マウス脳スライスの準備中に発作のような活動の直流刺激とマルチ電極アレイ録音

Summary

研究によると、陰極経頭蓋直流刺激は薬剤耐性発作に対する抑制効果を生み出すことができます。本研究では、マウスの脳切片調製において、直流刺激と発作様活動の多電極アレイ記録を評価するin vitro実験装置を考案した。直流刺激パラメータを評価しました。

Abstract

陰極経頭蓋直流刺激（TDCの）は、薬剤耐性発作の抑制効果を誘導します。効果的なアクションを実行するために、刺激パラメータ（ 例えば 、配向、磁界強度、および刺激期間）は、マウスの脳スライス標本で検査する必要があります。試験マウスの脳切片の位置に電極の向きを配置も可能です。本発明の方法は、前帯状皮質の発作のような活動にDCSの効果を評価するthalamocingulate経路を保持します。マルチチャンネル・アレイ・レコーディングの結果は陰極DCSが大幅に4-アミノピリジン及びビククリン誘発性発作様活性の刺激誘発応答の振幅および持続時間を減少することが示されました。この研究はまた15分で陰極DCSアプリケーションがthalamocingulate経路の長期不況を引き起こしたことがわかりました。本研究は、thalamocingulat上のDCSの影響を調査します電子シナプス可塑性および急性発作のような活動。現在の手順は、in vitroマウスモデルにおける配向、磁界強度、および刺激期間を含む最適な刺激パラメータをテストすることができます。また、この方法は、両方の携帯電話やネットワークレベルでの皮質発作のような活動にDCSの効果を評価することができます。

Introduction

てんかんは一般的な神経障害です。てんかん患者の30%が薬剤耐性発作に苦しんでいます¹。経頭蓋直流刺激(tDCS)は、発作などの大きな脳領域にわたるネットワーク活動を制御または変更するための非侵襲的なアプローチを提供します。臨床研究では、tDCSが難治性発作^{を効果的に}治療し2、発作^3-5に対して短期的および長期的な抑制効果を生み出すことができることが示されています。しかし、tDCSの作用の治療メカニズムはまだ不明です。提示された脳スライスモデルは、tDCS作用の治療メカニズムが発作様脳活動の症状をどのように変化させるかを調べるためのin vitro法です。したがって、その最適な効果を得るためには、方位、電界強度、刺激持続時間などの特定の刺激パラメータを実験モデルでテストする必要があります。これまでの研究では、治療効果を得るためには電界の向きが重要であることが示されています⁶。したがって、試験された脳スライスの位置に対する電極の向きを試験し、配置することが可能です。

前頭葉てんかんと前帯状皮質（ACC）発作は、しばしば薬剤耐性です^7,8.いくつかの研究では、帯状皮質^9-11におけるtDCSの適用が報告されています。tDCSは、ACC活動の変化を通じて警戒、意思決定、および感情に影響を与えることが示されており、この脳領域のニューロンの....

Protocol

動物被験体が関与する手順は、施設内動物管理と活用委員会、中央研究院、台北、台湾によって承認されました。

1.多電極アレイ記録のための実験的なソリューションと機器を準備

1. 人工脳脊髄液（aCSFの調製95％のO ₂を通気124ミリモルのNaCl、4.4ミリモルのKCl、1mMののNaH ₂ PO _3、2mMのMgSO ₄を、2ミリモルのCaCl _2、25mMのNaHCO ₃を、10 mMグルコース、および5％CO _2）。
2. 6×10の平面MEAと8×8 MEA：MEAプローブの2種類を使用してください。前者のようなプローブは、皮質、線条体、および視床を備える領域を覆います。後者のプローブは、唯一の皮質領域をカバーしています。
3. 0.1 Hzから1200増幅で3 kHzの間に設定したバンドパスフィルタで60チャンネルアンプを使用してください。 10 kHzのサンプリングレートでデータを取得します。
4. DCS用MEA室内2のAgClコート銀ワイヤを配置します。 AgClを使用してくださいコー​​ティングされた銀ワイヤは、単離された刺激装置によって生成される電界を生成します。
5. タングステン電極（;長さ、7.62センチメートル; 8°ACテーパー....

Results

ThalamocingulateスライスとMEA記録システムのセットアップの準備

マウスからのMT-ACCスライスはthalamocingulate経路の電気生理学的特性の探査を可能にする特殊なスライス標本である。 図1Aは、MT-ACCスライスが用意された方法を示しています。マウスの脳を速やかに除去し、（ 図1A、B）クール酸素aCSFの中に保持しました。皮質下の解剖学的構造を明らかにするために、脳2.0 mmは矢状脳ブロック（ 図の1A、C、D）を取得するために、各半球に正中線からの横切断しました。二つの傾斜腹カットはthalamocingulate経路を保持するために、脳のブロ​​ックで行われました。最初のクロスカットは、脳のブロ​​ックの前に線条体における可視光ファイバ管に平行に行われました。第二クロスカットは、接続ベットから脳ブロックの後部に.......

Discussion

本研究では、ACC発作様活性にDCSの持続時間と方向の効果を試験しました。マウス脳切片で安定したデータを取得するには、どのようにMT-ACC経路の整合性を保つために、それは、2角度を付け腹カットと皮質の背側カットが行われている、特にステップキーである損傷を避けるために。また、脳スライスを準備する時間も新鮮で強い脳を維持するための最短時間であるべき脳切片の活性に影響を与えることができます。以前の研究では、標的組織への電気化学的な損傷はin vivoでの準備¹⁵で発生する可能性があることを示しました。 インビトロでの脳スライス標本は、この問題を回避するために使用することができます。 in vitroでの準備では、組織は、直接このように、電気化学的効果^16を最小限^に抑え、電極に接触しません。 DCSの効果は、異なる方向に配向された電極と比較しました。ときelectrodESは90°、270°に配向された、DCSは誘発活性（ 図3）には影響しませんでした。した.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<ストロング>麻酔薬:
イソフルラン	ハロカーボンプロダクツコーポレーション	NDC 12164-002-25	4%
Name	会社	カタログ番号	コメント
aCSF(total:1 L):
D(+)-Glucose	MERCK	1.08337.1000	10 mM
炭酸水素ナトリウム	MERCK	1.06329.0500	25 mM
塩化ナトリウム	MERCK	1.06404.1000	124
mM(+)-ナトリウム L-アスコルビン酸、>=98%	SIGMA	A4034-100G	0.15 g/2 c.c
硫酸マグネシウム、無水、試薬プラス	SIGMA	M7506-500G	2 mM
塩化カルシウム二水和物	MERCK	1.02382.1000	2 mM
リン酸二水素ナトリウム一水和物	MERCK	1.06346.1000	1 mM
塩化カリウム	5月 &Baker Ltd Dagenham England	MS 7616	4.4 mM
Name	企業	カタログ番号	Comments
Drugs:
(+)-Bicuculline	TOCRIS	0130	5 µaCSF
4-アミノピリジン	TOCRIS	0940	250 µ の MA CSF
Name	会社	カタログ番号	コメント
Brainスライス 準備:
Vibratome	Vibratome	Series 1000	Block slicing into 500 µm thick
slices名前	会社	カタログ番号	コメント
MEAシステム:
Multielectrode Array(MEA)プローブ:6 x 10平面MEA	マルチチャネルシステム	60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10	電極径、30 & マイクロ;m;電極間隔、500 & マイクロ;m;インピーダンス、50 k&Ω;200 Hz
マルチ電極アレイ(MEA)プローブ:8 x 8 MEA	Ayanda Biosystems	60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8	ピラミッド型電極; 直径, 40 & マイクロ;m;先端の高さ、50&マイクロ;m;電極間隔、200&マイクロ;m;インピーダンス、1,000 kΩ200 Hzで
60チャンネルアンプを使用し、バンドパスフィルターを0.1 Hz〜3 KHzに設定、1,200倍増幅でマルチ	チャンネルシステム	MEA-1060-BC
MCラックソフトウェア、10 KHzサンプリングレートで	チャンネルシステム	データ収集と録音制御用マルチ
	STG	1002
スライスアンカーキットとホールドダウン	ワーナーインスツルメンツ	SHD-26H / 10;WI64-0250
蠕動ポンプ-ミニパルス3	ギルソム	MINIPULS3	灌流速度:8 ml /分
名前	会社	カタログ番号	コメント
刺激システム:
Isolated stimulator	AMシステム	モデル2100	の強度±350 μ;A 、持続時間 200 μ視
床に配置された	電極	AMシステム	575300