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方法論記事

CLARITY / CUBIC技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング

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DOI:

10.3791/53673

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2016年2月26日

 ,  , 
1Brain Structure and Function Group, Neuroscience Research Australia, 2School of Medical Sciences, The University of New South Wales

この記事について

サマリー

脊椎上突起は痛みの知覚やその他の行動にとって重要であり、セロトニン作動性線維はこれらの線維システムの一つです。本研究では、これらのセロトニン作動性線維の終結を調査するために、マウス脊髄へのCLARITY/CUBICプロトコルの組み合わせの適用に焦点を当てました。

要約

脊髄への長い下降繊維が移動、疼痛知覚、およびその他の動作のために不可欠です。これらのファイバシステムの大部分の脊髄における繊維の終端パターンを徹底的に任意の種に調べられていません。脊髄に突出セロトニン作動性線維は、組織切片のラットおよびオポッサムに研究されており、それらの機能的意義は、脊髄でのファイバ終端パターンに推定基づいています。 CLARITY立方技術の発展に伴い、このファイバシステムとセロトニン脊柱上の経路の未知の機能を明らかにする可能性がある脊髄におけるその分布を調べることが可能です。ここでは、合成CLARITY立方技術を使用して、マウスの脊髄におけるセロトニン線維を撮像するための詳細なプロトコルを提供します。この方法は、COMBINと組織のヒドロゲル溶液と明確化とマウスの灌流を伴います試薬をクリアするエーション。脊髄組織は、すぐ下に2週間でクリアされた、およびセロトニンに対するその後の免疫染色は、10日以内に完了しました。多光子蛍光顕微鏡を用いて、組織を走査し、3次元画像は、OsiriXのソフトウェアを使用して再構築しました。

概要

脊椎上突起は、痛みの知覚などの多様な行動の調節に関与しています。侵害受容情報を運ぶ突起の1つには、後脳縫線と隣接する網状核1,2に由来するセロトニン作動性線維が含まれています。生理学的および薬理学的研究は、後脳の縫線核の電気刺激後に脊髄の背角におけるセロトニンの放出の増加を実証している3-5。ラットおよびオポッサムでは、セロトニン作動性ラフェ脊髄線維は、背角6〜8だけでなく、中間ゾーン7,9,10、腹角7,11、さらには椎弓板1012,13にも密集した末端を有する。マウスには同様の研究はありません。本研究は、マウス脊髄の後脳縫線核とそれらに隣接する網状核から生じるセロトニン作動性線維の終結パターンを、最近発表されたCLARITY14法とその修正であるCUBIC15を使用してマッピングすることを目的としています。

従来の脊髄の蛍光またはペルオキシダーゼ免疫組織化学は、脊髄の灰白質におけるセロトニン作動性線維の分布を30-40μmの厚さの断面で明確に示しています。しかし、このアプローチでは、白質のセロトニン作動性線維路と灰白質の側副血行路の連続性は示されていません。組織切片の3D再構成により、線維路に関する知識は進歩しましたが、切断によって組織に小さな歪みが生じるため、組織学者や解剖学者が単一の管をたどることは依然として課題です。この障害を回避するために、多くの研究者が、組織全体の構造を透明にし、未改変の組織の画像を1つのビデオファイル17-21に収集するためのさまざまなプロトコルを開発しました。これまでのところ、Deisserothのグループ14,15によって開発された透明、脂質交換、アクリルアミドハイブリダイズ硬質、イメージング/免疫染色適合、組織ハイドロゲル(CLARITY)技術、および須崎らによって開発されたCUBIC16が最も成功しています。プロトコルの発表以来、多くの研究者がこれらの技術を使用して、脳22〜25だけでなく、心臓、腎臓、腸、および肺26,27を含む生体組織のさまざまな側面を調査し始めている。

マウスの脊髄をハイドロゲル溶液(CLARITY)で固定し、CUBIC試薬で透明化することにより(これは元のCLARITYプロトコル14,15に記載されている方法よりもはるかに速い方法)、長さ2〜3mmの脊髄組織ブロックが2週間以内にクリアされ、セロトニンの免疫蛍光染色が8日で完了しました。従来の免疫組織化学は、薬剤を組み合わせるだけで、約1ヶ月で個々の線維路の画像を3Dビデオファイルに作成することができます。

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プロトコル

倫理文：動物を対象とするすべての手順は、ニューサウスウェールズ大学の動物管理及び倫理委員会（ACEC）（承認ACEC番号は14 / 94Aである）のガイドラインに従ってください。

透明なマウス脊髄の調製

  1. アイスコールドヒドロゲル溶液の調製
    1. 16％パラホルムアルデヒド溶液（PFA）の調製
      1. 70ミリリットル予め温めておいた蒸留水（50〜55℃）でに16グラムのパラホルムアルデヒド粉末を追加し、パラホルムアルデヒドが溶解するまで加熱された磁気撹拌機で撹拌します。注：ソリューションがオーバー55°Cを加熱し、パラホルムアルデヒドは有毒であることに注意することがないようにしてください。
      2. シリンダーにパラホルムアルデヒド溶液を移し、100mlに蒸留水を追加します。 4℃の冷蔵庫を使用して、パラホルムアルデヒド溶液を冷却します。
    2. 蒸留水26.25ミリリットル中に125mgのVA-044開始剤を溶解させ、4溶液を冷却Cの冷蔵庫を°。
    3. クール5ミリリットルアクリルアミド溶液（40％）、1.25ミリリットルビス溶液（2％）（注意：ビスアクリルアミド溶液は毒性があり、遺伝的欠陥や癌を引き起こす可能性がある）、5ミリリットル10×PBS、12.5ミリリットル16％PFA溶液、および氷上のVA-044の開始剤溶液。
    4. 氷の上に上記の溶液を混合。
      注：総容量は50ミリリットルです。
  2. マウス脊髄の灌流およびコレクション
    1. 0.9％生理食塩水で希釈したケタミン（80mg / kg）およびxyzaline（5mg / kg）の腹腔内注射でマウスをAnaesthetize。マウスのための用量は、ラットのそれよりも低くすることができます。
    2. マウスは、足の皮にピンチに応答しません一度ヒュームフード内で適切なプラスチック表面に、（粘着テープが効果的である）身体から離し、マウスの四肢を固定します。
    3. 胸の上にマウスの皮膚をカットした後、骨の胸は、はさみで心臓を露出します。
    4. 25 G針が番目に取り付けると、蠕動ポンプを使用してチューブの電子端部は、心臓の左心室に針を挿入し、約10ミリリットル/分の速度を血液のための出口点を作成し、40ミリリットルの0.9％生理食塩水での洗浄を開始するために右心房を切り取ります。
    5. 完了したら、35ミリリットルの氷冷ヒドロゲル溶液でマウスを灌流。
      注：神経組織の膨張を回避するために、10ml /分の速度で灌流。
    6. ブレードバックの上に皮膚を切開して、次の脊椎動物に筋肉を削除します。一方の側で椎弓を切断し、反対側にフリップした後、細かいハサミで脊柱から脊髄を取ります。
  3. マウスの脊髄をクリア
    1. 4℃で一晩ヒドロゲル溶液の15ミリリットルで脊髄を置きます。
    2. ヒドロゲル溶液の10ミリリットルを削除し、5ミリリットルチューブに脊髄セグメントを有する液の残りを注ぎます。それは完全に一杯になるまでヒドロゲル溶液で5 mlのチューブを埋めます。
    3. 5ミリリットルチューブの上にパラフィルムの小片をストレッチした後、チューブの首にパラフィルム包みます。注：パラフィルムの接点ヒドロゲル溶液を確認し、ヒドロゲル溶液と、パラフィルムの間に気泡が存在しません。
    4. 37で5ミリリットルチューブを入れて  °Cのオーブンで一晩。それがゲルになるまでヒドロゲル溶液を観察します。
    5. オーブンから5ミリリットルチューブを取り、（そのようなシャベル1ミリリットルピペットチップなど）スパナでチューブからゲルを削除します。ゲルに粗い組織を貼り付けることにより、脊髄組織からゲルを外し、（ゲルは組織に固執するため、組織によって削除されます）離れ粗い組織を取ります。
    6. 脊髄組織からゲルを除去した後、シェーカー上で24時間、1×PBS（pH7.4）で脊髄を4回洗浄します。
    7. 3.85グラムの尿素3.85グラムのN、N、N '、N'-テトラキス（2-ヒドロキシプロピル）ethylenediamを溶解することによりキュービック透明溶液を調製します5.38ミリリットルの蒸留水にINE。
      注：ホットスターラーが使用されています。それは明確であり、室温にまで冷却後に溶液に、2.31グラムのポリエチレングリコールモノ-P-イソオクチルフェニルエーテル/トリトンX-100を追加します。
      注：これらの3化学物質の10グラムは1マウス用です。
    8. かみそりの刃で2〜3ミリメートル長いセグメントに冠状にマウスの脊髄を切り取り、上記CUBICクリア溶液5mlに入れて。 37のオーブンでシェーカー上に置き  3日間Cを°。
    9. 3日後、新鮮なものに決済ソリューションを変更します。注：上記溶液は使用前に調製されます。
    10. 2〜3日後にCUBIC決済ソリューションをリフレッシュした後、フォント8文字で紙に対する組織の透明性を確認してください。それが透明である場合、文字がクリア組織を通して見ることができます。 （0.1％のTriton-X100）は、組織を1日4回（6時間ごと）を洗浄するためにクリア溶液を除去し、PBSTで4ミリリットルを追加します。

2。免疫蛍光染色

  1. 37℃のオーブンでシェーカー上で3日間：一次抗体溶液中の脊髄セグメントをインキュベート（PBSTで100抗セロトニンは、ウサギで育った、1に希釈しました）。
  2. 抗体溶液を除去し、37℃のオーブンで脊髄セグメントを1日4回（各6時間）を洗浄するためにPBST（0.1％のTriton-X100）の4ミリリットルを追加します。
  3. PBST溶液を除去し、二次抗体溶液を加える（594結合ヤギ抗ウサギIgG、1希釈：PBSTで100）を37℃のオーブン中でシェーカー上で3日間組織をインキュベートします。
  4. 二次抗体溶液を除去し、37℃のオーブンでシェーカー上脊髄セグメントを1日4回（6時間ごと）を洗浄するためにPBSTの4ミリリットルを追加します。翌日、組織は、イメージングのための準備ができています。

3.イメージング

  1. PBST溶液を除去し、さらには組織の屈折率を作るために85％グリセロールの4ミリリットルを追加します。
  2. は組織の透明性を確認してください。それは約1時間で明らかになると、マルチフォト蛍光顕微鏡の保持枠に適合する大、薄いガラススライド上に組織を置きます。
  3. 次の脊髄組織に85％グリセロールの数滴を入れて、22×50mmの2カバースリップガラスでそれをカバースリップ。
    注意：脊髄の向きは、画像がどのように見えるかを決定します。
  4. 多光子蛍光顕微鏡の保持枠の上にスライドガラスを入れて、光経路に組織を動かします。
  5. ヘリウムネオンレーザライン594 nmのを選択して、ライブ画像に正の信号の輝度をチェックして、最適なレベルにレーザーの強度を調整します。
  6. （水中、NA 0.7）20Xの対物レンズを用いて脊髄組織の走査領域を選択し、zスタックを作成するための準備、および3μmと各ステップの深さ。
  7. 20XのOBJEC下zスタックの上から下に組織をスキャン的と（油中、NA 1.4）を63Xの対物レンズをそれぞれ、（ステップサイズは1μmでした）。 3Dソフトウェア28を使用して3D映像を再構成します。

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結果

このセクションでは、CLARITY立方プロトコルの組み合わせを使用して、透明なマウスの脊髄におけるセロトニン抗体染色の結果を示します。私たちは、セロトニン作動性繊維は（もビデオ1参照、 図1）前角の腹の部分で優勢で脊髄の全ての薄層に存在していることを示しています。対照組織は陽性線維（結果は表示されませんでした）を持っていませんでした。前角では、高密度に充填されたセロトニン作動性繊維は前角の腹内側部分に存在していると、彼らは前角の外側部に向かって延びている（ 図2、またビデオ2を参照）。いくつかの免疫陽性繊維はまた、背角または中心管に向かって前角から延びています。免疫陽性繊維は、後角の全ての薄層中に存在しているが、正の薄層2中の繊維と4の間に小さな隙間があり、特に横で脊髄後角の一部。後角におけるセロトニン線維の大部分は小さい直径のものであり、それらのほんの数が大径（ ビデオ1）です。水平断面において、前角に...

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ディスカッション

プロトコルを組み合わせCLARITYとCUBIC技術を用いてマウスの脊髄における画像セロトニン作動性繊維にどのようにショーを説明しました。これは、チャンら 14およびさまら 15によって開発された受動的な決済プロトコルに比べて速くクリア処理を紹介し、脊髄組織が ​​うまくクリア時にヒドロゲルによってサポートすることができます。

チャンら 14およびさまらによって報告されているように、マウスの脊髄の固定、中に重要なステップ。15は 、化学物質の重合を防止する、すべての溶液を氷上で冷静さを保つことです。他の重要なステップは、神経組織の膨潤を回避するために、ヒドロゲル溶液でゆっくりとマウスを灌流することです。ヒドロゲル溶液がゲルになるためには、脱気が必要とされます。これに代わるものとして、我々は、チューブの上部をカバーするためにパラフィルムを使用し、HYDとの間に気泡が残っていませんrogelソリューションとパラ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、Australian Research Council Centre of Excellence for Integrative Brain Function (ARC Centre Grant CE140100007), an NHMRC project grant (#1086643) の支援を受けました。George Paxinos 教授は、NHMRC の上級主任研究員の助成金 (#1043626) の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
光開始剤 VA044和光VA-044/225-02111
http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm 40% アクリルアミド溶液Bio Rad161-0140http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis SolutionBio Rad161-0142http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879C-4D63-BA0B-82556A0CCF1D
パラホルムアルデヒドシグマ158127http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU
尿素メルクMillipore66612http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N',N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamineMerck Millipore821940http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100Merck Millipore648462http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sucroseSigmaS0389http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU
セロトニン抗体Merck MilliporeAB938http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
ヤギ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor® 594 conjugateLife Technologies A-11012https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
多光子顕微鏡ライカTCS SP5 MP STEDhttp://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/

参考文献

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