組換えアデノ随伴ウイルスベクターの定位注射を介して、パーキンソン病のα-シヌクレインベースのラットモデルの開発

サマリー

この原稿は、ウイルスベクターを介した局所遺伝子送達が、中枢神経系における導入遺伝子の発現にどのように魅力的な方法を提供するかを説明しています。 このプロトコルは、パーキンソン病のウイルスベクターベースの動物モデルを開発するために、ラットの黒質にウイルスベクター注射を実施するためのすべての重要なステップを概説しています。

要約

パーキンソン病（PD）の分子経路を研究し、新規治療戦略を開発するために、科学的な研究者は、動物モデルに依存しています。 PD関連遺伝子の同定は、遺伝的PDモデルの開発につながっています。ほとんどのトランスジェニックα-SYNのマウスモデルは、緩やかなα-SY​​Nの病理を発症するが明確なドーパミン作動性細胞損失およびドーパミン依存性の行動障害を表示することができません。このハードルはPD関連遺伝子を過剰発現するウイルスベクターによる黒質の直接の標的にすることによって克服されました。ウイルスベクターを使用してローカル遺伝子送達は、中枢神経系に導入遺伝子を発現するための魅力的な方法を提供します。特定の脳領域（ 例えば、黒質）標的化することができる、発現は、成人設定において誘導することができ、高い発現レベルを達成することができます。さらに、様々なウイルスに基づく別のベクター系を使用することができます。プロトコルは、ウイルスベクターを実行するために、すべての重要なステップの概要を説明しますラットの黒質内注入は、パーキンソン病のためのウイルスベクターベースのα-シヌクレインの動物モデルを開発します。

概要

PDの病態生理を研究し、新たな治療戦略を開発するために、密接にヒトPDの神経病理学、生理学や運動症状に似ている動物モデルのための緊急の必要性があります。予測値が高いほど、より良い私たちは、患者に、動物モデルからの新たな治療法を翻訳することができます。

1997年の最初のPARK遺伝子としてα-シヌクレイン（α-SYN）の発見は、最初の遺伝的PDモデルの開発につながりました。ヒト野生型（WT）または変異（A30P、A53T）α-SYNを過剰発現する多くのトランスジェニックマウスは、過去10年間に生成されています。 α-SYN過剰発現のレベルは、病理の発達において重要であることが証明されています。また、マウス系統、内因性α-SYNの全長または切断型を発現しているかどうか有無が、（MagenとChesselet ¹による詳細なレビュー）役割を果たしています。 WTと人間のいくつかの臨床変異体の両方の過剰発現＆＃945;トランスジェニックマウスにおける-SYNは、α-SYNと神経機能障害^2-6の病理学的蓄積を誘導します。しかし、今までほとんどのトランスジェニックα-SYNのマウスモデルは、明確なドーパミン作動性細胞損失およびドーパミン依存性の行動障害を表示することができませんでした。

このハードルは、α-SYNを過剰発現するウイルスベクターによる黒質（SN）の直接の標的にすることによって克服されました。ウイルスベクターは容易に、細胞に感染し、その宿主ゲノムに遺伝物質を導入し、新たなウイルス粒子を生成するためにウイルスゲノムを複製する宿主細胞を強制することができ、ウイルスに由来します。ウイルスが細胞に侵入し、遺伝子を導入する能力を保持する非複製ウイルスベクターを操作することができます。ウイルスゲノムの一部を削除し、目的の遺伝子によってそれらを置換することにより、ベクトルの適用は、一般に、「形質導入」と指定された宿主細胞中で複製することなく、単一のラウンド感染をもたらします。ウイルスベクターC過剰発現および遺伝子サイレンシングの両方のために使用されます。表現導入遺伝子は、レポータータンパク質（ 例えば 、緑色蛍光タンパク質またはホタルルシフェラーゼ^）7、我々はこの論文に焦点を当てるように遺伝子治療用途^8-10や、ために治療用タンパク質、疾患モデル¹¹に使用される疾患関連タンパク質であることができます^-14。

ウイルスベクター媒介遺伝子送達は、いくつかの利点とCNSにおける導入遺伝子を発現するための代替方法を提供します。ローカル導入遺伝子送達を使用して、特定の脳領域を標的にすることができます。さらに、導入遺伝子の発現は、発達中の代償機構のリスクを減少させる成人期に誘導することができます。また、モデルは、異なる種及び株で作成することができます。そして最後に、異なる導入遺伝子を容易に組み合わせることができます。ウイルスベクターを用いて、高い導入遺伝子発現レベルは、疾患の発症および重症度が頻繁overexpのレベルに依存するので、重要である可能性がある、達成することができますression。

様々なウイルスに基づくいくつかのベクター系が開発されています。ベクター系の選択は、目的の遺伝子、遺伝子発現、標的細胞及び生物学的安全性の問題の必要な持続時間の大きさに依存します。彼らは齧歯類の脳における効率的かつ長期的な遺伝子発現につながるので、脳内の安定した遺伝子導入のために、レンチウイルス（LV）および組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVの）ベクターは、現在選択されたベクターシステムを考えています。 SNのドーパミン作動性ニューロン（DN）の特異的標的のために、rAAVベクターは、徐々に、それらのより高い力価およびDNの導入効率のLVベクトルをoutcompetedています。

現在利用可能な最良のα-SYNベースのげっ歯類モデルは、新しいAAV血清型（rAAVの1、5、6、7、8）と最適化されたベクター構築物、力価、および純度^15,16を使用して合成アプローチから開発されてきました。ベクター力価と同様にベクトル純度が直接影響を与えますモデルの表現型の結果。過度のベクター力価または不十分に精製されたベクターのバッチは、非特異的な毒性をもたらし得ます。したがって、適切な制御ベクトルが不可欠です。ウイルスベクターの生産、スケールアップ、及び精製手順にかなりの時間を投資も再現可能で、高品質のベクトルバッチを得ることが不可欠であることが証明されています。

プロトコル

全ての動物実験は、1986年11月24日の欧州共同体理事会指令（609分の86 / EEC）に従って行われ、ルーベン大学（ベルギー）の生命倫理委員会によって承認されています。

1.組換えAAV産生および精製

注意：以前に^17を説明したようにrAAVベクターの産生および精製は、ルーヴェンウイルスベクターコア（LVVC）によって行いました。

1. 1：DMEM培地中で1〜2％ウシ胎児血清1の割合で25kDリニアポリエチレン150 nMのNaClのトランスフェクション溶液を3つの異なるプラスミドを使用して（<50）の通路付着HEK 293T細胞簡潔に述べると、トランスフェクトサブコンフルエント低いです。 5％CO ₂中37℃でのインキュベーションの24時間後に、新鮮なDMEM培地を2％ウシ胎児血清を含む培地を交換します。
   注：プラスミドはAAV7血清型のための構築物を含む、CMVIEの制御下で、人間A53T変異体α-SYNをコードするAAVトランスファープラスミドはsynapsを強化しましたin1のプロモーターとpAdvDeltaF6アデノウイルスヘルパープラスミド^17。
2. 5日一過性トランスフェクション後に培地を回収し、接線流濾過^17を使用して集中します。
3. イオジキサノール段階勾配^17を使用して濃縮された媒体からのrAAVベクター粒子を精製します。
4. ゲノムコピー（GC）決意のためのリアルタイムPCRの標準的な技術を使用してください。このプロトコルでは、3.0 E11 GCのベクター力価は、/ mlのPD ¹⁷のためのα-SYNベースのラットモデルを開発するために使用されました。

ラットのSNでのrAAVα-SYNベクター（図2）の2定位注射

1. ペレット化し、食品や水道水に自由にアクセスで通常の12時間の明/暗サイクル下で約200〜250gのハウス8週齢の雌Wistarラット。
2. 腹腔内にラットを提出ケタミンの混合物（60 mgの/ kg）およびメデトミジン（0.4ミリグラム/キログラム）を含む（IP）麻酔。ラットを麻酔して、反応しないいったん別の足を圧迫するとき、マイクロトランスポンダ注入装置を使用してさらに認識のためのラットの背面にマイクロトランスポンダを皮下に投与します。マイクロトランスポンダが正しく配置され、読取装置によって読み出すことができるかどうかをチェックします。
3. 頭皮の上に髪をカットします。頭皮と耳の両方に局所麻酔薬を適用します。無菌技術を用いて、層流の下で外科手術手順の残りを実行します。
4. 2耳バー、口と鼻のバーを使用して、定位ヘッドフレームにラットを置きます。体温の低下を回避するために、紙ブランケットラットの体を覆います。乾燥から目を防ぐために、眼の潤滑剤を塗布します。
5. イソプロパノール70％でjodium 1％と頭皮を消毒し、頭皮の正中線に小さな切開を行います。静かに頭蓋骨上の膜を削り取ると、生理食塩水で洗い流してください。数分間頭蓋骨乾かします。ブレグマとラムダ：頭蓋縫合と2つの基準点を守ってください。
6. SNにrAAVベクターを注入するために、ブレグマに向かって（：;：2.0ミリメートルと背腹：硬膜から計算さ7.2ミリメートル内外5.3ミリメートル前後）の座標を定義します。
   注：関心のある各領域の三次元座標は、解剖学的基準点としてブレグマを適用し、ラット脳の定位アトラスを用いて計算することができます。
7. rAAVベクターを用いて10μlのマイクロインジェクションのシリンジ（30ゲージ20ミリメートル）を記入し、電動式マイクロインジェクションポンプに接続された定位固定装置に入れてください。ベクトルの滴を放出することによって、ボリュームを制御し、多価のクリーニング洗剤のpH 9（ 例えば RBS）に排除します。
8. 視覚的にヘッドがストレートヘッドフレームに固定されているかどうかを確認し、左右軸を評価します。慎重に視覚的にブレグマとラムダのための前後および内外側の座標を定義し、定位フレームの背腹腕に30ゲージ20ミリメートルの針を使用して、その高さを測定。
   1. 午前を許可しますブレグマとラムダとの高さの0.3ミリメートル差のaximum。ブレグマに戻って針を置き、前後と定位フレームの内外側アームを移動させることにより、前後および内外側の座標を適用します。
9. 注射の場所で、頭蓋骨の高さを測定し、それはブレグマの高さから0.3mm以下が異ならないことを確認してください。約2ミリメートルの直径を有する頭蓋骨に穴を開けます。硬膜の高さを測定し、これは背腹座標を適用するための基準として機能します。あるいは、頭蓋骨（0.9ミリメートル）のために一定の厚さを引きます。
10. 26ゲージの針を使用して硬膜を貫通し、無菌の組織と血液を吸収します。すべての出血が進む前に、停止するまで待ちます。
11. ゆっくりと（背腹座標）予め定められた深さまで脳内に10μlのマイクロインジェクションのシリンジは、ベクター溶液を事前にロードされて挿入します。代わりに針で1分待ちます。 3μLを注入します0.25μlの/のスループットを持つ電動式マイクロインジェクションポンプを用いて、ベクター溶液（3.0 E11ゲノムコピー/ ml（培地ベクター用量）またはrAAV2を/ 7α-SYNまたはeGFPのコントロールベクターの1.0 E12 GC /ミリリットル（高ベクター用量））の分。
12. 注入後、ゆっくりとそれを削除する前に別の5分間の場所に針を保ちます。コー​​ティングされた編組ポリエステル3.0を使用して頭皮をステッチ、70％イソプロパノール中の1％jodiumで消毒し、穏やかに定位装置から動物を削除します。まず鼻と口バーを緩め、2つの耳のバー。
13. 麻酔を逆にするには、0.5ミリグラム/キログラムアチパメゾールを腹腔内にラットを注入し、それが目を覚ますまで、38℃の加熱板上にきれいなケージにラットを置きます。体温の低下を防止するために、紙ブランケットでラットを覆います。
14. 最初の数時間のために食料と水への容易なアクセスを提供します。最初の数日間、ラットを監視します。必要に応じて鎮痛を適用します。
    注：トンからステッチを削除する必要はありません彼は頭蓋骨。 1-2週間後頭骨が完全に修復され、stichesが緩みます。

非侵襲性PETイメージング、行動試験および免疫組織化学的解析を用いた3 rAAV2をの評価/ 7α-SYN注射したラット

1. 、個々の動物で時間をかけて非侵襲的に黒質線条体ドーパミン作動性神経変性の動態をフォローアップ小動物陽電子放射断層撮影（PET）とDAトランスポーターなどのトレーサーを使用して結合ドーパミントランスポーター（DAT）を定量化するために^、[18 F] -FECT ¹⁶ 。
2. ドーパミン作動性神経変性のレベルはラットにおける運動障害を誘導するのに十分であるかどうかを調べるために、自発的な前肢の使用を評価するために、シリンダテストをラットに施します。
   1. 後部後壁と着陸に沿って上下移動中20センチメートルワイドクリアガラスシリンダーとビデオテープに行動をラットを置きます。 20の合計のために各前肢によって行われた連絡先の数をスコア連絡先。採点基準の詳細についてはSchallert らを参照してください^。18は 、総前肢の連絡先（左プラス右前足）の割合として損なわ前肢の連絡先（ 例えば左前足）の数を表現します。
      注：両方の足を使用して、非傷害対照ラットも同様に、この試験では50％前後を獲得する必要があります。
3. 導入遺伝子の発現とドーパミン作動性細胞損失のレベルを評価するための免疫組織化学（IHC）分析を実行します。
   1. 異なるエンド段階では、ペントバルビタールナトリウム（60mg / kg、腹腔内）の過剰投与によりラットを犠牲にし、PBS ¹⁹中の4％パラホルムアルデヒドに続いて冷生理食塩水で心臓内灌流を行います。 4℃で一晩脳を固定し、振動ミクロトームを用いて厚さ50μmの冠状脳切片を切りました。
   2. α-SYNの発現レベルを分析するためにα-SYNおよびチロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を用いて、自由浮遊切片でIHC染色を行い、ル神経変性¹⁶のVEL。

結果

実験の全体的なスキームは、図1に示されています

A53Tα-SYNのrAAVの2月7日媒介過剰発現はドーパミン依存性の運動障害を誘発します。
α-SYN過剰発現のレベルは、ラットにおける運動障害を誘導するのに十分であるかどうかを調べるために、我々は、自発的な前肢の使用（ 図3A）を評価するために、シリンダー試験をラットに行きました。注射後3週間で、かなりの運動障害は、A53Tのα-SYNたrAAV2 / 7ベクターの用量3.0 E11 GC /ミリリットルを受けたラットで見られました。注射後4週目に自発的な対側（左）前肢の使用の50％の減少がeGFPのrAAV2を/ 7は、動物を注射した対照に対し、前足の使用（ 図3B）には非対称性を示さなかった、観察されました。高いA53Tα-SYNたrAAV2 / 7ベク...

ディスカッション

プロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。ベクター力価と同様にベクトル純度は直接モデルの表現型の結果に影響を与えます。過度のベクター力価または不十分に精製されたベクターのバッチは、非特異的な毒性をもたらし得ます。したがって、高品質のベクトルバッチおよび適切な制御ベクトルの使用が不可欠です。また、定位フレームにおけるラットの頭の正確な位置決めと座標の正確な決意は、黒質を標的化するのに不可欠です。注射部位での頭蓋骨に穴を開けた後、任意の余白に触れることなく真っ直ぐラットの脳に注射針を挿入することが重要です。針をゆっくりベクトル漏れを防止するために、ウイルスベクターを注入した後に除去されるべきです。最後に、ステッチの後、頭皮は他の動物によってstichesの痛烈を回避するために、70％のイソプロパノール中の1％jodiumで消毒する必要があります。あるいは、他の防腐剤に使える。

記載の方法はまた、パーキンソン病²⁴ rAAV2を/ 7α-SYNベースのマウスモデルを開発するために使用することができます。マウスでは、SN 2μlのrAAVベクターの量を注入しま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
雌8週齢のWistarラットJanvier		/	200-250 g
ケタミン(ニマテック)	Eurovet動物衛生	804132
メデトミジン(Dormitor)	Orion-Pharma / Janssen Animal Health	1070-499
頭皮と耳の局所麻酔薬:キシロカ&イウム;ne 2%ゲル	アストラゼネカ	0137-547
テラマイシン	ファイザー	0132-472
Bupréノルフィン(獣医)	Ecuphar	2623-627
Jodium 1%イソプロパノール	VWR	0484-0100
定位ヘッドフレーム	Stoeling	/
ハミルトンシリンジ(30ゲージ-20ミリメートル-PST 2)	ハミルトン/フィルターサービス	7803-07
アチパメゾール(アンチセダン)	オリオン-ファーマ/エランコ	1300-185
rAAV A53T&α;-SYN	ベクターLVVC、KUルーベン	/	https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
ナトリウムペントバルビタール(ネンブタール)	セバSanté	0059-444
ミクロトーム	Microm	HM650
ウサギ ポリクローナル シヌクレイン Ab	Chemicon	5038	1:5,000
ウサギ ポリクローナル TH Ab	Chemicon	152	1:1,000
ルテチウム オキシオルトケイ酸検出器 FOCUS 220 断層撮影	Siemens/ Concorde Microsystems	/
radioligand: 18F-FECT	社内	/
L-ドーパ:プロロパ125	ロシュ		6mg / kgi.p.
DMEM, Glutamax	Life Technologies	N° 31331-093
胎児ウシ血清	Life Technologies	N° 10270-106
25 kD 直鎖状ポリエチレンイミン (PEI)	Polysciences	/
OptiPrep 密度勾配 媒体: ヨウ素酸	Sigma	D1556-250ML
Optimen	Life Technologies	N° 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition	Elsevier	/