サルヴィとTOF-SIMSによる水中で水和タンパク質のその場キャラクタリゼーションで

サマリー

この作業は、水溶液中のタンパク質の生体分子のその場での飛行時間型二次イオン質量分析のためにマイクロチャネルに液体ハンドリング及び試料導入のためのプロトコルを示します。

要約

この作業は、液体真空インターフェース（サルヴィ）および飛行時間型二次イオン質量分析法（TOF-SIMS）での分析のためのシステムを使用して、水溶液中のタンパク質の生体分子のその場特徴付けに実証しています。フィブロネクチンタンパク質フィルムはサルヴィ検出領域を形成する窒化シリコン（SiN）膜上に固定化しました。 TOF-SIMS分析中、分析の三つのモードは、高空間分解能質量分析、二次元（2D）画像、深さプロファイリングを含む行いました。質量スペクトルは、正と負の両方のモードで取得しました。脱イオン水は、また、基準サンプルとして分析しました。我々の結果は、水中のフィブロネクチン膜は水のみと比較して、より明確で強い水クラスターのピークを有することを示します。アミノ酸断片の特徴的なピークは、水和タンパク質TOF-SIMSスペクトルにおいても観察されています。これらの結果は、表面上のタンパク質分子の吸着はdynamicaを研究することができることを示しますLLY初めて液体環境にサルヴィとTOF-SIMSを用いました。

概要

水分補給は、構造^、1コンフォメーション^、2およびタンパク質の生物学的活性を³に不可欠です。それらを取り囲む水分子のないタンパク質は、生存可能な生物学的活性を持っていないでしょう。具体的には、水の分子が表面と相互作用およびタンパク質の内部構造、およびタンパク質の異なる水和状態は、このような相互作用が別個にする^。4固体表面とのタンパク質の相互作用は、ナノテクノロジー、バイオマテリアルと組織工学プロセスにおける意義と基本的な現象です。研究は、長いタンパク質が表面に遭遇すると立体構造変化が発生する可能性があることが示されています。 TOF-SIMSは、タンパク質-固体界面を研究する可能性を秘めている技術として想定されている^。5-7潜在的にその構造のメカニズムの基本的な理解を提供する固体表面上のタンパク質の水和を、理解することが重要です、コンフォメーション、および生物学アル・アクティビティ。

しかし、主要な表面分析技術は、主に真空ベースであり、揮発性液体の研究のための直接のアプリケーションが原因で、真空環境下での揮発性液体の急速な蒸発のために困難です。我々は、液体の表面および液体-固体相互作用（TOF-SIMS）飛行時間型二次イオン質量分析法を用いて直接観察を可能にするために、液体真空インターフェース（サルヴィ）で分析するために、互換性のあるマイクロ流体インターフェースシステム真空を開発しました^。8- 1）検出ウィンドウ2）の表面張力を開口部内に液体を保持するために使用され、そして3）サルヴィは、液面の直接撮像を可能にする直径2-3ミクロンの開口部である^：11のユニークな態様は、以下が挙げられます複数の分析プラットフォーム間でポータブル^。11,12

サルヴィは、検出領域及びポリジメチルシロキサン（PDMS）からなるマイクロチャネルとして窒化シリコン（SiN）膜で構成されています。それはfabrですクリーンルーム内でicated、および製造および主要な設計要因は、前の論文や特許に詳述されている^。8月12日 TOF-SIMSのアプリケーション分析ツールは、水溶液と、複雑な液体混合物のさまざまな方法を使って実証されたように、いくつかのこれはナノ粒子を含んでいた^。13-17具体的には、サルヴィ液体TOF-SIMSは、 その場で凝縮相のための新しい機会を開き、ライブ生物系（ すなわち 、バイオフィルム）、単一細胞、および固体-電解質界面の液体-固体界面のプロービングダイナミックできますTOF-SIMSを使用して液体を含む研究。しかし、現在の設計は、まだ気液相互作用を許可していません。これは、将来の発展の方向性です。サルヴィは、初めてこの研究で水和タンパク質膜を研究するために使用されてきました。

フィブロネクチンは、ジスルフィド結合の組によって連結された2つの略同一のモノマーからなる^、18れるI一般的に使用されるタンパク質二量体であります細胞に結合する能力についてよく知られているよ^{。19,20は、それが}水和タンパク質フィルムを動的サルヴィ液体TOF-SIMS法を用いて調べることができたことを示すためにモデル系として選択しました。タンパク質溶液をマイクロチャネルに導入しました。 12時間インキュベートした後、水和タンパク質膜のSiN膜の裏面に形成されました。脱イオン（DI）水を、タンパク質導入の後にチャネルを洗い流すために使用しました。情報は、動的TOF-SIMSを用いサルヴィマイクロチャネル内の水和フィブロネクチンタンパク分子から収集しました。 DI水はまた、水和フィブロネクチン薄膜から得られた結果と比較するための対照として調べました。明確な違いは、水和タンパク質フィルムとDI水との間で観察されました。この作業は、液体環境における表面上のタンパク質吸着は、新規サルヴィと液体TOF-SIMS法を用いて研究することができることを示しています。ビデオプロトコルは、興味のある人々のための技術的なガイダンスを提供することを意図していますTOF-SIMSとサルヴィの多様なアプリケーションのためのこの新しい分析ツールを利用することで、不要な液体ハンドリングミスと同様にTOF-SIMSデータ収集と分析を減らします。

プロトコル

サルヴィマイクロチャネルの1クリーニングと滅菌

1. サルヴィにおけるマイクロチャンネルの滅菌
   1. 、シリンジに70％エタノール水溶液2mlを描くサルヴィの入口端でシリンジを接続し、ゆっくりと10分間で液を1ml注入。注射の終了時に注射器を取り外します。次に、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）ユニオンを使用してサルヴィの入口と出口を接続します。代わりに、同じ手順を行うためにシリンジポンプを使用しています。たとえば、100μL/分での流速を設定します。
   2. 4時間室温で70％のエタノール溶液で満たされたサルヴィマイクロチャネルを保管してください。
2. サルヴィに脱イオン（DI）水を導入
   1. 、シリンジに滅菌DI水の2ミリリットルを描くサルヴィの入口で注射器を接続し、ゆっくりと10分内の液体の1ミリリットルを注入。シリンジを取り外し、およびPEEKユニオンを使用してサルヴィの入口と出口を接続します。で述べたように、交互に、シリンジポンプを使用しステップ1.1.1。

サルヴィにおけるタンパク質フィルムの2の固定化

1. サルヴィにタンパク質フィルムを固定化
   1. ゆっくりと、10分に液体の1ミリリットルを注入シリンジを取り外し、入口を接続し、サルヴィの入口で注射器を接続し、シリンジにフィブロネクチンの2ミリリットル（リン酸緩衝生理食塩水、PBS中10μg/ mlの）ソリューションを描きますそして、PEEKユニオンを使用してサルヴィの出口。
   2. サルヴィをインキュベート12時間室温でフード内で皿を維持し、クリーンな培養皿にフィブロネクチン溶液で満たされました。
   3. シリンジに滅菌DI水の2ミリリットルを描き、サルヴィの入口で注射器を接続します。ゆっくりと、10分間で水1ミリリットルを注入シリンジを取り外し、サルヴィの入口と出口を接続します。
      注意：光顕微鏡を備えた場合は、このSiN膜は、TOF-SIMS分析の前に完全であることを確実にするために、顕微鏡下でサルヴィを確認してください。今サルヴィデバイスがのために準備ができているTOF-SIMSalysis。

3. TOF-SIMSロードロックチャンバ内にサルビをインストールします。

注：サルヴィデバイスを処理し、表面分析の間に潜在的な汚染を避けるために、TOF-SIMSのステージにそれをインストールする際に手袋を常に着用します。

1. ステージ上にマウントサルビ
   1. 平らで清潔な表面にTOF-SIMSのステージを置きます。上向きにシリコンウェハとSiN膜とステージ上にサルヴィデバイスを置きます。 4金属製のクランプ片を用いサルビを修正し、4本のネジにより金属板にデバイスの角を保持する金属片をねじ込みます。
   2. 静かにマイクロ流体チャネルに接続されたPFTEチューブをロールアップ。硬い部分を長押しする4つの金属片と4本のネジを使用してください。それは分析中に一次イオンビームと干渉しないように、デバイスをSIMSステージ上のオープンスペースに配置されていることを確認します。サルヴィfabricatの追加の画像およびイラストイオンとインストールは、以前の出版物でご利用いただけます^。8,9,11
2. ステージ上にファラデーカップをマウントします
   1. ネジで、ステージ上のファラデーカップを修正しました。
3. TOF-SIMSロードロックチャンバ内にステージをロード
   1. 、TOF-SIMSのロードロックを開いて保持し、荷台の上に水平にステージを設定し、ロードロックのドアを閉じます。

4. TOF-SIMSデータ集録

1. （10 ^-6ミリバールまたはトルのオーダーで、 例えば ）真空ポンプの電源をオンにし、適切な真空を確保するためには、ロードロックチャンバに到達します。
2. 真空は、約30分後に安定化されると、主室にサルヴィを移動します。
   注：真空は、データ取得時のメインチャンバー内の5×10 ^-6ミリバールの真空よりも低くなければなりません。そうでなければ、より高い真空サルヴィシステムにおける漏れを示します。
3. でTOF-SIMSの一次イオンビームとアナライザを調整します製造業者の推奨に従って、約400nmの空間分解能。サイクル時間は、DCモードで30マイクロ秒であるが、一次ビームの電流1,200ペンシルバニア。
   注：このプロセスは、主にメーカーの推奨に従っています。
4. 光学顕微鏡を用いて、マイクロ流体チャネルを探します。基準となる光学像の中心を使用し、二次イオン像の中心と一致するように、それを揃えます。
5. 各測定の前に、表面汚染を除去するために〜15秒500×500μmの²エリアでのSiNウィンドウにスキャンする1キロ電子ボルトのO ₂ ⁺ビーム（〜40 NA）を使用します。また、すべての測定中に表面の帯電を補償するために、電子フラッド銃を使用しています。このステップのデフォルトモードでフラッドガンの自動機能を使用してください。
6. データ収集の前に正または負のモードを選択します。すべての測定における一次イオンビームとして25 keVのバイ₃ ⁺ビームを使用してください。
   注：手順は、同様のFですまたは正と負のデータ取得。スペースの関心については、ポジティブモードは、ここで詳細に説明されています。
   1. デプスプロファイリング
      1. 32ピクセルの解像度によって32ピクセルで〜2ミクロンの直径を有する円形のエリアでのBi ₃ ⁺ビームを走査します。
      2. パンチスルーするのSiN膜に必要な時間を最小限に抑えるために、長いパルス幅を使用する（ すなわち 、180ナノ秒、100マイクロ秒のサイクルタイムでのビーム電流〜1.0 PA）のBi ₃ ⁺ビーム。液面の上昇からの二次イオンを表すの強度は、パンチスルーが達したとき。パンチスルー時間は、このSiN膜のバッチに応じて、300秒から500秒まで変化します。
         注：この違いは、我々の経験に応じて取得したSiN膜のバッチに関連すると思われます。しかし、パンチスルー時間は本当にデータ分析には影響を与えません。
      3. このSiN膜のパンチスルーした後、約200秒で同じ最新の状態に保ちます2D画像再構成のための十分なデータを得ます。
      4. 優れた質量分解能でスペクトルを取得するために、データ収集のために80ナノ秒にパルス幅を減らします。さらに約200秒間、この買収を続けます。 図1に示されたスペクトルデータは、この領域から得られます。
   2. 2Dイメージングおよび質量スペクトル
      1. プロファイリングデータを深さを測定すると同時に、2Dイメージングおよび質量スペクトルデータを収集します。 TOF-SIMSの測定器は、実験中に各スポットのすべての情報を保存します。 （ - スペクトル、FPanel - プロファイルとFPanel - 個別に画像FPanel）デジタル制御ソフトウェアのデータが別のウィンドウに表示されています。慎重にデータ取得時に各パネルのデータを確認してください。

5. TOF-SIMSデータ解析

注：データ解析は、最初IonToF TOF-SIMS楽器ソフトウェアを使用して行われます。

1. ANを開きます。次いで、SIMS（測定エクスプローラ）とのalysisソフトウェアは、深さプロファイルのm / zスペクトル、及び画像データを処理するために、それぞれ、「プロファイル」、「スペクトル」と「画像」ボタンをクリックします。
2. 拡張子「.ita」を持っているデータファイルを開きます。
3. 関心のピークを選択し、「イオン」ボックスに種名を入力し、スペクトルの異なる色でそれらにラベルを付けます。 x軸に沿ってドラッグして、マウスのスクロールホイールを使用してください。ピーク高さと幅を調整するには、Ctrlとスクロールホイールを使用してください。 y軸に沿ってリニアとログモード間の文字「L」スイッチ。
4. 質量校正前にデータの再構築を行っています。それ以外の場合は、質量較正ステップのピーク間の間隔を選択することは困難です。
   1. 関心の深さプロファイリングデータを選択し、深さプロファイル時系列に従ってスペクトルを再構築します。
   2. 復興ボタンをクリックします。 int型の走査範囲で「スタート復興」ウィンドウで、タイプerest。深さプロファイルデータを再構築するために「OK」をクリックします。
5. 質量キャリブレーションを実行します。押して「F3」は「質量キャリブレーション」ウィンドウを開きます。 。特定のサンプルに基づいて、本研究では^21を校正するためのピークを選択して、CH ₃ ^+（のm / z 15）、H ₃ O ^+（のm / z 19）以下のピークを使用し、C ₂ H ₅ ^+（のm / z 29 _）、H 5 O ₂ ^+（M / Z _37）、C 3 H ₇ ^+（M / Z 43）、H ₇ O ₃ ^+（M / Z 55）、H ₉ O ₄ ^+（M / Z 71） H ₁₁ O ₅ ^+（のm / z 99）とポジティブモード用H _{13 O} 6 ^+（のm / z 109）。以下のピークCH使用^{- （}のm / z 13）、O ^{- （}のm / z 16）、OH ^{- （}のm / z 17）、C ₂ H ^{- （}のm / z _25）、C 3 H ^{- （}のm / z 37）、およびC ₄ H ^- （M / Z 49）ネガティブモードで。
   1. ピークを選択し、下向きの矢印は、ウィンドウの左下隅にあるピークに指摘されていることを確認してください。そのピークをクリックして、「質量キャリブレーション」ウィンドウ内のピーク名を入力し、「追加」をクリックし、目的のイオンは、質量キャリブレーションに含まれています。
   2. 最後に、「再校正」ボタンをクリックします。ピークの面積は電荷比、それらの質量に応じて適切な場所にあるかどうかを確認してください。 「スペクトラム」メニューで、選択して行われている特定の分析に応じて、「すべてのスペクトル」または「選択したスペクトル」に「マスキャリブレーションの適用」をクリックします。
6. ピーク選択は、サンプル分析のために必要であるように、文学や他の以前の知見によれば、試料の特徴的なピークを決定します。 m / zスペクトルにおける関心のピークの強度を比較してください。必要に応じて、ピークリストに無用なピークを新たなピークを追加または削除。
   1. ピークを追加します。左下のウィンドウに赤い線を見つけ、ピークをクリックします。ホルDの "Ctrl"キー、自動的にピークリストにピークを追加してピーク幅を、定義するために水平方向にマウスをスクロールします。ピークを追加するもう1つの方法は、メインスペクトルウィンドウでピークを選択するために、次にウィンドウの上に「ピークを追加」ボタンをクリックすることです。 「スペクトラム」メニューで、追加する多くのピークがある場合は、「検索ピーク」を選択し、必要に応じてその後のピークを追加し、新しく開いたウィンドウに関連する仕様をご確認ください。
   2. ピークリストをエクスポートするには、「ピークリスト」メニューで、「保存... "" itmil」形式のピークリストを選択します。スペクトルに沿ってドラッグするCtrlキーと左ボタンを使用してください。スペクトルウィンドウで、関心のピークを選択し、望ましい位置に2本の破線をドラッグします。
   3. ピークリストをインポートするには、「マス間隔リスト」メニューで、「インポート...」を選択し、ファイル拡張子「.ITPL」で、既存のピークリストファイルを探します。 「開く」をクリックしてください。
   4. で、「itmil「ピークリストを使用するには「マス間隔リスト」メニューには、「開く...」をクリックし、ファイルを検索し、「開く」をクリックします。
7. さらに、データを分析するために、ピークリストを適用します。 「スペクトル」ウィンドウの左底部には、「マス間隔リスト」と呼ばれるウィンドウがあります。インポートされたピークリストは、ここに示されています。
   1. 、使用されるピークリストファイルを右クリックし、「アクティブスペクトル」または「全てのスペクトル」に適用します。
8. データプロファイルを表示します。 「プロファイル」ウィンドウで、使用して文字「M」は、y軸に合うようにウィンドウ（フルレンジ）と文字「N」にフィットします。プロファイルの幅を調整するには、Ctrlとスクロールホイールを使用してください。または、「/」を使用し、y軸の範囲と高さを変更するためにキーボード上の「*」。
9. さらに、初期分析後、他のグラフィックソフトを使用してプロットするためのデータをエクスポートします。
   1. 「ファイル」メニューをクリックし、「プロファイル」ウィンドウで、深さプロファイルをエクスポートするには、「エクスポート＆＃を選択その後、34 ;,および「.txtの「ファイル」として保存」を選択します。
   2. 、「スペクトル」ウィンドウで、のm / zスペクトルファイルを書き出す「ファイル」メニューをクリックし、次に「エクスポート」を選択し、「.txtの「ファイル」として保存」を選択します。
   3. 「イメージ」ウィンドウ、印刷画面では、画像ファイルをエクスポートし、画像ファイルとして保存します。

6. TOF-SIMSデータプロットとプレゼンテーション

注：SIMSデータは、楽器のソフトウェアを使用して処理された後、データをプロットするグラフィックツールを使用します。

1. データをインポートするグラフィックツールを使用します。
2. 再構成されたスペクトルを示すために、y軸とx軸とのピーク強度としてのm / zを使用してプロットをします。例えば、図1に示されています。
3. 再構成された深度プロファイル時系列を表示するには、y軸とx軸とのピーク強度として、スパッタ時間を使ってプロットをします。例はFiguに与えられています2再。
4. 異なるのm / zの再構成された2次元画像を合成し、イオンマッピングを表示するマトリックスを形成します。例が図2に示されています。

結果

代表的な結果の対は、提案されたプロトコルの利点を実証するために提示されています。サルヴィマイクロ流体インターフェイスを使用して、一次イオンビーム（BI ₃ ^{+）を直接}脱イオン水中で水和フィブロネクチンフィルムに衝突することができます。したがって、液体表面の分子の化学的マッピングが正常に取得することができます。

図1aは、それぞれ、水和フィブロネクチン膜とDI水の正のTOF-SIMSのマススペクトルを示す図1b。水クラスター（ すなわち 、のm / z 19、37、55、73、91および109）およびアミノ酸断片を含む関心のピーク（ すなわち 、のm / z 30、44、61、74、81、83、および98）赤い矢印で示されています。広く乾燥タンパク質サンプルを使用して報告されているアミノ酸断片の特徴的ピーク...

ディスカッション

サルヴィは、TOF-SIMS、走査型電子顕微鏡（SEM）等の真空ベースの機器によって動的液面と液体 - 固体界面の分析を可能にするマイクロ流体インターフェースです。真空中で液体を直接公開するための小さな開口の使用に、サルヴィは、任意の変更を加えることなく、多くの細く絞った分光法とイメージング技術に適しており、マイクロ流体工学の²²移植性と汎用性は、真のマルチモーダルイメージングプラットフォームにします。明確な特徴や他の既存の技術に比べてサルヴィの重要性は、いくつかの最近のレビューにまとめられている。サルビ技術の開発者として^22-25、当社グループは積極的に動的な液体表面と液体-固体界面を含む研究のさまざまなに適用されています。新たなアプリケーションのいくつかの例には、哺乳動物の細胞膜、細菌バイオフィルムの付着、水の表面酸化の結果として^、15,16またはナノ粒子の形成を含みます。このPAであたりは、私たちは罪の表面に吸着した水和タンパク質薄膜の初期液体TOF-SIMSの結果を提示します。

慎重プロトコルで強調表示のステ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	解像度: >10,000 m/Δmは質量分解能。>4,000 m/&デルタ;高空間解像度のm
SALVI(Liquid Vacuum Interface)での分析システムパシフィック	ノースウエスト国立研究所	N/A	SALVI は、ToF-SIMS(Time-of-Flight secondary Ion Mass Spectrometry)などの真空ベースの科学機器で初めて、分子レベルでの自然な状態の液体表面の分析を可能にした、独自の自己完結型のポータブル分析ツールです。
5軸サンプルステージ			は、ToF-SIMS
バーンステッドナノ純水浄化システム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D11921	ROpure LP逆浸透ろ過モジュール(D2716)
シリンジ	BD	309659	1ml
ピペットにSALVIを取り付けるための自作です	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21-377-821	範囲:100〜1,000 ml
ピペットチップ	プチューン	2112.96.BS	1,000 & マイクロ;l
遠心分離チューブ	コーニング	430791	15 ml
フィブロネクチン	Sigma-Aldrich	F1141	1 mg/ml
エタノール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	サイ	95% 変性
Gibco PBS	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010-023	pH 7.4