このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

マウス脳スライスの準備中に発作のような活動の直流刺激とマルチ電極アレイ録音

10.2K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/53709

⸱

2016年6月7日

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, 2Department of Anesthesiology, University of Alabama at Birmingham

この記事について

サマリー

研究によると、陰極経頭蓋直流刺激は薬剤耐性発作に対する抑制効果を生み出すことができます。本研究では、マウスの脳切片調製において、直流刺激と発作様活動の多電極アレイ記録を評価するin vitro実験装置を考案した。直流刺激パラメータを評価しました。

要約

陰極経頭蓋直流刺激（TDCの）は、薬剤耐性発作の抑制効果を誘導します。効果的なアクションを実行するために、刺激パラメータ（ 例えば 、配向、磁界強度、および刺激期間）は、マウスの脳スライス標本で検査する必要があります。試験マウスの脳切片の位置に電極の向きを配置も可能です。本発明の方法は、前帯状皮質の発作のような活動にDCSの効果を評価するthalamocingulate経路を保持します。マルチチャンネル・アレイ・レコーディングの結果は陰極DCSが大幅に4-アミノピリジン及びビククリン誘発性発作様活性の刺激誘発応答の振幅および持続時間を減少することが示されました。この研究はまた15分で陰極DCSアプリケーションがthalamocingulate経路の長期不況を引き起こしたことがわかりました。本研究は、thalamocingulat上のDCSの影響を調査します電子シナプス可塑性および急性発作のような活動。現在の手順は、in vitroマウスモデルにおける配向、磁界強度、および刺激期間を含む最適な刺激パラメータをテストすることができます。また、この方法は、両方の携帯電話やネットワークレベルでの皮質発作のような活動にDCSの効果を評価することができます。

概要

てんかんは一般的な神経障害です。てんかん患者の30%が薬剤耐性発作に苦しんでいます1。経頭蓋直流刺激(tDCS)は、発作などの大きな脳領域にわたるネットワーク活動を制御または変更するための非侵襲的なアプローチを提供します。臨床研究では、tDCSが難治性発作を効果的に治療し2、発作3-5に対して短期的および長期的な抑制効果を生み出すことができることが示されています。しかし、tDCSの作用の治療メカニズムはまだ不明です。提示された脳スライスモデルは、tDCS作用の治療メカニズムが発作様脳活動の症状をどのように変化させるかを調べるためのin vitro法です。したがって、その最適な効果を得るためには、方位、電界強度、刺激持続時間などの特定の刺激パラメータを実験モデルでテストする必要があります。これまでの研究では、治療効果を得るためには電界の向きが重要であることが示されています6。したがって、試験された脳スライスの位置に対する電極の向きを試験し、配置することが可能です。

前頭葉てんかんと前帯状皮質（ACC）発作は、しばしば薬剤耐性です7,8.いくつかの研究では、帯状皮質9-11におけるtDCSの適用が報告されています。tDCSは、ACC活動の変化を通じて警戒、意思決定、および感情に影響を与えることが示されており、この脳領域のニューロンの興奮性と発作活動を調節することができます12。したがって、ACC発作に対するtDCSの抑制効果は、臨床治療や代替治療の評価に役立つ可能性があります。

現在のプロトコルは、脳スライスのDCSのための記録チャンバー内の電極の準備と、それが多電極アレイ(MEA)による発作様活動記録に及ぼす影響を説明しています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

動物被験体が関与する手順は、施設内動物管理と活用委員会、中央研究院、台北、台湾によって承認されました。

1.多電極アレイ記録のための実験的なソリューションと機器を準備

  1. 人工脳脊髄液（aCSFの調製95％のO 2を通気124ミリモルのNaCl、4.4ミリモルのKCl、1mMののNaH 2 PO 3、2mMのMgSO 4を、2ミリモルのCaCl 2、25mMのNaHCO 3を、10 mMグルコース、および5％CO 2）。
  2. 6×10の平面MEAと8×8 MEA：MEAプローブの2種類を使用してください。前者のようなプローブは、皮質、線条体、および視床を備える領域を覆います。後者のプローブは、唯一の皮質領域をカバーしています。
  3. 0.1 Hzから1200増幅で3 kHzの間に設定したバンドパスフィルタで60チャンネルアンプを使用してください。 10 kHzのサンプリングレートでデータを取得します。
  4. DCS用MEA室内2のAgClコート銀ワイヤを配置します。 AgClを使用してくださいコー​​ティングされた銀ワイヤは、単離された刺激装置によって生成される電界を生成します。
  5. タングステン電極（;長さ、7.62センチメートル; 8°ACテーパーチップ;直径、127μmの抵抗、5MΩ）を配置視床刺激のために、およびMEAのチャンバー内の参照電極を配置します。パルス発生器によって制御され、単離された刺激装置を用いて、タングステン電極の電流を供給。

2.脳スライスの準備

  1. 4-8週齢の雄のC57BL / 6Jマウスを、使用してください。食料と水を自由にアクセスできるハウスエアコンの動物（12時間/ 12時間の明/暗サイクル、午前8:00に点灯21-23°C;湿度50％）。
  2. ステップ1.1で調製したaCSFの250mlのアリコートを取り、氷を含んでいるビーカーに入れてください。同時に、95％O 2および5％CO 2で構成されている連続的なガスを供給する。
  3. 手術
    1. ガラス中の4％イソフルランで動物を麻酔約3分間の箱。動物は（つま先のピンチへの応答の欠如によって示される）麻酔の外科的な深さに達すると、砕いた氷で満たされている浅いトレイの上に置き、はさみを使用してヘッドを取り外します。
    2. 頭蓋骨を露出させ、残りの筋肉を切り落とします。次に、骨鉗子を使用して、脳から頭蓋骨の背側表面をはがします。骨鉗子を用いて、頭蓋骨の側面を切り取ります。 75％エタノール溶液で手術器具の全てを滅菌します。
    3. スパチュラを用いて、脳の腹側表面に沿って嗅球と神経接続を切断し、脳を取り出します。断頭後、速やかに氷のように冷たい酸素化にaCSFで満たされたビーカーに脳を転送します。
  4. 内側視床（MT）-ACC脳スライスの作製
    注：ACC 13へのMTからの経路が含まれているスライスを準備します。
    1. ハンドカットの2矢状カット各半球における正中線に横2.0ミリメートルと脳のブロックを皮質下の解剖学的構造を表示します。その後、2角度付きカットを行います。線条体における可視光ファイバ管への最初のクロスカット、平行してください。
    2. thalamocingulate経路に腹側と平行で前交連と視索の間の中間点に小脳と視覚野との間の接続から第二のクロスカットを行います。
    3. シアノアクリレート系接着剤で、角板（〜120°）に脳のブロックを取り付け、単に経路の転換点以上のカットを行います。プレートを広げ、それを平らにし、ビブラトームのチャンバステージの上にのり。
    4. 内側視床-ACC脳切片（厚さの500μm）を作成した後、記録室に氷のように冷たい酸素aCSF.Transferスライスでそれらを浸し、そして1のために酸素aCSFので連続灌流（12ミリリットル/分）下で32℃で維持時間。

多電極アレイ記録用灌流チャンバーの調製

  1. 準備灌流チャンバーの
    1. マルチチャネルシステム上MEAプローブを配置し、蠕動ポンプにプローブを接続するために2つの別々のポリエチレン管を使用しています。 MEA室と室の外にaCSFを導くために、他のチューブにaCSFのを案内するために、1つのチューブを使用してください。最後に、継続的に暖かい（29-30℃）で酸素化にaCSF（8 ml /分）で準​​備を灌流。
  2. MEAに脳スライスを転送します。湿った綿棒を使用して、MEAの脳切片を押したままにします。慎重にACCが電極上に指向されていることを確認するために脳スライスを移動します。
  3. スライスアンカーキットを使用して、脳切片を押してダウンを保持します。このステップは、スライスと電極との間の良好な電気的接続を確実にします。

DCSによって電場の4世代

注：電界配向の定義はACCにおける軸索樹状突起間の軸の方向に基づいていました。樹状突起と細胞体コンパートメントの向きがありましたゴルジ染色12を使用して確認しました。

  1. ACCにAgCl電極（アノードとして定義される）近位に配置し、ACCの遠位に（陰極として定義される）他の電極を配置します。 MEAによる2つの電界の向き（ACC軸索樹状突起間繊維に平行および垂直）によって生成される電界強度を記録し、刺激を用いた電界の電流を供給します。
  2. AgCl電極（約1.5〜2センチメートル）の距離を修正し、ミリアンペア0.5〜2 DCSを作るために刺激装置の現在の強さを調整します。

5.電気的に誘発された皮質シナプス応答

注：プログラム可能な電気刺激発生器は、長方形の二相性の電流パルスを生成するには、MTに電気刺激によってACCにおけるシナプス応答を誘導します。

  1. 上記の繰り返しセクション3。
  2. MTでタングステン電極を配置し、サールに刺激からのパルスを届けます双極タングステン電極を介して、スライスのアミック地域。
  3. ACC応答を誘発するしきい値を決定するために、さまざまな現在の強度を使用してください。ここでは、ほとんどのスライスでACCで80％最大応答を誘発した200マイクロ秒の±150μAの強度および持続時間を、使用しています。
  4. 最適な応答プロファイルを得るために、MT-ACCスライスに（脳梁にMTから）thalamocingulate経路に沿ってタングステン電極を移動します。
  5. ACC応答の10-20スイープを作成し、MTの刺激により誘発されるACCのすべてを自動的に平均化するためのソフトウェアを使用しています。 MT-ACC経路によってMT刺激から誘導されたACCにおけるシナプス応答ISS結果。

6.電気的に誘発される発作のような活動

発作様活性は、4-アミノピリジンの適用により誘導された（4-AP; 250μM）およびビククリン（5μM）：注意してください。前回コントロール研究は、最大かつ安定した応答が現れたことを示しました薬物適用14後の2〜3時間。

  1. 上記の繰り返しセクション5。
  2. 灌流液に薬物を追加します。 4-AP（250μM）を使用し、ビククリン（5μM）。均一に薬を混ぜて、2-3時間灌流を続けます。
  3. 発作様活性を容易にするために、また、pH勾配のビルドアップを防ぐことができ、比較的速い灌流速度（8ミリリットル/分）、で灌流ポンプを維持します。
  4. MTでタングステン電極を配置し、ACCの応答プロファイルを得るために、電気刺激（150μA、200マイクロ秒の持続時間）を提供します。
  5. 10-20スイープを作成し、応答を平均します。
  6. 薬物を洗い流すために、新鮮なaCSFの灌流液を交換してください。繰り返しステップ6.5。

誘発皮質応答に対するDCS 7.テスト効果

  1. 繰り返しセクション3と4は、Mの内側に配置された2つの並列のAgClコート銀ワイヤ間の電流を流すことにより生成される均一な電界を確認してくださいEA室。問題がない場合、DCSは0.5と2ミリアンペアの間にとどまります。
  2. DCSの電源をオフにして、（150μA、200マイクロ秒の持続時間を±）視床を刺激するためにタングステン電極を配置します。 ACCの最大シナプス応答を得るために、10月20日スイープを作成し、応答を平均します。
  3. 同時に、DCS（2 MV / mmのDCSの強さ）と視床刺激（350μA、200マイクロ秒の持続時間）をオンにします。 DCS中の視床刺激誘発ACC応答の振幅の変化を評価します。
  4. DCSの電源をオフにし、灌流液に4-AP（250μM）およびビククリン（5μM）を追加します。その後、2〜3時間を待ちます。薬は脳切片に影響を与える場合には、スライスは、皮質発作応答を生成します。
  5. ACC応答の10-20スイープを行い、その後、電気誘発皮質発作応答の振幅と持続時間を測定します。
  6. ステップ7.5の後、同時にDCS（2 MV / mmのDCSの強さ）と視床刺激（150μA、200 duratiをオンにしますマイクロ秒に）。 DCSアプリケーションの間に誘発された皮質の発作応答の振幅と持続時間の変化を評価します。
  7. 薬物を洗い流すために、新鮮なaCSFの灌流液を交換し、リピートは7.2と7.3を繰り返します。
  8. 異なる実験条件にデータを記録するすべてのデータを収集し、グループ。異なる実験条件の下で皮質発作応答の振幅と持続時間を評価します。

8.データ解析

  1. （ 例えば 、MCラックソフトウェア）が自動的に記録された応答を平均化するためのソフトウェアを使用して、スプレッドシートに生データをエクスポートします。生データの振幅と持続時間を分析し、色の数値を生成します。
  2. 振動発作イベントを検出するために、ベースライン値と標準偏差（SD）を測定するためのソフトウェアを使用しています。閾値として、ノイズレベルの3 SDを設定します。このしきい値を超える振動イベント中のピークの振幅が自動的に検出されていますエド。
  3. スチューデントのt検定を用いて統計分析を行います。
  4. スライスの数を示すnのエクスプレスの測定値と平均値±SEとしてテキストで分散分析（ANOVA）の結果の一方向分析は、12を検討しました 。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

ThalamocingulateスライスとMEA記録システムのセットアップの準備

マウスからのMT-ACCスライスはthalamocingulate経路の電気生理学的特性の探査を可能にする特殊なスライス標本である。 図1Aは、MT-ACCスライスが用意された方法を示しています。マウスの脳を速やかに除去し、（ 図1A、B）クール酸素aCSFの中に保持しました。皮質下の解剖学的構造を明らかにするために、脳2.0 mmは矢状脳ブロック（ 図の1A、C、D）を取得するために、各半球に正中線からの横切断しました。二つの傾斜腹カットはthalamocingulate経路を保持するために、脳のブロ​​ックで行われました。最初のクロスカットは、脳のブロ​​ックの前に線条体における可視光ファイバ管に平行に行われました。第二クロスカットは、接続ベットから脳ブロックの後部に...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

本研究では、ACC発作様活性にDCSの持続時間と方向の効果を試験しました。マウス脳切片で安定したデータを取得するには、どのようにMT-ACC経路の整合性を保つために、それは、2角度を付け腹カットと皮質の背側カットが行われている、特にステップキーである損傷を避けるために。また、脳スライスを準備する時間も新鮮で強い脳を維持するための最短時間であるべき脳切片の活性に影響を与えることができます。以前の研究では、標的組織への電気化学的な損傷はin vivoでの準備15で発生する可能性があることを示しました。 インビトロでの脳スライス標本は、この問題を回避するために使用することができます。 in vitroでの準備では、組織は、直接このように、電気化学的効果16を最小限に抑え、電極に接触しません。 DCSの効果は、異なる方向に配向された電極と比較しました。ときelectrodESは90°、270°に配向された、DCSは誘発活性（ 図3）には影響しませんでした。した...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、競合する利益はないと宣言する。

謝辞

私たちは、中央研究院の神経回路電気生理学コアからの技術サポートに感謝しています。この研究は、全米学術会議(102-2320-B-001-026-MY3および100-2311-B-001-003-MY3)および中央研究院の神経科学プログラムの支援を受けました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<ストロング>麻酔薬:
イソフルランハロカーボンプロダクツコーポレーション NDC 12164-002-254%
Name会社カタログ番号コメント
aCSF(total:1 L):
D(+)-GlucoseMERCK1.08337.100010 mM
炭酸水素ナトリウムMERCK1.06329.050025 mM
塩化ナトリウムMERCK1.06404.1000124
mM(+)-ナトリウム L-アスコルビン酸、>=98%SIGMAA4034-100G0.15 g/2 c.c
硫酸マグネシウム、無水、試薬プラスSIGMAM7506-500G2 mM
塩化カルシウム二水和物MERCK1.02382.10002 mM
リン酸二水素ナトリウム一水和物MERCK1.06346.10001 mM
塩化カリウム5月 &Baker Ltd Dagenham EnglandMS 76164.4 mM
Name企業カタログ番号Comments
Drugs:
(+)-BicucullineTOCRIS01305 µaCSF
4-アミノピリジンTOCRIS0940250 µ の MA CSF
Name会社カタログ番号コメント
Brainスライス 準備:
VibratomeVibratomeSeries 1000Block slicing into 500 µm thick
slices名前会社カタログ番号コメント
MEAシステム:
Multielectrode Array(MEA)プローブ:6 x 10平面MEAマルチチャネルシステム60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10電極径、30 & マイクロ;m;電極間隔、500 & マイクロ;m;インピーダンス、50 k&Ω;200 Hz
マルチ電極アレイ(MEA)プローブ:8 x 8 MEA Ayanda Biosystems60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8ピラミッド型電極; 直径, 40 & マイクロ;m;先端の高さ、50&マイクロ;m;電極間隔、200&マイクロ;m;インピーダンス、1,000 kΩ200 Hzで
60チャンネルアンプを使用し、バンドパスフィルターを0.1 Hz〜3 KHzに設定、1,200倍増幅でマルチチャンネルシステムMEA-1060-BC
MCラックソフトウェア、10 KHzサンプリングレートでチャンネルシステムデータ収集と録音制御用マルチ
STG1002
スライスアンカーキットとホールドダウンワーナーインスツルメンツSHD-26H / 10;WI64-0250
蠕動ポンプ-ミニパルス3ギルソムMINIPULS3灌流速度:8 ml /分
名前会社カタログ番号コメント
刺激システム:
Isolated stimulatorAMシステムモデル2100の強度±350 μ;A 、持続時間 200 μ視
床に配置された電極AMシステム575300
マルチ パルス発生器のチャンネルシステム secタングステン

参考文献

  1. Schiller, Y., Najjar, Y. Quantifying the response to antiepileptic drugs: effect of past treatment history. Neurology. 70 (1), 54-65 (2008).
  2. Fregni, F., et al. A controlled clinical trial of cathodal DC polarization in patients with refractory epilepsy. Epilepsia. 47 (2), 335-342 (2006).
  3. Auvichayapat, N., et al. Transcranial direct current stimulation for treatment of refractory childhood focal epilepsy. Brain Stimul. 6 (4), 696-700 (2013).
  4. Chung, M. G., Lo, W. D. Noninvasive brain stimulation: the potential for use in the rehabilitation of pediatric acquired brain injury. Arch Phys Med Rehabil. 96 (4 Suppl), S129-S137 (2015).
  5. Del Felice, A., Magalini, A., Masiero, S. Slow-oscillatory Transcranial Direct Current Stimulation Modulates Memory in Temporal Lobe Epilepsy by Altering Sleep Spindle Generators: A Possible Rehabilitation Tool. Brain Stimul. 8 (3), 567-573 (2015).
  6. Garnett, E. O., Malyutina, S., Datta, A., den Ouden, D. B. On the Use of the Terms Anodal and Cathodal in High-Definition Transcranial Direct Current Stimulation: A Technical Note. Neuromodulation. , (2015).
  7. Biraben, A., et al. Fear as the main feature of epileptic seizures. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 70 (2), 186-191 (2001).
  8. Zaatreh, M. M., et al. Frontal lobe tumoral epilepsy: clinical, neurophysiologic features and predictors of surgical outcome. Epilepsia. 43 (7), 727-733 (2002).
  9. Karim, A. A., et al. The truth about lying: inhibition of the anterior prefrontal cortex improves deceptive behavior. Cereb. Cortex. 20 (1), 205-213 (2010).
  10. Keeser, D., et al. Prefrontal transcranial direct current stimulation changes connectivity of resting-state networks during fMRI. J. Neurosci. 31 (43), 15284-15293 (2011).
  11. Nelson, J. T., McKinley, R. A., Golob, E. J., Warm, J. S., Parasuraman, R. Enhancing vigilance in operators with prefrontal cortex transcranial direct current stimulation (tDCS). Neuroimage. 85 (Pt 3), 909-917 (2014).
  12. Chang, W. P., Lu, H. C., Shyu, B. C. Treatment with direct-current stimulation against cingulate seizure-like activity induced by 4-aminopyridine and bicuculline in an in vitro mouse model. Exp. Neurol. 265, 180-192 (2015).
  13. Lee, C. M., Chang, W. C., Chang, K. B., Shyu, B. C. Synaptic organization and input-specific short-term plasticity in anterior cingulate cortical neurons with intact thalamic inputs. Eur. J. Neurosci. 25 (9), 2847-2861 (2007).
  14. Chang, W. P., Shyu, B. C. Involvement of the thalamocingulate pathway in the regulation of cortical seizure activity. Recent Research Developments in Neuroscience. Pandalai, S. G. 4, Research Signpost. Kerala. 1-27 (2013).
  15. Brummer, S. B., Turner, M. J. Electrochemical considerations for safe electrical stimulation of the nervous system with platinum electrodes. IEEE Trans. Biomed. Eng. 24 (1), 59-63 (1977).
  16. Durand, D. M., Bikson, M. Suppression and control of epileptiform activity by electrical stimulation: a review. Proc. IEEE. 89 (7), 1065-1082 (2001).
  17. Fritsch, B., et al. Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning. Neuron. 66 (2), 198-204 (2010).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

視床帯状路前帯状皮質電場強度刺激持続時間電極方向カソードtDCS
マウス脳スライスの準備中に発作のような活動の直流刺激とマルチ電極アレイ録音
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。