計的手法を用いて、実験群間マイトファジーを動的に有意な差を定義するために適切な統計値を適用し、実験群を比較します。 （例えば、二つのグループ= スチューデントのt検定 、3つまたはそれ以上の基= ANOVAプラスポストホック検定）

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結果

ここで、我々は、タイムラプスビデオ顕微鏡は、単一のセル内の蛍光標識タンパク質の分子のイベントを追跡するために使用することができる強力な技術である方法を示しています。代表的な結果はまた、この技術は、高品質な画像の取得を可能にする方法を示します。分子過程の画像が得られると、我々は、さまざまな方法でそれらを分析する機会を持ちます。ここでは、選択的に損傷したミトコンドリアを除去する細胞の恒常性を維持する重要な分子過程で誘導さマイトファジープロセスの開始の間の時間の間隔を分析します。

この技術は、幅広いアプリケーションを設立します。それを研究する必要があるプロセスに関与する重要な分子の標識化を介して、細胞遊走またはミクロ分子事象としてマクロ細胞プロセスを監視するためにも使用することができます。

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ディスカッション

タイムラプス顕微鏡は、長期間にわたって携帯ダイナミクスの観察に時間的に1つの観測からのライブセルイメージングを拡張する技術として定義することができます。それは観察者がリアルタイムで単一の蛍光標識タンパク質を同定し、単一生細胞内でそのダイナミックに追従することができますので、この方法は、単純な共焦点または生細胞顕微鏡と区別されます。実際には、共焦点顕微鏡は、簡単に蛍光抗体を用いた免疫標識タンパク質を同定することができますが、それは、細胞およびそのライブ環境での分子事象を観察することはできません。

タイムラプスビデオ顕微鏡は、主にHEK293 16などの異なる種類の細胞の分子プロセスを監視、研究、一次ニューロン17およびHela細胞18で使用されるだけでなく、妊娠や予測異数性19,20として臨床応用を有しています。タイムラプス顕微鏡はembryolog提供します臨床妊娠のために胚発生についての追加情報をISTS、この情報を転送するための実行可能な胚を選択する能力を改善するために使用されることが可能で...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、NIHの助成金(1R01CA137494、R01CA132115、R01CA086072からR.G.P.)、Kimmel Cancer Center、NIH Cancer Center Core助成金P30CA056036（R.G.P.)、Breast Cancer Research Foundationからの助成金、Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust（R.G.P.）からの寛大な助成金、およびペンシルバニア州保健局（R.G.P.）からの助成金によって部分的に支援されました。この研究の一部は、American Italian Cancer Foundationのポスドクフェローシップ(G.D.)およびSidney Kimmel Cancer CenterのBioimaging Shared Resource(NCI 5 P30 CA-56036)の支援を受けた。本省は、分析、解釈、または結論に対する責任を明確に否認します。この原稿に関連する利益相反はありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEMコーニング ライフサイエンス10-013-CV37 ° で温まる前。使用前のC
フェノールフリー DMEMCorning Life Science17-205-CVPre-warm at 37 °C使用前のC
:ウシ胎児血清Sigma-AldrichF244237 °で温まる前。C使用前の
L-グルタミンGibco2503037 °で温めておきます。C使用前の
ペニシリン/ストレプトマイシンコーニングライフサイエンス30-002-CI37°で温まる前。C 使用前に
EYFP-PARKIN 発現ベクターAddgene23955
pDsRed2-Mito 発現ベクターClontech632421
Nucleofector 2B デバイスLONZAAAD-1001S
Nucleofector for kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscopeCARL ZEISS
シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)-フェニルヒドラゾン (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorphMolecular Devices実験ビルダー
ImageJ衛生研究所実験ビルダー
国立

参考文献

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