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方法論記事

組織工学のためのアルギン酸微粒子と熱ゲルポリ（N-イソプロピルアクリルアミド） - グラフト - コンドロイチン硫酸複合材料の合成

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DOI:

10.3791/53704

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2016年10月26日

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1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

この記事について

サマリー

ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド） - グラフト - コンドロイチン硫酸からなる注射可能な組織工学足場は、（のPNIPAAm-G-CS）含有アルギン酸微粒子を調製しました。接着強度、膨潤性及び生体適合性、インビトロでは、この研究で分析されています。ここで開発された特性決定技術は、他の熱ゲル化システムにも適用可能です。

要約

注射可能な生体材料は、液体として体内に導入し、 その場で固化することができる移植可能な材料として定義されます。このような材料は、不規則な形状の欠陥で空間充填固形物を形成する低侵襲かつ容易に注入されるの臨床的利点を提供します。注射用生体材料は、広く組織工学のための足場として研究されてきました。しかし、体内の特定の耐荷重領域の修復のために、このような椎間板のように、足場は、接着性を有するべきです。これは、力の適切な伝達を提供し、動作中の転位の危険を最小限にし、周囲の組織との密接な接触を確実にします。ここでは、熱に敏感なポリ（N-イソプロピルアクリルアミド） - グラフト - コンドロイチン硫酸（PNIPAAM-G-CS）およびアルギン酸微粒子から成る足場の調製および特徴を説明します。 PNIPAAm-G-CS共重合体はalginatに、室温で水に粘性の溶液を形成しますE粒子は、接着を増強するために中断されています。下限臨界溶液温度（LCST）より、30℃の周囲に、共重合体は、微粒子の周囲に固体ゲルを形成します。我々は考慮のPNIPAAm-G-CSの可逆的な相転移を取るために、標準的な生体材料の特性評価の手順を適応しています。結果は、単独のPNIPAAm-GCSの5％に50または75 mg / mlでアルギン酸塩粒子の取り込みが（W / V）のPNIPAAm-G-CSのソリューションすなわち四接着引張強度（P <0.05）を示します。アルギン酸微粒子の混入も大幅組織欠損内空間充填ゲルを維持するのを助ける、のPNIPAAm-G-CS（p <0.05）の膨潤容量を増加させます。最後に、 中の結果インビトロ毒性アッセイキット、2,3-ビス- （2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル）-2H-テトラゾリウム-5- carboxanilide（XTT）および生/死生存率アッセイであることを示します接着剤は、カプセル化されたヒト胚腎臓の生存および増殖（HEK）293 Cをサポートすることが可能です5日間のells。

概要

注射可能な生体材料は、好都合には液体として体内に送達され、 その場で固化することができるものです。このような材料は、それらが細胞5ための三次元の一時的細胞外マトリックスとして患部1-4及び行為をカプセル化細胞を送達するために使用される再生医療に広く適用されています。移植のための外科的処置は、低侵襲であり、固相は、カスタムサイズのインプラントの必要性を排除し、不規則な形状の組織欠陥を埋めることができるため、患者のために、注射可能な生体材料は、有利です。

注入は、種々の機構を介して達成することができます。外部要因は、pH値のような、細胞および生物活性分子を封入6-8ゲルを形成するためのトリガとして研究されてきました。しかし、pHが全ての生理学的環境で使用するための最も便利な引き金ではないかもしれません。もう一つの伝統的なオルタナ注入を達成するための的は、 現場での化学重合または架橋を使用しています。グループは、過硫酸アンモニウムからなる水溶性のレドックス系を開発し、N、N、N '、N' -tetramethylethylenediamine 9,10-グリコール、ポリエチレングリコール、ポリ（プロピレン）からなるマクロマーを反応させるために使用されます。斬ら 11先進注射用キトサンポリビニルアルコールネットワークは、グルタルアルデヒドで架橋されました。このようなシステムでは、反応性成分の細胞毒性は、特に、細胞のカプセル化を伴う用途では、考慮しなければなりません。また、発熱重合は、ポリマー骨12,13をセメントで報告されている周辺組織を、妥協するのに十分高い温度を作り出すことができます。

さらに他の注射可能なポリマー系は、トリガとしての温度で液体から固体状態に変化を示すが開発されています。熱ゲル化システムとして知られ、これらはaqueoあります私たちのその場の形成14 に達成するために、化学的刺激、モノマー、または架橋剤を必要としないのポリマー溶液。そうではなく、通常の生理学的温度付近に生じる相転移が物理的に架橋された三次元網目構造の形成を誘導します。プルロニックF127などのポロキサマーは、薬物送達15-17と細胞封入18,19を熱ゲルのための最も広く研究されているポリマーの中です。しかし、これらのゲルは、生理的条件での安定性を欠くことがよく認められています。研究は、連鎖延長20または化学的架橋剤21,22を使用して増大した安定性を実証しています。それにもかかわらず、これらの試薬を使用することは、細胞のカプセル化のための材料の可能性を制限することができます。

ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）は、組織工学および薬物送達14に注目された合成熱ゲル化ポリマーです。ポリの水溶液（N-isoprop34°C 23,24 - ylacrylamide）（のPNIPAAm）は、典型的には約32起こる、下限臨界溶液温度（LCST）を示します。 LCSTより下では、水がのPNIPAAmチェーンを水和します。転移温度より上、ポリマーは、毒性モノマー又は架橋剤を使用せずに劇的な相分離25-27と固体ゲルの形成をもたらす、疎水性になります。しかし、のPNIPAAmホモポリマーが悪い弾性特性を示し、原因疎水28に生理的温度で少量の水を保持します。本研究では、酵素分解性29、抗炎症活性30,31、および増加した水と栄養吸収の32の可能性を提供するのPNIPAAmネットワーク、に共有結合コンドロイチン硫酸を組み込むことを選択します。 CSとのPNIPAAm共重合体は、グラフトされた共重合体（のPNIPAAm-G-CS）を形成するメタクリレート官能CSの存在下でモノマーNIPAAMを重合することによって我々の研究室で調製しました。ベック共重合体の低架橋密度のause、のPNIPAAm-G-CSは室温で水に粘性溶液とによるLCST 29に生理的温度での弾性ゲルを形成します。ポリマー溶液は、期限付き遷移の可逆に再びLCST以下に冷却すると流動可能になります。

我々は、のPNIPAAm-G-CSは、組織工学調整することができ、機械的特性に起因する足場、分解性、及びヒト胚腎臓（HEK）細胞適合性を有する293細胞29として機能する可能性があることを実証しました。しかし、このような椎間板のような特定の耐荷重領域において、組織工学足場は、転位33のリスクを排除するために周囲の椎間板組織との実質的な界面を形成する能力を有するべきです。このインタフェースは、インプラントと組織33との間の界面を横切る力を適切に伝達するためにも必要です。私たちの仕事では、我々は一時停止していますlginateのPNIPAAm-G-CSの水溶液中の微粒子とは、ゲル化が組織34を囲むとの密着性を提供する微粒子を、局在することがわかりました。本稿では、熱ゲル、接着剤ポリマーの製造のための手順を説明します。生体材料の特徴付け、細胞画像化、および生存能力についてのアッセイのための標準的な技術を考慮ポリマーと相転移の可逆性の温度感受性を取るように適合させました。この論文に記載の注射用ポリマーはこの論文に記載されているものの外薬物送達および組織工学アプリケーションのための幅広い可能性を秘めています。また、ここで説明する特徴付け方法は、他の熱ゲル化システムにも適用可能です。

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プロトコル

1.ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）-g-コンドロイチン硫酸合成

  1. 生体接着性ヒドロゲルの合成の前に、N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAM）モノマー及びメタクリレートコンドロイチン硫酸（CS）を精製します。
    1. NIPAAMの少なくとも10gを秤量し、60℃でn-ヘキサン400ml中にモノマーを溶解します。完全に溶解するまで、定期的にコンテナをかき混ぜます。 24時間、-20℃の冷凍庫内の溶液を再結晶化。
    2. 容器と真空フィルターからブフナー漏斗を用いて、n-ヘキサンを結晶化した単量体を除去します。残りのn-ヘキサンを除去するために、24時間室温で真空オーブン中でモノマーを置きます。 （ステップ1.2参照）後で使用するために-20℃の冷凍庫にモノマーを保管してください。
    3. 秤量し、脱イオン水8.0ミリリットルにコンドロイチン硫酸の2.0グラムを溶解します。穏やかに60℃に溶液を加熱します。
    4. 50％（w / w）のNaOHを約10〜40マイクロリットルを用いて10に溶液のpHを調整します。
    5. 無水メタクリル酸（MA）の0.298ミリリットルを追加します。 24時間還流し、60℃で攪拌しました。
    6. -20℃の冷凍庫にジャーとチルO / Nにアセトン溶液の400ミリリットルを注ぎます。
    7. 24時間が経過した後に、磁気攪拌棒で攪拌しながら、ゆっくりと、冷アセトン400ミリリットルに全体メタクリルCS（MCS）ソリューションを注ぎます。
    8. アセトンからMCSを削除し、真空オーブンの中に沈殿物を置きます。 MCSのために無傷で凝集状態を維持するために迅速にこの手順を実行します。残留アセトンは、少なくとも24時間、真空下で蒸発することができます。
  2. 精製されたNIPAAMの10グラムの脱イオン水232ミリリットル中のMCSの2.209グラムを共同溶解します。
  3. 不活性窒素ガスを用いて酸素の溶液をパージします。 15分間にわたりバブリングから解決策を防ぐために、積極的な、まだ低ガス流量を維持します。
  4. 窒素ガスで溶液をパージし続けるとtetramethyletの0.976ミリリットルを追加hylenediamine（TEMED）。
  5. 次に、過硫酸アンモニウム（APS）の97.6 mgを混合することによって重合反応を開始します。
  6. 約20秒のための溶液を混合し、すぐに容器に入るから空気を防止するためのソリューションを封印。ソリューションは24時間蛍光灯の下で重合することを可能にします。
  7. 24時間後、37℃のオーブン中に反応容器を置きます。ヒドロゲルは、ゲル状の状態に液体から移行できるようにします。ヒドロゲルから未反応モノマーの拡散を可能にするために、7日の合計1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で重合したヒドロゲルを水没。
  8. ハサミを使用して、直径5cmを超えない、いくつかの小さな断片、にヒドロゲルを切りました。液体にゲル状の状態から遷移からヒドロゲルを防止するために、37℃のPBS溶液中でポリマーをダイシング。 50ミリリットルコニカルチューブに部分を転送します。
  9. のトップをラップすることによって、凍結乾燥のためのサンプルを調製キムワイプとゴムバンド付きチューブ。 1〜2時間、-70℃でチューブをフリーズします。
  10. ヒドロゲルからの水のすべてを削除するために凍結乾燥機にコニカルチューブを置きます。操作する前に、凍結乾燥機は、それぞれ、およその温度及び圧力-40および0.04ミリバール°に到達する必要があります。 7日間の最小値は、完全な乾燥のために必要とされます。
  11. （ステップ3.1参照）後で使用するために4℃の冷蔵庫で微粉末と店に凍結乾燥したポリマーを粉砕します。

2.カルシウムアルギン酸架橋した微粒子の合成

  1. 脱イオン水20mlに400mgを溶解することによって、2％（w / v）のアルギン酸塩溶液を調製します。溶解を促進するために約60℃に溶液を加熱します。
  2. 20mlの脱イオン水に400ミリグラムを添加することにより（w / v）の塩化カルシウム溶液を2％を準備。
  3. キャノーラ油100mlを、Tween 20を1.0 mlであり、20 mlで結合することによって水の混合物中に油を作成します2％（w / v）のアルギン酸塩の。 15,000 rpmでホモジナイザーを用いて10分間混合物を乳化します。さらに、それぞれ、大きいか小さい微粒子を作成するために、200回転または2,000 rpmで磁気攪拌棒を混ぜます。
  4. 吸引18 G針の先端でシリンジを用いて、2％（w / v）の塩化カルシウム溶液。ゆっくりと滴下エマルジョンに塩化カルシウムを追加します。
  5. 塩化カルシウム20mlを排出したら、エマルジョン中の微粒子を10分間架橋することを可能にします。
  6. 均等にキャノーラ油の初期層を除去するために、2分間1400×gでの力に蓋をし50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に微粒子のバッチを配布します。
  7. 連続して洗浄、ボルテックス、および任意の残留キャノーラ油を除去するために、イソプロパノールで2分間1400グラムで3回の合計を微粒子を遠心分離します。各遠心分離工程の後にイソプロパノール上清を捨て、新鮮なイソプロパノールで洗浄します。
  8. 大井いったんLが除去され、残留イソプロパノールを取り除くために、脱イオン水で洗浄手順をさらに3回繰り返します。各遠心分離工程の後に、脱イオン水の上澄みを捨て、新鮮な脱イオン水で洗います。バイアルに濡れた微粒子および店舗約100mgのを削除します。湿った微粒子は、光学顕微鏡によってバッチの平均粒径を測定するために使用されます。
    1. 光学顕微鏡を使用して、顕微鏡スライド上に脱イオン水で湿った微粒子の小さな試料を分散させます。微粒子の大きさに応じて、10倍または20倍対物レンズを使用し、粒子が焦点に来るまで、開口数を調整します。顕微鏡が正しい目的のために校正されていることを確認し、必要に応じて、光源の明るさを調整します。 50ランダムアルギン酸微粒子の長径を測定し、バッチの平均サイズを得るために、ラインツールを使用してください。
  9. 凍結乾燥bの微粒子を準備yはキムワイプでそれらを包み、輪ゴムでそれらを確保します。 1時間-70℃で微粒子をフリーズします。
  10. 凍結乾燥機で微粒子を置き、サンプルは、少なくとも24時間乾燥させます。 （ステップ3.3参照）後で使用するために4℃の冷蔵庫に乳鉢と乳棒とストアを使用して微粉末に凍結乾燥した微粒子を粉砕します。

接着剤の調製

  1. 凍結乾燥したポリマー粉末を用いて、1×PBS 1mlにヒドロゲル粉末50mgを溶解することにより、5％（w / v）でのPNIPAAm-G-CSのソリューションを作成します。
  2. 24時間4℃で冷蔵庫で渦と寒さを用いた溶液を混ぜます。
  3. 粘性溶液が形成されると、ヒドロゲル溶液と渦に凍結乾燥したアルギン酸微粒子の25又は50mgを追加することにより、均質な複合体を作成します。 （ステップ4.3と4.8を参照）後で使用するために4℃で冷蔵庫に複合材を保管してください。

4.生体接着メックanical引張試験

  1. 引張り試験を実行する前に、ブタ耳の軟骨基質を抽出します。
    1. 温かい0.9％ブタ耳解凍NaCl溶液（w / v）の。これは、組織を緩めるのに役立ちます。
    2. メスを用いて、表皮層、皮下組織、および軟骨かかわらず垂直方向に切断することにより、フラット、矩形領域から隔離し、セクション。ブタの耳の湾曲した隆起部を切断しないでください。
    3. 皮下組織を通って平行に切断することによって軟骨から皮膚の表皮層を分離します。軟骨は、ブタの皮膚の下に見つかったハード、白組織です。
    4. 慎重にメスの側に軟骨に接続されている皮下組織をこすり。手術用メスの刃を持つ軟骨組織に切断しないでください。
    5. 軟骨の片側のみが引張試験中に露出し、平らにされていることを確認してください。必要に応じて、下面に凹凸肌を遮断することで軟骨を平らに。
    6. 1センチメートル×1センチ寸法のいくつかの部分に軟骨組織をカット。 ℃のフリーザーで-20 0.9％（w / v）のNaCl溶液で満たされた円錐管で軟骨組織を保管してください。
  2. 0.9％（w / v）のNaCl溶液2.0 Lを準備します。 37℃に生理食塩水を予め加熱します。この溶液の温度は、試験全体を通して維持される必要があります。
  3. 凍結された軟骨を解凍。アイスパックと発泡スチロールの容器に豚軟骨とヒドロゲル試料の両方を保管してください。
  4. テストスタンドのアームに力ゲージを取り付けます。力のスタンドの上にホットプレートを配置し、50℃に温度を設定。
  5. シアノアクリレート系接着剤でステンレス製のブロックとピンセットに軟骨から1cm×1センチの部分を貼り付けます。デルリンシリンダに軟骨の追加部分を接着し、フォースゲージにシリンダーを取り付けます。両方の軟骨面が互いに対向し、ヒドロゲルを連絡することが非常に重要です。
  6. 場所ホットプレートの上にプレキシグラスの水槽やバスの内部軟骨基質とステンレス製のブロックを挿入します。
  7. テストスタンドのアームを下ろして互いに両方の軟骨基質を合わせます。腕を上げて、ヒドロゲルを適用するのに十分な余地を残します。
  8. 容積式ピペットを用いて、軟骨の底部片に生体接着性ヒドロゲルの200μLを分注します。
  9. 軟骨の上片ヒドロゲルに接触するまで、1ミリメートル/分で力スタンドのアームを下ろして0.001 Nの予圧力を発揮します
  10. ボリュームが指定された水位に達するまで浴に37℃の生理食塩水を注ぎます。熱電対との溶液の温度を確認してください。
  11. ヒドロゲルは合計5分間に設定することができます。ゲルが固化した後は2mm /分の速度で腕を上げます。生体接着剤は、軟骨基質から分離後または力の大幅な低下が発生したときに試験が完了すると、故障を知らせます。
  12. 記録されたデータを収集し、テストスタンドの腕を上げます。フォースゲージからデルリンシリンダーを取り外します。その前の容器に生理食塩水を注ぎ、37℃に再加熱します。
  13. 同じ速度で上昇させていない軟骨や接着剤、との「空白」、デルリンアタッチメントの浮力からポリマーによって加えられる力を減算し、接着面積で割ることにより応力を計算します。

アルギン酸微粒子とのPNIPAAm-G-CSの5膨潤研究

  1. きれいなガラスバイアルを準備し、時刻、サンプルタイプ、サンプル番号でそれらを適切にラベルを付けます。前述のように接着剤はまた、作成することができます。時点あたり各サンプルタイプのための5つのサンプル（N = 5）の合計を準備します。
  2. すべてのガラスバイアルを事前に計量し、RTで彼らの初期質量を記録します。
  3. 注射器を使用して、5バイアルのそれぞれに用意した接着剤サンプルの約0.4ミリリットルを分配します。試験したすべての時間ポイントで各サンプルタイプについて、この手順を繰り返します。
  4. RTで接着剤サンプルの種類と各バイアルの質量を計量し、記録します。
  5. 軌道インキュベーター、37℃に1×PBS溶液1リットルを事前に温めます。
  6. ラックにバイアルのすべてを整理し、インキュベーターにラックを挿入します。接着剤は、約5〜10分間ゲルに液体から移行できるようにします。
  7. 各バイアルに1×PBSの5.0ミリリットルを追加します。慎重に離れて壊すからヒドロゲルディスクを防止するために、バイアルの側面に沿ってPBS溶液を追加してください。
  8. PBS溶液の蒸発を防ぎ、37℃のインキュベーターの内部温度を維持するために、各バイアルキャップ。ハイドロゲルディスクの各セットは、時間の指定された長さのためにPBS中に沈めたままにする必要があります。
  9. 7日の時点に到達した後、バイアルのセットをキャップを取ると、各バイアルからPBS溶液を除去。 RTで再び接着剤サンプルと各バイアルに秤量します。
6。ライブ/デッドアッセイを用いて定性的細胞生存度

  1. PNIPAAm-G-CSで生/死アッセイを行う前に、80％コンフルエンスにヒト胚性腎臓293細胞（HEK-293）を成長させます。
    1. 次いで15 mlのコニカルチューブ中で5分間、4℃で400×gで細胞を遠心し、37℃の水浴中にクリオバイアルを置くことによって凍結HEK-293細胞懸濁液を急速解凍。
    2. 、第1通路細胞増殖培地を作る20％の最終濃度と100Xペニシリン - ストレプトマイシン溶液（に熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、高グルコース（4.5グラム/ L）に結合しますペニシリン - ストレプトマイシン100 IU / mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンの最終濃度まで）。他のすべての通路については、10％FBSおよび1×ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEMに切り替えます。
    3. 成長培地10ml中で細胞ペレットを再懸濁一直径100mmのペトリ皿に懸濁液を移します。均等にD静かにバックアップするディッシュのフロントを傾けることによって、細胞をistribute数回それぞれの方向を左から右へ。
    4. 培養5％CO 2、37℃で加湿インキュベーター中で細胞。必要に応じて、2日毎に培地を変更します。
    5. 細胞が80％コンフルエンスに達したとき、複数の皿に文化を複製します。プレートから培地を除去。
    6. プレートに0.5％トリプシンの1ミリリットルを追加します。プレートを37℃で10分間インキュベートすることを可能にします。細胞を穏やかにプレートを旋回させることにより、表面から切り離すかどうかを確認します。
    7. 文化1:10に分割するために、トリプシン処理した細胞に、通常の増殖培地（10％FBSを含むDMEM）の9ミリリットルを加え、穏やかにディッシュを傾けることによって混合します。
    8. それぞれの新しい皿に希釈した細胞懸濁液の1ミリリットルを分配し、増殖培地の9ミリリットルを追加します。ゆっくり料理を傾けることによって混合します。
    9. 培養5％CO 2、37℃で加湿インキュベーター中で細胞。必要であれば、これまでの媒体を変更yの2日後、細胞が80％コンフルエンスに達するまで。
  2. 80％コンフルエンスまで増殖させた2つの培養皿からメディアを取り出します。
  3. 各プレートに0.5％トリプシンの1ミリリットルを追加します。プレートを37℃で10分間インキュベートすることを可能にします。細胞を穏やかにプレートを旋回させることにより、表面から切り離すかどうかを確認します。
  4. 二回成長培地の3ミリリットルでプレート上のHEK-293細胞を洗浄し、同じ15ミリリットルコニカルチューブに両方の懸濁液を追加します。
  5. 4℃で400×gで10分間、15ミリリットルコニカルチューブを遠心します。
  6. 上清を除去し、ピペッティングにより培地の3ミリリットル中に細胞ペレットを再懸濁します。
  7. ピペット血球計に細胞懸濁液10μlとを、細胞密度を決定するために、細胞計数を行います。濃度が低すぎると、目標コンセントを維持するために、音量を下げ、逆に、初期細胞濃度が高すぎる場合、媒体の懸濁液体積を増加させ、そして1×10 6細胞/ mlの比。遠心分離機400×gでHEK-293細胞は、それに応じて、メディアの補正されたボリュームで細胞ペレットを再懸濁します。
  8. 穏やかに細胞懸濁液をボルテックスし、均一に以下の試験条件で、4つの別々の15 mlのコニカルチューブに細胞混合物を分散：のPNIPAAm-G-CSにおける陽性対照単層、負死滅対照（v / v）のメタノール70％を使用して、HEK-293 PNIPAAm-G-CSに封入された細胞、およびアルギン酸微粒子とのPNIPAAm-G-CSにカプセル化されたHEK-293細胞。
  9. 4-6反復サンプルを生成するために、24ウェルプレートに細胞混合物の複数の300μlのボリュームをピペットで陽性対照単層を作成します。
  10. アルギン酸微粒子と殺さ制御、のPNIPAAm-G-CS、とのPNIPAAm-G-CSに関連する円錐管からメディアを取り出します。
    1. 400×gで5分間の円錐管を遠心分離し、上清を除去します。
    2. Cを再懸濁することにより、同じ細胞濃度を維持します削除メディアとしてのPNIPAAm-G-CSの同じ体積でells。アップと均一になるまで血清学的ピペットを使用してダウンポリマー電池ミックスをピペット。
      1. アルギン酸塩の微粒子を接種した場合、35mm培養皿に（6.10.2について記載したようにして得られた）のPNIPAAm-G-CS-細胞懸濁液を転送し、ミックスに粒子を導入します。細胞混合物を上にピペットし、均一になるまで血清学的ピペットを使用してダウン。
    3. 6反復サンプル - 血清学的ピペットを使用して、殺した制御用のウェルのそれぞれに、ポリマー電池ミックスの複数の300μLを分注、のPNIPAAm-G-CS、およびアルギン酸微粒子とのPNIPAAm-G-CSは4を生成します。
  11. 10〜15分間、37℃でプレートをインキュベートし、のPNIPAAm-G-CSは、ゲル（高分子形不透明、白ディスク）への液体から移行することを可能にします。
  12. スライドフードで暖かく、37℃に温度を設定した位置。ウェルプレートを維持するために暖かいスライドを使用して、温度やピペット各ウェルに予熱したメディアの600μlの。さらに液体状態へのポリマーの移行を防止するために、その上に空気を温めるために皿の上記の蛍光灯でランプを配置。
  13. 5％CO 2で37℃で5日間、細胞をインキュベートします。
  14. 5日が経過した後、エチジウムホモ二量体（のEthD-1）及びカルセインAMを用いて、生/死染料ミックスを準備します。両物質は、感光性と使用の日に調製されています。
    1. RTでキットからカルセインAMとのEthD-1を解凍。
    2. コニカルチューブに滅菌1×PBSの5ミリリットルを加え、アルミホイルで包ん。
    3. コニカルチューブに2 mMののEthD-1の6.67μLを加えます。徹底的に溶液混合物をボルテックスし。
    4. 次に、コニカルチューブに4 mMのカルセインAMの2.5μlを添加します。混合物を充分渦。
  15. 単層（ポジティブコントロール）、のPNIPAAm-G-CS、とのPNIPAAm-G-CSのウィットのウェルから培地を除去時間アルギン酸微粒子。 PBSで、徹底的に、しかし優しく井戸のすべてを洗浄し、PBSを除去します。
  16. アルギン酸塩微粒子を含むハイドロゲルディスクは室温で液化し、各ウェルに50 mMクエン酸ナトリウムの2ミリリットルを追加することができます。
  17. 殺された細胞ウェル（ネガティブコントロール）からメディアを取り出します。ハイドロゲルディスクは室温で液化し、各ウェルに70％（v / v）のメタノール300μLを追加することができます。
  18. 37℃で45分間プレートをインキュベートします。
  19. 井戸からクエン酸ナトリウムとメタノールのソリューションを削除し、個々のマイクロ遠心チューブにヒドロゲル懸濁液のそれぞれをピペット。ヒドロゲル懸濁液から細胞を分離するために10分間、2,000×gでチューブを遠心します。
  20. 慎重に円錐管からの溶液をピペッティングし、細胞ペレットを残しによってサスペンションを削除します。 300μlのPBSにペレットを再懸濁し、オリジナルのウェルプレートに移します。
  21. トンの300μLを追加彼は/デッド染料混合物は、各ウェルに住んでいます。アルミホイルでウェルプレートをラップし、RTでロッカーに45分間インキュベートします。
  22. 10Xの目的とした倒立蛍光顕微鏡下での画像サンプルのすべてを。生きた細胞と殺された細胞は、それぞれ、緑色と赤色の蛍光を表示します。

XTTアッセイを用いて7定量的細胞生存

  1. 80％コンフルエンスまでHEK-293細胞を成長させます。 2培養皿から増殖培地を除去します。
  2. 各プレートに0.5％トリプシンの1ミリリットルを追加します。プレートを37℃で10分間インキュベートすることを可能にします。細胞を穏やかにプレートを旋回させることにより、表面から切り離すかどうかを確認します。
  3. 二回メディアの3ミリリットルでプレート上のHEK-293細胞を洗浄し、同じ15ミリリットルコニカルチューブに両方の懸濁液を追加します。
  4. 4℃で400×gで10分間、15ミリリットルコニカルチューブを遠心します。
  5. 上清を除去し、メディアの3ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁上下にピペッティングすることによって。
  6. ピペット血球計に細胞懸濁液10μlとを、細胞密度を決定するために、細胞計数を行います。前述のように、1×10 6細胞/ mLの標的濃度を維持します。遠心分離機400×gでHEK-293細胞は、それに応じて、メディアの補正されたボリュームで細胞ペレットを再懸濁します。
  7. 穏やかに細胞懸濁液をボルテックスし、均一に以下の試験条件で、4つの別々の15 mlのコニカルチューブに細胞混合物を分散：のPNIPAAm-G-CSにおける陽性対照単層、負死滅対照（v / v）のメタノール70％を使用して、HEK-293 PNIPAAm-G-CSに封入された細胞、およびアルギン酸微粒子とのPNIPAAm-G-CSにカプセル化されたHEK-293細胞。
  8. 6反復サンプル - 4を生成するために、24ウェルプレートに細胞混合物の300μLをピペットで陽性対照単層を作成します。
  9. 殺されたコントロールに関連する円錐管からメディアを削除し、のPNIPAAm-G-CS、とのPNIPAAm-G-アルギン酸微粒子とCS。
    1. 400×gで5分間の円錐管を遠心分離し、上清を除去します。
    2. 削除メディアとしてのPNIPAAm-G-CSの同じ体積中に細胞を再懸濁することにより、同じ細胞濃度を維持します。細胞混合物を上にピペットし、均一になるまで血清学的ピペットを使用してダウン。
      1. アルギン酸塩の微粒子を接種した場合、35mm培養皿にのPNIPAAm-G-CS-細胞懸濁液を転送し、ミックスに粒子を導入します。細胞混合物を上にピペットし、均一になるまで血清学的ピペットを使用してダウン。
    3. 6反復サンプル - 血清学的ピペットを使用して、殺した制御用のウェルのそれぞれに、ポリマー電池ミックスの300μLを分注、のPNIPAAm-G-CS、およびアルギン酸微粒子とのPNIPAAm-G-CSは4を生成します。
  10. 一旦細胞含有試料のすべてが24ウェルプレートに添加されている、のPNIPAAm-G-CSとPNIPAの複数の300μlのボリュームを分配6反復サンプル - AM-G-CS隣接するウェル内の細胞を含まないアルギン酸塩の微粒子とは、4を生成します。
  11. 10〜15分間、37℃で24ウェルプレートをインキュベートし、のPNIPAAm-G-CSは、ゲル（高分子形不透明、白ディスク）への液体から移行することを可能にします。
  12. スライドフードで暖かく、37℃に温度を設定した位置。各ウェルに予め温めておいた明確なDMEMのウェルプレートの温度とピペット600μLを維持するために、スライドウォーマーを使用してください。さらに液体状態へのポリマーの移行を防止するために、その上に空気を温めるために皿の上記の蛍光灯でランプを配置。
  13. 5％CO 2で37℃で5日間、細胞をインキュベートします。
  14. 5日が経過した後、製造業者の2,3-ビス - （2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル）-2H-テトラゾリウム-5- carboxanilide（XTT）試薬を調製します。 XTT試薬は光に敏感と使用の日に準備されます。
    1. 琥珀色のボトルが含まれていると削除冷蔵庫からXTT粉末をる。無菌注射器と針を使用して、琥珀色のボトルにゴム隔膜を通して明確なDMEM（無フェノールレッド）の5ミリリットルを注入します。
    2. 10分間または溶解するまで水浴中で56°Cまで試薬を加熱します。
    3. さらにアルミホイルで包み15 mlのコニカルチューブ中の20％（V / V）にXTT試薬を希釈します。マイクロ遠心チューブ中の過剰XTT試薬を等分し、長期保存のために-20℃の冷凍庫に置いてください。
  15. 殺された細胞ウェル（ネガティブコントロール）から培地を除去し、各ウェルに70％（v / v）のメタノール300μlを添加します。 37℃で45分間インキュベートし、ウェルからメタノールを除去。
  16. 単層（ポジティブコントロール）、のPNIPAAm-G-CS、とのPNIPAAm-G-CSアルギン酸塩微粒子との残りのウェルから培地を除去。 PBSで、徹底的に、しかし優しく井戸のすべてを洗浄した後、PBSを除去します。
  17. 2の300μLを追加各ウェルに0％XTT試薬。アルミホイルで24ウェルプレートをラップし、RTでロッカー上で24時間インキュベートします。
  18. 24時間後、全てのウェルに50 mMクエン酸ナトリウム200μlのを追加し、1の追加の時間のためのロッカーでインキュベートします。
  19. RTで10分間、2000×gでマイクロ遠心チューブと遠心分離機にポリマー懸濁液の全てを転送します。
  20. 96ウェルプレートに、各マイクロチューブから上清200μlのを転送します。マイクロタイタープレートリーダーを用いて、690 nmで450 nmおよび非特異的な吸光度の読み取りでの特定の吸光度測定値を得ます。

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結果

熱応答性グラフトした共重合体は、合成に成功し、その生体接着強度を特徴とする、膨潤性、およびインビトロ細胞適合性でました。私たちは、その十分に確立された粘膜付着性特性によるアルギン酸塩を調査することにしました。アルギン酸微粒子は、59.7±14.9ミクロンの平均直径と、25、50、および75 mg / mlでの濃度でのPNIPAAm-G-CS（w / v）の5％を配合しました。これらの濃度は等しい半分、および水溶液中でのPNIPAAm-G-CSの二倍当量の乾燥重量に基づきました。 75mgの上記微粒子の濃度は、/ mlのは、過度の粘度を示し、調査しませんでした。アルギン酸微粒子の種々の濃度で5％の最大引張接着強さ（W / V）のPNIPAAm-G-CSは、単独で、ハイドロゲルと比較しました。 5％懸濁アルギン酸微粒子の50または75 mg / mlでの添加は、（V / W）のPNIPAAm-G-CSは4倍株式会社もたらし引張強度（Pにおけるrease < 図1に示すように0.05）、25 mg / ...

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ディスカッション

ヒドロゲル微粒子複合体を合成し、その接着強度、腫れ能力、および細胞の生体適合性を評価する上でいくつかの重要なステップがあります。 PNIPAAm-G-CSのフリーラジカル重合は、コンドロイチン硫酸の成功メタクリルモノマー成分の完全な溶解、および無酸素反応条件を必要とします。天然の椎間板組織29と同様の機械的特性を有する共重合体を生成するために、我々の以前の研究で実証されたので、反応混合物中のメタクリルコンドロイチン硫酸にNIPAAMモノマーの比率を選択しました。ヒドロゲルでコンドロイチン硫酸の量を増加させると、ゲル中の水の損失を低減し、従って、ゲルの圧縮剛性を減少させます。メタクリル選択度は、水性溶液中に溶解したときに18 G針を通して注射するための良好な取り扱い特性を有するヒドロゲルを生成することが実証されています 29 CSのメタクリル酸置換の増加度は、LCST以下増加溶液粘度を生じ、ゲルの膨潤能力を低下させる、ポリマーネットワークの架橋密度を増加させます。他のものは、原子移動ラジカル重合（ATRP）35または逆付加フラグメンテーション連鎖移動（RAFT）3...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

作者は感謝して接着剤の引張試験プロトコルの開発で博士ジェニファーKadlowecの支援を感謝したいです。

この刊行物で報告された研究は、関節炎と筋骨格系および皮膚疾患の国立研究所賞番号1R15のAR 063920から01の下で医学や国立衛生研究所の生物工学研究所によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
N-イソプロピルアクリルアミド、99%、純粋、安定化アクロス有機物2210-25-5ヘキサンで安定剤を冷蔵し、除去
コンドロイチン硫酸塩 ナトリウム塩(ウシの気管から)シグマ・アルドリッチ39455-18-0
ヘキサンフィッシャー・サイエンティフィH302-4可燃性キャビネットに保管
50% (w/w) 水酸化ナトリウムッシャー・サイエンティフィックSS254-1苛性アルカリ性
無水メタクリSigma-Aldrich276685強い煙; ヒュームフードで使用
アセトンフィッシャーサイエンティフィックA18-4使用前に冷蔵庫で冷やす
窒素ガスPraxair7727-37-9部品番号: NI 4.8、シリンダースタイルT、純度99.998%(アルゴンは代替の不活性ガスとして使用できます)
テトラメチルエチレンジアミン、99%余分純粋なAcros Organics110-18-9
硫酸アンモニウムSigma AldrichA3678吸湿性があり、水の存在下で劣化
リン酸緩衝生理食塩水錠剤フィッシャーサイエンティフィックBP2944乾燥した
アルギン酸、ナトリウム塩を保つ アクロスオーガニックス177775000熱を使用して溶解
を助けます塩化カルシウム二水和物フィッシャーサイエンティフィックC79
キャノーラ油地元の店店から入手
Tween 20Sigma-Aldrich93773
70% (v/v) イソプロポアノールフィッシャーサイエンティフィックA416-4
豚の耳ヘインズポークショップ地元の肉屋から入手
塩化ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS271-3
胚性腎臓293細胞ATCCATCC CRL-1573使用のための液体窒素での保管
DMEM:1x、高グルコース、ピルビン酸なしライフテクノロジーズ 11965126冷蔵
胎児ウシ血清ライフテクノロジーズ 10082-147
ペン連鎖球菌を冷蔵:10,000 U / mlライフテクノロジー15140-122トリ
プシン-EDTAの冷蔵:0.5%、10xLife Technologies15400-054メタ
ノールVWRAAA44571-K7
生/死細胞生存キットLife TechnologiesL3224光に敏感で、凍結したXTT
細胞生存率キットSigma AldrichTOX2-1KT光に敏感で、凍結したまま
Clear DMEM: 1x, 高グルコース, フェノールなしLife Technologies21063-029Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1xLife Technologies14190136Refrigerate
Sodium CitrateEMDSX0445-1
Positive Displacement PipetteBrandTech Scientific, INC2702904Dispenses 100 - 500 & micro;lと取り付け可能なチップ
No3が付属しています。ステンレス鋼のメスのハンドルSigma AldrichS2896
Miltex 滅菌外科用ブレードFisher Scientific12-460-440サイズ 10
パワー ジェム ホモジナイザーFisher Scientific08-451-660モデル # 125
磁器の乳鉢と乳棒Sigma AldrichZ24746450 ml FreeZone
1 L ベンチトップ フリーズ ドライ システムLabconco7740020使用前にサンプルを凍結する
油封式ロータリーベーンポンプエドワーズA65301906モデル# RV5
インキュベーションオービタルシェーカーVWR12620-946モデル#980153
卓上型冷蔵遠心分離機Forma Scientific, INCモデル# 5682
加熱オーブンVWRモデル#1235PC
2 NフォースゲージShimpoFGV-0.5XYモデル# FGV-0.5XY
E-forceテストスタンドShimpoFGS-200PVモデル#FGS-200PV
組織培養スイングバケット遠心分離機ベックマン・コールター366830モデル #6S-6KR
組織培養微量遠心分離機エッペンドルフモデル #5415C
血球計算計セットハウサーサイエンティフィック3720交換用カバーガラスが必要スリップ
スライドウォーマーラボ サイエンティフィックXH-2022モデル # XH-2002
ポータブル ヒーティング ランプアンダーライターズ ラボラトリーポリマー温度を 37 °C に維持するのに役立ちます。C
倒立型蛍光顕微鏡ツァイスモデル Axiovert 25 CFL
温水浴VWRモデル # 1235PC
ロッキングプラットフォームVWRシリーズ 100
Multiskan FC マイクロタイタープレートリーダーThermo ScientificType 357
細胞培養インキュベーターVWRModel # 2350T
清浄機クラス IIバイオセーフティキャビネットLabconcoDelta Series
します 冷蔵ック フィル酸 過します 地元のヒト長期にしておく

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