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方法論記事

管理と分散研究のための節足動物にプロテインマークを検出

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DOI：

10.3791/53693

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2016年1月28日

 , 
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

この記事について

サマリー

タンパク質は、分散研究のために節足動物をマークするためによく使用されます。節足動物に内部および外部のタンパク質マークを投与する方法が実証されています。間接的またはサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によるタンパク質マーク検出技術も示されています。

要約

節足動物の動きを監視することは、多くの場合、よりよい関連する人口動態、分散パターン、宿主植物の環境、およびその他の生態系の相互作用を理解するために必要です。節足動物は、通常、分散能力を決定するために、時間と空間の上にそれらをユニークなマークでそれらをタグ付けし、その後再収集することにより、自然の中で追跡されます。そのような着色埃や塗料などの実際の物理的なタグに加えて、タンパク質の様々なタイプの生態研究の節足動物をマーキングするための非常に効果的であることが証明されています。タンパク質は、内部および/または外部から投与することができます。タンパク質は、その後、タンパク質に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって奪還節足動物に検出することができます。ここでは、外部と内部のタンパク質と節足動物をタグ付けするためのプロトコルについて説明します。 2つの単純な実験例が示されています。タンパク質が豊富な食事を提供することで、昆虫に導入​​（1）内部のタンパク質マークと（2）外部のタンパク質マーク局所医療ネブライザーを用いて、昆虫にpplied。それから、サンドイッチや昆虫タンパク質にマークを検出するために使用される間接的なELISA法を順を追って説明を関連付けます。このデモでは、マーク・リリース・再捕獲、マーク・キャプチャ、および研究の自己マークキャプチャー・タイプの節足動物の取得及びタンパク質マーカーの検出の様々な側面は、免疫標識手順がされているさまざまな方法と一緒に、議論されています研究目的の多種多様に合うように適合されます。

概要

節足動物害虫、天敵（寄生蜂と捕食者）、そして自然の中で花粉媒介の動きを追跡することは、生態系サービスを改善するための方法をより良く理解するために不可欠です。分散研究のほとんどのタイプのための重要な構成要素は、関心の節足動物（複数可）をタグ付けするための信頼できる方法を有しています。様々な材料（例えば、塗料、染料、着色粉剤、タグ、希少元素、タンパク質）は、それらの個体群動態、分散能力、摂食行動、及び他の生態系の相互作用を評価するために、1,2-節足動物をマークするために使用されています。

任意の分散研究のために使用されるマーカーの妥当性は、行われている研究の種類に依存することになります。 （1）マーク・リリース・再捕獲（MRR）、（2）マーク・キャプチャー、および（3）自己マークキャプチャ：節足動物をマーキングするための3つの広範な分類があります。マーク・リリース・再捕獲調査のために、研究者は一般的にlaboratoに一括して節足動物をマークRYとフィールドの中心点でそれらを解放します。節足動物は、異なる収集装置（例えば、掃引ネット、真空、粘着トラップ）3,4,5を用いて様々な空間的および時間的間隔で再捕獲されています。奪還の標本は、その後ネイティブ個人から解放区別するために、特定のマークを調べます。マーク捕獲調査のために、研究者は通常、噴霧装置（例えば、バックパック噴霧器、ブーム及びノズル噴霧器）を使用して、フィールドに直接マークを適用します。マーク・キャプチャ研究のための最善のマーカーは、安価であり、容易に節足動物の生息地に適用されます。自己マーク捕獲調査のために、研究者は通常、節足動物の餌6,7または巣の入り口8にマークを適用します。ターンでは、節足動物は、巣を出るときにマークアップに対する「ブラッシング」でマークされた餌または外部をむさぼり食うことにより、内部で自身をマーク。

前述したように、マーカーの多くの種類は、私たちがしていますedは節足動物の種の多様性をタグ付けします。しかし、非常に少数のは、これらの分散の研究カテゴリーのすべての3のために有用です。タンパク質の免疫標識法の開発は、昆虫をマークするための主要なブレークスルーでした。免疫標識は、内部または外部節足動物にタンパク質標識を置​​くれ、次に、抗タンパク質特異的酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって検出されます。使用された最初のようなタンパク質マーカーは、ウサギ免疫グロブリン（IgGの）およびニワトリのIgG / IgYの9,10ました。彼らは（説明を参照してください）​​MRRと自己マークキャプチャー・研究のための非常に有効なマークであることが判明しました。残念ながら、IgGの/ IgYのタンパク質は高価であり、したがって、マーク・キャプチャ・研究と自己マーク捕獲調査のほとんどのタイプのための実用的ではありません。続いて、第2世代のタンパク質検出ELISAは鶏卵の白身（アルブミン）、牛乳（カゼイン）と豆乳（トリプシンインヒビタータンパク質）に含まれるタンパク質のために開発されました。各アッセイは、特異的、高感度であり、そして、最も重要なのは、はるかに安価のIgG / IgYのタンパク質11よりもタンパク質を使用しています。これらのタンパク質は、（議論を参照）MRR、マーク・キャプチャ、および自己マークキャプチャー・研究のための有効であることが判明しました。

この記事では、説明し、タンパク質マーク実験室での保持試験を実施する方法を示します。このような研究は、フィールド分散試験の任意のタイプのために必要な研究の第一段階です。具体的には、研究者はマークが前のフィールド分散の研究に着手をターゲットと節足動物の種に保持される時間の長さを知っていることが重要です。ここでは、説明し、内部と外部のMRRのための昆虫、マーク・キャプチャ、および自己マークキャプチャ型のフィールドスタディをマークする方法を示します。それから、間接的なサンドイッチELISA法でマークの存在を検出する方法を示します。

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プロトコル

1.内部マーク、保存、および検出手順

  1. 内部マーキング手順
    1. 人工飼料上またはフィールドから飼育実験室コロニーから（nは 100人を≈）関心の昆虫を集め、2きれいな飼育容器に分割します。
    2. コンテナのいずれかに、通常の20ミリリットルダイエットパケット（マークされていないネガティブコントロール治療）を配置します。 、1.0 mg / mlの鶏のIgG / IgYの溶液を1.0 mlの第20ミリリットル人工飼料パケットを補足完全に混合し、他の容器に入れてください。
      注意：利息の昆虫が人工飼料を持っていない場合、マークは上または、それらは通常（ 例えば 、緑豆、蛾の卵、水、砂糖、蜂蜜）に維持されるどんな食事に配置することができます。
    3. 昆虫が24時間のために彼らの摂食活動を再開できるようにします。
  2. 内部マーク保持手順
    1. 各容器からダイエットパケットを削除し、wは昆虫を供給実験（ 例えば、緑色の豆）の期間にわたって、それらを維持するために別の食料源番目。
    2. 毎日（または任意の所望の時間間隔で）、各処理からの虫のコホートを（N = 20）を収集し、-20℃で直ちに凍結します。
  3. サンドイッチELISA法
    1. 1希釈したウサギ抗ニワトリIgYを一次抗体50μlの追加：トリス500は、クリーン、ELISAマイクロプレートの各ウェルに生理食塩水（TBS）をバッファリングし、RT（ノートで1時間の最小インキュベート：マイクロプレートもインキュベートすることができるO 4℃/ N）。
    2. プレートから抗体を捨て、30分間1.0％脱脂粉乳溶液を300μlの各ウェルをブロックします。
    3. 前のインキュベーションステップを待っている間、TBS 1.0mlの1.6 mlマイクロチューブに個別に凍結昆虫を置きます。
    4. 十分に均質化されるまでクリーン乳棒で各昆虫を挽くし、ELISAの個々のウェルにそれぞれ100μlの試料を追加プレート。サンプルは、室温で1時間インキュベートすることを許可します。
    5. 各ELISAプレートの最初の列のウェルに100（TBS中卵白）負（TBSのみ）および陽性μlのコントロールを追加します。また、各プレートの最後の列の8ウェル（ 図1）に負の昆虫コントロール（マークされていない昆虫）の100μlを添加します。対照サンプルは、室温で1時間インキュベートすることを許可します。 図1に提供されるテンプレートは、私たちが標準化されたアッセイのために使用するテンプレートであることに注意してください。ウェル中の試料の配置は​​、研究者の裁量に任されています。
    6. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）-tweenで各ウェルを3回洗浄し、その後1に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したウサギ抗ニワトリIgGを/のIgYを50μl加える：1％ミルクの溶液中で10,000、室温で1時間インキュベートします。
    7. PBS-Tweenで各ウェルを3回洗浄し、各ウェルにテトラメチルベンジジン（TMB）基質の50μlを添加します。
    8. 10分後、ウェルを読みます650nmの波長に設定したマイクロプレート分光光度計です。

figure-protocol-1
典型的な96ウェルELISAマイクロプレートに使用される標準化された井戸の指定を示す図1の模式図は、各プレートは、トリス緩衝食塩水陰性対照（TBS）に捧げ7井戸、正のタンパク質制御（順位はCtrl）にも専用のが含まれています無印（負）昆虫コントロール専用の奪還虫（サンプル1 ... 80）、および8ウェルに専用の80個々のウェル（NegのCtrlキー1 ... 8）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2.外部マーク、保存、および検出手順

  1. 外部マーキング手順
    1. 興味の昆虫を集めて（nは ≈100実験室コロニーからか、フィールドと場所から個人）に直径2.5cmの穴を持つ2つの1.0リットルのプラスチック容器は、各容器の側面から打ち抜い。
    2. 医療噴霧器を使用してのdH 2 O（ネガティブコントロール治療）を1.0 mlの第一の容器内の昆虫をスプレーしてください。医療ネブライザーを用いて、ニワトリの卵白の5.0％の溶液1.0mlと第二の容器内の昆虫をスプレーしてください。
    3. 標準的な実験室の空気出口に噴霧器のホースを取り付け、その後、容器2.5cmの穴に噴霧器の口を挿入します。噴霧器は、蒸気を生成するまで、徐々に空気出口をオンにします。
    4. 卵白溶液は（約2-5分）に分配されるまで（マーキング）を噴霧し続けます。
    5. 噴霧器を取り外し、プラスチック容器の穴にコルクを配置します。ソリューションが完全に乾くまで昆虫は室温で放置します。
  2. 外部マーク保持手順
    1. マークへのさらなる露出を避けるために、別々の清潔な飼育容器に乾燥昆虫のそれぞれの処理を配置します。
    2. 研究の期間にわたって昆虫を維持するために清潔な容器に食料と水を追加します。
    3. 毎日、各処理から昆虫のコホート（N = 20）を収集し、-20℃で直ちに凍結します。
  3. 間接ELISA法
    1. 1.6ミリリットルのマイクロチューブに個別に凍結した昆虫を置き、TBSの1.0ミリリットルを追加します。
    2. 120 rpmでオービタルシェーカーセットで1時間サンプルを浸します。
    3. ステップ1.3.5で説明したようにネガティブとポジティブコントロールを追加します。
    4. 図1に示すように浸漬した後、新しい96ウェルELISAプレート上の80の指定サンプルウェルの一つに、各試料からの100μlのアリコートをピペットでサンプルを室温で1時間インキュベートすることを許可する（注：マイクロプレートにもすることができます4℃でO / N）インキュベートしました。
    5. でウェルを3回洗浄しその後、PBS-Tweenで、各ウェルに1％ウシ血清アルブミン（PBS-BSA）を含むリン酸緩衝生理食塩水300μLを加えます。
    6. 室温で30分後、PBS-Tweenで二回洗浄します。
    7. 各ウェルにPBS-BSA-シルウェット（0.05％）で8,000、室温で1時間インキュベート：1に希釈したウサギ抗卵アルブミン一次抗体50μlのを追加します。
    8. PBS-Tweenで各ウェルを3回洗浄し、その後1に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGを50μl加える。室温で1時間、PBS-BSA-のSilwet（0.05％）で2,000。
    9. PBS-Tweenで各ウェルを3回洗浄し、各ウェルにTMB基質の50μlを添加します。
    10. 10分後、650nmの波長で設定したマイクロプレート分光光度計を用いて井戸をお読みください。

3.データ分析

  1. 各ELISAプレート上の8陰性対照虫の平均吸光度値を計算して、あちこちにプールされた陰性対照に基づいて標準偏差を計算M与えられた研究12のELISAプレートのすべて。
  2. ELISA正の閾値を得るために、各ELISAプレートについて得られた平均値に6回プール標準偏差を加えます。この値以上の吸光度値を生じる任意の昆虫タンパク質サンプルはマークの存在について陽性であるとみなされます。

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結果

内部マーキング：

内部マーク保持試験の結果を図2Aに示されています。計算されたELISAクリティカルのしきい値は0.054でした。総合（すべての4つのサンプルの日付を合わせ）、タンパク質なしで処理された昆虫は一貫して低いELISA値（X = 0.038±0.002、N = 80）を得ました。逆に、昆虫のすべては、一貫して強いELISA値（X = 0.475±0.221、N = 80）を得た蛋白質に富む食餌を与え。

外部マーキング：

外部マー...

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ディスカッション

節足動物タンパク質の免疫標識手順は、最初の世紀前9のほぼ4分の1を説明しました。それ以来、手順が内部と外部の両方投与のIgG / IgYsを使用して、節足動物の多様な分散パターンを研究するために適応されています。これらのタンパク質は、これまでテストした昆虫種の多種多様な不動のマーカーを証明されています。しかしながら、上述したように、IgGの/ IgYsを使用するための主な制限は、それらが非常に高価であることです。その結果、IgGを/ IgYsのみ昆虫の大きなバッチが小さなスペースにマークすることができるか、マークが食事や餌に配合することができるMRRと自己マーキングタイプの研究に有用です。ここでは、内部のマークが鶏のIgG / IgYので強化された人工飼料昆虫ターゲットを供給することにより投与することができる方法の簡単なデモを提供しました。ターンでは、IgG / IgYを、サンドイッチELISAを用いて検出しました。このシステムは、すでに使用していることを研究者に特に有利であるかもしれませんアッセイは当然のIgG /のIgYを検出しますので、鶏の卵が含まれている食事は卵で見つかりました。さらに、IgGの/のIgYの...

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開示事項

本書の商号または市販製品の言及は、特定の情報を提供する目的のためだけであり、米国農務省による推薦または保証を意味するものではありません。 USDAは機会均等プロバイダーおよび雇用主です。

謝辞

資金は、農業・食品産業技術総合研究イニシアティブ競争グラントノーにより、部分的には、米国農務省CRIS 5347-22620-021-00Dによって提供されました。食糧農業のUSDA国立研究所から2011-67009-30141。私たちは、ジョアンナナシフの技術サポートのために感謝しています。また、 図3で使用される写真のいくつかを提供するためのポール・ベイカー、デビッド・ホートン、ディエゴ・ニエト、とフランシスSivakoffに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
食品保存容器(昆虫飼育用)ラバーメイド/タッパーウェア各種サイズ各種メーカー&ベンダーメッシュ生地は窓に接着されています
小容量ネブライザー(マイクロミスト)テレフレックスハドソンRCI1881オンラインおよび医療用品店で入手できます。他のブランドも同様に機能します。
微量遠心チューブ、1.6 ml、キャップ付きコンチネンタルラボプロダクツ4445.X同様のタイプであれば何でも機能します。私たちは、フタが開けやすいブランドを好みます。
微量遠心チューブ用発泡スチロール製収納ボックス(5×20グリッド)RPI株式会社145746このデザインはチューブが密集しないのでいいですね。
ディスペンサー、リピーターエッペンドルフ4982000322同様のものがあれば、ディスペンシングをスピードアップするのに役立ちます。
乳棒、プラスチック製の使い捨てティッシュグラインダー、1.5 mlKimble Chase749521-1500さまざまなベンダーで利用できます。乳棒は洗浄してオートクレーブ滅菌して再利用できます。
BD Falcon ELISAプレート、96ウェル(平底)BD351172
Ovationピペット、手動(20-200 µl)VistaLab1057-0200または1070-0200タイプで機能します。このモデルは人間工学的です。
リザーバー、滅菌試薬VistaLab4054-1000同様のものなら何でも機能します。
電動ピペット、8チャンネル(50-1,200 µl) (Biohit eLine)ザルトリウス730391電子モデルを1つ選ぶとしたら、このサイズが最も便利です。
電動ピペット、8チャンネル(10-300 & micro;l) (Biohit eLine)ザルトリウス730361似たようなものなら何でも動作します。
マニホールド、マルチウェルプレートワッシャー(8ポジション、ストレート)Sigma-AldrichZ369802 同様のものはすべて、手動プレート洗浄に機能します。
吸光度検出付きマイクロプレートリーダーMolecular DevicesSpectraMax 250似たようなものなら何でも使えます。
チキンIgG / IgY米国生物学的I1903-15R他のソースからも入手可能
白食料品店オールホワイト」、「」エッグビーター」、etc.5 mlを95 ml dH2Oと混ぜて5%溶液Tris
(Trizma Base)Sigma-AldrichT15032.42 g / LでTBS塩化
ナトリウム(NaClSigma-AldrichS988829.22 g / LでTBSと8.0を作る。g⁠/⁠PBS
リン酸ナトリウム二塩基性(Na2HPO4)Sigma-AldrichS08761.14 g / L PBS
リン酸カリウム一塩基性(KH2PO4)Sigma-AldrichP5655PBS用0.2 g / L
カリウム(KCl)Sigma-AldrichP9541PBS用0.2 g / L
Tween 20、 EIAグレードのSigma-AldrichP1379塩を溶解した後、PBSに1Lあたり0.5mlを加えます。
PBS with 1% BSASigma-AldrichP3688Mix 1 パケット in 1 L dH2
Anti-Chicken IgY (IgG) (全分子) 抗体 (1:500)Sigma-AldrichC6409Mix 100 µl 50 ml TBS
ドライミルク、粉ミルクまたはフレッシュミルク(1%)食料品店10 gを1 L dH2Oと混ぜる1%溶液
抗チキンIgY(IgG)(全分子)-ウサギで産生されたペルオキシダーゼ抗体(1:10,000)Sigma-AldrichA9046Mix 100 & micro;ウサギで産生された1%牛乳
抗鶏卵アルブミン抗体1 L中のl (1:8,000)Sigma-AldrichC6534Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000)Sigma-AldrichA61540.5 ml を 1 L PBS-BSA で希釈し、1.3 ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) シリコン-ポリエーテル共重合体Lehle SeedsVIS-01最後の成分として
TMB Microwell 1 成分ペルオキシダーゼ基質SurModicsTMBW-1000-01
同様の卵)を作る 塩化O を追加

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