不死化多能耳の前駆細胞に分化を開始

サマリー

不死化多能性耳前駆細胞(iMOP)細胞と耳分化を維持するための現在のプロトコルが説明されています。 感覚上皮ニューロンと螺旋神経節ニューロン(SGN)への分化を示す培養条件と分子マーカーが強調表示されています。

要約

細胞置換療法のためのヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）または胚性幹細胞））の使用は大きな期待を秘めています。低収率や分化細胞の不均一な集団など、いくつかの制限が幹細胞治療の進行を妨げています。内耳細胞置換療法のための多数の機能有毛細胞およびらせん神経節ニューロン(SGN)の効率的な分化を促進するために、運命制限不死化多能性耳前駆細胞(iMOP)細胞株を作製しました。単一iMOP細胞の解離培養から始めて、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)の離脱による細胞周期の終了と分化を促進するプロトコールが記載されました。bFGF離脱後の増殖細胞の有意な減少は、EdU細胞増殖アッセイを用いて確認されました。増殖の減少に伴って、分化が成功すると、分子マーカーの発現と形態学的変化がもたらされました。iMOP由来耳球におけるCdkn1b(p27KIP)およびCdh1(E-カドヘリン)の免疫染色を内耳感覚上皮への分化の指標として用い、Cdkn1bおよびTubb3(ニューロンβ-チューブリン)の免疫染色を用いてiMOP由来ニューロンを同定した。iMOP細胞の使用は、内耳神経感覚前駆細胞による細胞運命決定を理解するための重要なツールを提供し、多数のiPS細胞またはESC由来の有毛細胞およびSGNを生成するためのプロトコルの開発に役立ちます。これらの方法は、補充療法のための耳細胞を生成するための取り組みを加速させます。

概要

内耳の器官、蝸牛、卵形嚢、球形嚢、および3つの半規管は、聴覚とバランスをとる能力を媒介します。蝸牛内では、有毛細胞が音を電気信号に変換し、それが螺旋神経節ニューロン(SGN)に中継されます。 SGNは活動電位を発射して、聴覚回路を通じて神経信号を伝播します。遺伝子変異、耳毒性薬、大きな音への曝露は、有毛細胞とSGNの死に寄与し、難聴を引き起こします^1-4。 これらのセルは一度失われると、置き換えられません。iPS細胞とESCを使用して新生有毛細胞またはSGNを生成することは、内耳細胞置換療法に大きな期待が寄せられています^5-8。多能性幹細胞と内耳由来の祖先細胞は、成熟のさまざまな段階で有毛細胞とSGNに分化できることが、目まぐるしく進歩しています。哺乳類胚性幹細胞(ESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)は、機能的な有毛細胞およびSGNを生成するために使用できます^9-11。哺乳類の内耳に由来する幹細胞および前駆細胞も、in vivo細胞対応物^12-16の特性を持つ有毛細胞およびニューロンを形成することが示されている。

失われた有毛細胞とSGNを置き換えるためにiPS細胞またはESC由来の耳前駆細胞を使用するには、効率的な分化が必要です。内耳における接ぎ木された茎由来前駆細胞の不適切な分化または継続的な増殖は、内耳機能を悪化させ、内耳における奇形腫形成などの腫瘍形成リスクをもたらす可能性がある¹⁷。培養条件を開発し、耳前駆細胞の分化を理解することが明らかに必要です。これらの方法を開発する際の1つの戦略は、内耳の発達中に神経感覚前駆細胞によって行われた細胞運命の決定を再現することです。増殖を防ぎ、耳前駆細胞を有毛細胞またはSGNに誘導するプロトコルは、補充療法の安全性と有効性を向上させるのに役立ちます。

発達中、内耳は菱形5と6の間の制限領域で表面外胚葉が肥厚し、耳のプラコードとなることから始まります。耳プラコードが陥入して耳カップを形成すると、耳カップの前部領域にある細胞の集合体が、内耳の有毛細胞とニューロンの前駆体を含む神経感覚コンピテントドメイン(NSD)を生じさせる¹⁸。 内耳を発達させるマウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュの運命マッピング研究は、感覚有毛細胞、周囲の支持細胞、および耳ニューロン^19-22を生じさせる神経感覚前駆細胞の複数の集団を示唆しています。高移動度基転写因子Sox2は、感覚細胞の仕様に関与しており、内耳前駆細胞のマーカーとして使用されている^23,24。 内耳のSox2発現レベルを低下させる低型変異は、蝸牛の有毛細胞、支持細胞、およびSGNの喪失をもたらす^25,26。

細胞運命決定を受けている耳前駆細胞を研究するために、Sox2発現蝸牛前駆細胞由来の不死化多能性耳前駆細胞(iMOP)細胞株が以前に確立されました。iMOP細胞はもともと胚のE12.5-13.5蝸牛に由来し、c-Mycレトロウイルスに感染していました²⁷.iMOP細胞は、耳球として知られるコロニー形成細胞として継続的に増殖し、有毛細胞、支持細胞、およびSGNに分化する能力を持っています²⁷。iMOP細胞が異なる耳系譜に分化する能力を理解することで、これらの知見をiPS細胞またはESC由来の有毛細胞およびSGNを効率的に生成するための応用が可能になります。in vitro細胞培養による耳細胞の作製における重要な課題は、細胞が分化しているかどうかを判断するのに役立つ分化マーカーを持つことです。Cdkn1b(p27^KIP)は、内耳の発達における分化の初期マーカーとして広く使用されてきましたが、iMOP細胞におけるCdkn1bの発現とそれが分化にどのように関連しているかについては対処されていません。 本研究では、現在の培養条件と、Cdkn1bの発現がiMOP分化の他のマーカーとどのように相関しているかについて説明します。

プロトコル

1. IMOP細胞における自己再生を維持

1. DMEM / F12、1X B27サプリメント、25 / mlのカルベニシリンおよび20 ng / mlのbFGF：培養培地をiMOP準備します。無菌の試薬を用いてiMOP培養培地50mlをしてください。 37℃の水浴中で50ミリリットルコニカルにDMEM / F12の49ミリリットルをウォームアップ。
   1. 解凍50X B27サプリメント、37℃の水浴中で5分間、フィルター滅菌し100 mg / mlのカルベニシリンアリコート。 RTで100μg/ mlのbFGFのアリコートを解凍します。 DMEM / F12には100μg/ mlのbFGFの1ミリリットル50X B27、10μLおよび100 mg / mlのカルベニシリンの12.5μLを追加します。
2. 培養iMOP細胞を60 mm組織培養皿内のメディアの3ミリリットルを使用してください。メディアの容量を倍にして、一日おきに培養物に新鮮な培地を追加します。 bFGFのその濃度が5 ng / mlで以下に低下しないことを確認してください。
   1. 5の後、5％のCO ₂継代細胞と37℃で培養iMOP細胞-培養7日以下の手順に記載されています。 15に転送する文化10 mlピペットチップを用いmLコニカル。
3. HBSS 50mlに0.5MのEDTA pH8.0の0.1mlの希釈してHBSS中1mMのEDTAを行います。プレ暖かい1mMのEDTA、37℃の水浴中でHBSSで作ら。
4. 5分間200×gで重力沈降または遠心分離によって細胞を回収。 RTで。 10分 - 重力沈降のために、5、37℃のインキュベーターで培養液を含む15ミリリットルの円錐を配置します。その時間の後、otospheresを観察し、15 mLコニカルの底に集めます。
   注：過度の遠心力は、細胞の損傷を引き起こす可能性があります。
5. 慎重に吸引細胞ペレットを乱すことなく、ピペットを吸引2ミリリットルを使用してメディアを過ごしました。細胞ペレットに予め温めておいた1mMのEDTAのHBSS溶液0.5mlを追加します。 P1000ピペットを使用して、静かにアップピペット上下2から3回。 37℃の円錐形を置き、単一細胞に解離を促進するために、<5分間インキュベートします。
6. 穏やかotospheresが解離しているかどうかを決定するために細胞溶液を渦。おと場合球は、細胞が解離され、円錐形の底に沈殿します。インキュベーションの時間が異なる場合があります。
   注：EDTAで長時間のインキュベーションは、過剰な細胞死をもたらすでしょう。
7. 37°Cから細胞を取り出し、EDTAを中和し、希釈するために、メディアの2ミリリットルを追加します。室温で5分間、200×gでの遠心分離によって細胞を収集します。吸引除去が出て2ミリリットル吸引ピペットを用いて、細胞を洗浄するために1×PBSの5ミリリットルを追加し、EDTAを希釈しました。
8. 室温で5分間、200×gで細胞をスピンダウンし、2ミリリットル吸引ピペットを用いて1×PBSを吸引除去します。 3回 - 優しくピペッティングと2ダウンによってiMOP培養培地0.5mlにP1000ピペットを用いて細胞を再懸濁します。
9. 適切なカセット²⁸とマイクロ流体パーティクルカウンターを用いて細胞を数えます。 iMOP細胞のコンフルエントプレートが〜6 X10 ^{6個の細胞}が含まれています。細胞1希釈：メディアで100を計数するためのカセットに細胞溶液75μlのを追加します。プレートiMOP cultu 6cmの皿で1×10 ^{6個の細胞}メディア再（〜1：10希釈）。通路iMOPsごとに5から7日間。
   注：大otospheresを形成するか、または組織培養皿の底に付着した細胞は、分化します。培養がコンフルエントを超えている場合に細胞も死んでしまいます。

2.凍結融解IMOP細胞

1. 解凍と凍結前の細胞に4℃の解決策を平衡化することにより合成凍結媒体を準備します。
2. iMOP細胞のコンフルエントに6cm皿から細胞を収集します。 15ミリリットルコニカルに- （8×10 ^{6個の細胞} 〜6）10 mlピペットと転送細胞を使用してください。
3. 室温で5分間、200×gで重力沈降または遠心分離によって細胞を回収。 otospheresが小さい場合、細胞は重力沈降により決済することはありません。オプション：総細胞数を決定するためにステップ1.9を用いて細胞を数えます。
4. 背後に緩い細胞ペレットを残しながら吸引し、ピペットを吸引2ミリリットルを使用してメディアを過ごしました。
5. CEを再懸濁し、合成凍結メディアの0.25ミリリットルを追加約5×10 ^5〜6×10 3細胞/ mlの密度でLLS。ゆっくりP1000ピペットで細胞をピペット。先端を濾過した1 mlのP1000ピペットを用いて、低温バイアルに細胞懸濁液を転送します。
6. アルコールフリーの冷凍コンテナにバイアルを置き、温度に到達するまで-80℃〜毎分温度1℃を減らすために-80℃で凍結コンテナを配置します。
7. 細胞の長期保存のために、液体窒素貯蔵タンクの気相へのバイアルを移します。培養のための細胞を解凍するには、-80℃で凍結した細胞を含む低温バイアルを平衡化。
8. 37℃の水槽で予備iMOP暖かい培養培地。
9. 37℃の水浴中で、バイアルの底に旋回することによって、迅速凍結バイアルを解凍します。最後の氷の結晶が消えたら、解凍した細胞にiMOP予め温めておいた培地の1ミリリットルを追加します。転送15mLの円錐形への細胞とiMOP培養培地の追加の4ミリリットルを追加
10. 15ミリリットルの共同スピン5分間nical。 200×gで使用済み培地を吸引し、。 6 10cmディッシュにiMOP培地プレート細胞の2ml中の細胞を再懸濁。拡張のため_、5％CO 2で37℃で培養物をインキュベートします。

3.感覚上皮にIMOP細胞を分化

1. DMEM / F12、1X B27サプリメント、25 / mlのカルベニシリン：iMOP感覚上皮の分化培地50mlのを準備します。 iMOP感覚上皮の分化培地50mlのを行います。 37℃の水浴中で50ミリリットルコニカルにDMEM / F12の49ミリリットルをウォームアップ。解凍50XのB27サプリメントと5分間100 mg / mlのカルベニシリンアリコート。 37℃の水浴中で。 1ミリリットル50X B27およびDMEM / F12に100 mg / mlのカルベニシリンの12.5μLを追加します。
2. 、収穫解離、再懸濁し、細胞をカウントする手順1.4から1.9を繰り返します
3. 3日目の培地を使用してiMOPで6センチディッシュでプレート1×10 ^{6個の細胞} 。 0日目に、転送培養を15mlコニカルに10 mlのピ​​ペットを用いて。 OTOの収集ステップ1.6で述べたように、重力沈降による球。吸引除去が出ピペットを吸引2ミリリットルを使用してメディアを過ごし、円錐形の底にotospheresを残します。
4. そっと感覚上皮の分化培地2mlに追加します。大口径10ミリリットルピペットを用いてを6cmディッシュに転送otospheres。
   注：過酷なピペッティングから機械的せん断がotospheresから細胞を解離することができます。
5. 一日おきに培養物に新鮮な感覚上皮分化培地2 mlを加え。必要に応じて、細胞は、重力沈降によって収集することができ、メディアを交換。
6. 円錐15ミリリットルに転送しotospheresが述べたようにピペットを吸引2ミリリットルを使用して、ステップ1.6.Aspirateで使用済み培地を沈降し、邪魔されずotospheresを残すようにすることによって10日目でotospheresを収集します。
7. 室温で15分間、1×PBS中の4％ホルムアルデヒド中でインキュベートすることによりotospheresを修正。 、ホルムアルデヒド溶液を除去し、洗浄緩衝液（1×PBS、0.1％トリトンX-10を含有するotospheres洗います0）をブロッキング緩衝液中でインキュベートする前に、（1×PBS、10％正常ヤギ血清で1時間、0.1％トリトンX-100）を含みます。
   1. バッファーを交換し、希釈した抗体をブロッキング緩衝液でサンプルをインキュベートします。 4℃でインキュベートします。 1X PBSで洗浄サンプルは^、27の免疫染色を、0.1％トリトンX-100の対象にotosphereを含みます。 P1000ピペットを用いてガラススライド上にメディアをマウントに1×PBSに転送otospheresと場所のotospheres。サンプルの上にカバースリップを置き、取り付けメディアは4℃で乾燥させます。
8. 16ビットのCCDカメラを搭載した倒立顕微鏡のセットアップおよび20X 0.75空気または40X 1.3 NA油浸対物レンズのいずれかを使用して、エピ蛍光画像を取得します。ブルー（377±25 nmで/ 447±30 nm）で、グリーン（475±25 nmで/ 540±25 nm）の赤（562±20nmで/ 625：記載されている（励起および発光）の波長を使用して、異なるカラーチャネルからの蛍光を収集20nmの）及び赤外線（628±20nmの/および692±20±NM）。

4.アッセイするEDU設立

1. 3日目に、プレート6 10cmディッシュ中、1×10 ⁶ iMOP細胞。三日後0日、収穫、解離、再懸濁し、ステップ1.4から1.9を繰り返して細胞をカウントします。
2. プレートiMOP培養培地中2.5×10 ^{5個の細胞}と6ウェル皿の異なるウェルにおける感覚上皮の分化培地中の5×10 ^5細胞 。
3. EDU取り込みアッセイを使用して、3日目にEDU取り込みによってS期の細胞の割合を決定します
   1. 培地に1μMのEDUの最終濃度を得るためにiMOP培養物に直接EDUの株式を追加します。
   2. 2時間iMOP培養でEDUをインキュベートし_、5％CO 2で37℃でインキュベートします。収穫は、解離し、収集した細胞は、手順1.4から1.9を繰り返します。 15分間、1X PBS中4％ホルムアルデヒド中で加えます。室温で細胞を固定します。室温で5分間、200×gで遠心分離により細胞を回収。ホルムアルデヒド溶液とproperlを削除yは廃棄してください。
   3. ラベルヘキストでの細胞の核とは、製造業者のプロトコルに従って、緑色蛍光色素アジドとEDUを組み込みました。
      注：すべての洗浄は1×PBS、二回1×PBSで3％BSAおよび0.1％のTween 20洗浄細胞を用いて行われます。
   4. 退色防止試薬を用いてスライド上のマウント細胞およびサンプルの上に1.5カバーガラスを配置します。落射蛍光顕微鏡を用いて標識された細胞の蛍光画像を取得します。

5. IMOP由来ニューロンの区別

1. 神経基本培地、1X B27サプリメント、2mMのL-グルタミン：神経分化培地50mlのを行います。 5分間37℃の水浴中で50X B27と200mMのL-グルタミンの解凍ボトル。神経基本培地48.5 mlに1ミリリットル50X B27 0.5mlの200mMのL-グルタミンを追加します。
2. 滅菌10cmプレートでラウンド12ミリメートル1.5カバーガラスを配置し、滅菌し、カバーガラスをきれいにするためにプレートに70％エタノールを加えることにより、コートカバーガラス。
3. 静かな入り江を攪拌彼らはエタノールでカバーされていることを確認するrslips。 RTで10分間プレートを残します。残りのエタノールを洗い流すために、滅菌1X PBSでカバーグラスを3回すすいでください。残りの1×PBSを洗い流すための滅菌_H 2 Oで一回カバースリップをすすぎます。
4. ピペットを吸引2ミリリットルを使用して_、H 2 Oを吸引除去し、カバーガラスを乾燥させ。 15分間組織培養フード中でUV光にカバースリップを公開。すぐに使用しない場合、Storeは、無菌環境でカバースリップ。
5. 24ウェルディッシュの各ウェルに1 12ミリメートルラウンドカバーガラスを配置します。カバーガラスは、ウェルの底に平らにすることを確実にするために静かにプレートを振ります。
6. 2ミリグラム/ RTでmlのポリ-D-リシンストック溶液を解凍し、1×PBS中10μg/ mlのポリ-D-リジン濃度に希釈します。 10 UG / mlのポリ-D-リジン0.25mlのウェルに追加します。 1時間37℃のインキュベーター内でプレートを残します。
7. 滅菌1×PBSでウェルを3回洗浄します。室温で10 mg / mlのラミニンストック溶液を、融解を10μg/ mの希釈1×PBSでリットル。 24マルチウェルディッシュの1ウェルに作業溶液を10μg/ mlのラミニンの0.25ミリリットルを追加します。 37℃のインキュベーターでプレートをインキュベートします。 2ミリリットル吸引ピペットを用いてラミニン液を吸引します。
8. P1000ピペットを用いて1×PBS 1 mlに添加して、ピペットを吸引2mlで吸引することにより、1×PBSを除去することにより、カバーガラスを1×PBSで3回洗浄します。細胞は、めっきされる準備が整うまで、ウェル中の最後の洗浄から1×PBSを残します。解離と3日目に6センチの皿に段階的に1.4-1.9.Plate 1×10 ^{6個の細胞}を、細胞をカウント、収穫により神経分化を開始します。
9. 0日、収穫には、解離して1.4から1.9を繰り返して細胞をカウントします。 24マルチウェルディッシュで1.5×10 0.5ミリリットルに⁵ iMOP細胞ウェルあたり予め温め神経分化メディア-シード1×10 ^5。吸引し、一日おきに培養物に予熱した神経分化培地を追加します。
10. 15分間4％ホルムアルデヒドでiMOP由来の神経細胞を固定してください。 AT RT 7日目削除ホルムアルデヒド溶液に、洗浄緩衝液でiMOP由来の神経細胞を洗浄し、ブロッキング緩衝液中でインキュベートする前に、（1×PBS、0.1％トリトンX-100を含む）（1×PBS、10％正常ヤギ血清および0.1％トリトンX-100） 1時間。
    1. バッファーを交換し、希釈した抗体をブロッキング緩衝液でサンプルをインキュベートします。 4℃でインキュベートします。 1X PBS、0.1％トリトンX-100を被験者の細胞を含有する洗浄サンプル^27を免疫染色します。マウントメディアに配置する前に、1×PBSでカバーガラスを洗ってください。マウントメディアはステップ3.8に記載されているエピ蛍光画像を取得する前に、4℃で乾燥することができます。

結果

IMOP細胞におけるbFGFの撤退下げます増殖

iMOP細胞の増殖能を減少させ、iMOP細胞の分化を開始するには、bFGFを培地から取り出しました。成長因子の離脱が増殖を減少させることを確認するために、EDUの取り込みを増殖アッセイとして使用しました。 （bFGFを含まない）iMOP培地（bFGFを含有）と感覚上皮培地で培養otospheresと共に培養otospheresからEDUを組み入れた細胞の割合を比較しました。 Otosphere培養物を回収し、固定し、ヌクレオチドアナログEDUでパルスしました。株式会社EDUヌクレオチドは、蛍光のAlexaFluor 488アジがクリック化学を用いて標識しました。 bFGFの不在下で増殖させたotospheresからの細胞は、bFGF（ 図1A-F）を用いて培養細胞にEDUの相対的な取り込みの減少を示しました。サイズOなどotosphe...

ディスカッション

IMOP培養のモニタリング

自己再生を維持し、新規iMOP細胞株の分化を促進するためのプロトコルが記載されており、付加的なめっきフォーマット（表1）に含まれています。日常的拡大とiMOP細胞の分化に役立ついくつかの重要なステップが記載されています。多能性幹細胞培養と同様に、iMOP細胞は、理論的に無限の寿命を有します。細胞株が適切に維持されることを保証するために、iMOP培養物を定期的に細胞の生存、自己複製と分化能のために監視されます。解離後の細胞の生存率を決定するために、我々は、トリパンブルー染色を使用しています。一般的には、細胞の70％以上が解離した後に生存しています。 iMOP細胞内で自己複製を監視するには、C-MycおよびSox2の抗体を用いて免疫染色することは行われています。増殖培養条件の下では、iMOP細胞は〜18時間の倍加時間を持っています。行うか、自己再生マーカーの発現の変化時間をubling変更された自己複製の可能性の指標です。 iMOP細胞、感覚上皮細胞または...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CoolCell LX アルコールフリー細胞凍結容器	BioCision	BCS-405
極低温バイアル (2 ml)	コーニング	430654
1.5 厚さガラスカバースリップ (丸型 12 mm)	電子顕微鏡科学	72230-01
DMEM/F12	ライフテクノロジー	ズ 11320-082
ニューロベース ミディアムライフ	テクノロジー	ズ 21103
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) pH 7.4	ライフテクノロジー	ズ 10010-023
ハンクスバランス塩溶液(HBSS)	Life Technologies	14025-092
B27サプリメント(50X)無血清	Life Technologies	17504-044	1 mlアリコートとして保存
L-グルタミン(200 mM)	Life Technologies	25030-081	mlアリコートとして保存
Natural Mouse Laminin	Life Technologies	23017-015	1 mg/mLアリコートとして保存
Click-iT EdU Alexa Fluor 488	ライフ	テクノロジーC10337
Synth-A-凍結凍結保存メディア	ライフテクノロジー	ズA12542-01
Prolong Gold Antifade Mountant	Life Technologies	47743-736	10 mg / ml 100 & micro;l aliquots
Moxi Z Mini 自動セルカウンター	Orflo	MXZ001
Moxi Z カセット Type S	オルフロー	MXC002
組換えマウス線維芽細胞成長因子、塩基性 (bFGF)	Peprotech	450-33	H20 の 0.1% BSA に再懸濁し、20 mg/ml アリコートとして保存
Poly-D-Lysine	Sigma	P7886	1X PBS に再懸濁し、10 mg/ml 100 µl アリコート
カルベニシリン、二ナトリウム塩	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP2648-1	10 mM Hepes pH 7.4 に再懸濁し、100 mg/ml アリコートとして保存
5 ml ピペット個別包装ペーパーバック (200/ケース)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	1367811D
10 ml ピペット個別包装ペーパーバック (200/ケース)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	1367811E
組織培養処理バイオライト 24ウェルプレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	130188
組織培養処理バイオライト 6ウェルプレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	130184
組織培養処理済み6cmディッシュ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	130181
EMD Millipore Millex 滅菌シリンジ PVDF フィルター 細孔サイズ: 0.22 μm	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SLGV033RS
TipOne フィルターピペットチップ 0.1 - 10 μl 細長いフィルターチップ	USA Scientific	1120-3810
TipOne フィルターピペットチップ 1 - 20 μl フィルターチップ	USA Scientific	1120-1810
TipOne フィルターピペットチップ 1 - 200 μl フィルターチップ	USA Scientific	1120-8810
TipOne フィルターピペットチップ 101 - 1000 μl フィルターチップ	USA Scientific	1126-7810
15 ml コニカルチューブ 滅菌 25 チューブ (500 チューブ) 20 袋 USA	サイエンティフィ	1475-0511
50 ml コニカルチューブ 滅菌 25 チューブ (500 チューブ)USA	Scientific	1500-1211