方法論記事

細胞を含んだハイドロゲルの刺激細胞挙動のひずみ勾配チップ

DOI：

10.3791/53715

⸱

2017年8月8日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of NanoEngineering and MicroSystems, National Tsing Hua University, 2Department of Engineering and System, National Tsing Hua University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

組織工学用セルの配置を調整する同心円状細胞を含んだハイドロゲルの非連続的なグラデーション静的系統を提供する単純なアプローチを紹介します。

要約

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人工細胞の配置については、組織工学の分野でのホットな話題です。過去の研究のほとんどは、複雑な実験的プロセスおよび汚染の問題に通常関連付けられている質量システム制御、使用して細胞を含んだハイドロゲルのひずみ誘起細胞の単一の位置合わせを調査しました。したがって、この記事では PDMS のプラスチック カバー、UV 透明なガラス基板 3 D ゲルの細胞挙動の刺激のため流体チップを用いた勾配静的ひずみを構築するシンプルなアプローチを提案する.流体の商工会議所でのオーバー ロードの写真パターン形成可能なセル プレポリマーは、カバーの凸曲面 PDMS 膜を生成できます。UV 架橋後湾曲した PDMS 膜とバッファー洗浄、調査細胞の微小環境下で同心円形パターンをさまざまなグラデーションの株の下で動作は外部機器なしの単一の流体チップで自己確立です。NIH3T3 細胞をゲル上 15-65% から様々 なひずみの刺激との連携で、ジオメトリの指導の下で細胞の配置の傾向の変化を観察した後示した。3 日間培養後ハイドロゲル ジオメトリは、細胞が高圧縮ひずみハイドロゲル伸長方向に沿って整列低圧縮ひずみ, セルの配置を支配しました。これらの間は、細胞は、ハイドロゲルの伸長とパターン化ハイドロゲルの幾何学指導の根本的な指導の逸散によるランダムな配置を示した。

概要

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ネイティブの微小環境を模したブロック素材として、ゲルの細胞外マトリックス (ECM) を含む再細胞の成長をサポートする生体模倣組織足場を構築できます。組織の機能を所有するには、組織のセルの配置は必須要件です。さまざまな 2 D (すなわち表面上で培養した細胞) と 3 D (すなわちハイドロゲルにカプセル化細胞) セルの配置は、培養または細胞またはマイクロ フレキシブル基板上にカプセル化することによって達成されている- またはナノ パターン1。マイクロ アーキテクチャの 3 D セルの配置はより魅力的な微小環境は、ネイティブの組織構築2,3,4に近いです。3 D のセルの配置のための一般的なアプローチは、ハイドロゲル形2,3の幾何学的なキューです。短軸方向に細胞増殖の制限された空間のため細胞はマイクロ パターン化ハイドロゲルの長軸方向に沿って配置を目指しています。別のアプローチは、ストレッチ方向4,5並列セルの配置を達成するためにゲルに引張のストレッチを適用することです。

圧縮ひずみなどの ECM ゲル上生物物理刺激または電気のフィールドは、適切な組織統合、増殖および分化1,2,3の細胞機能を調整できます。多くの研究は、複数機械制御ユニット4,6,7,8,9を使用して、一度に 1 つのひずみ条件を適用することによって細胞の挙動を調査するために行われています。たとえば、機械式ステップ モーターの使用は圧迫や共通のアプローチ7,10されている 3 D セルでカプセル化されたコラーゲンのゲルの上に伸ばし。しかし、そのような制御装置は余分なスペースを必要とする、インキュベーター7,9,11,12の汚染の問題に直面しています。さらに、大型の楽器は、再現性の高い13を提供する正確に制御環境を与えることはできません。

細胞を含んだヒドロゲルは、医用マイクロ スケールで通常用いられることを考えると、同時に 3 D 模倣構造体外2,14,15,16,17,18細胞の挙動を調査するためのひずみ/ストレッチ刺激の範囲を生成する MEMS 技術を組み合わせることが有利です。たとえば、マイクロ流体チップの PDMS 膜を変形するガス圧を使用して、異なる系統9,16に細胞の分化を運転系統に上昇を与えることができます。ただし、クリーン ルームやモーター、ポンプ、バルブ、圧縮ガスのソフトウェア管理の統合で複雑なチップ製造プロセスなど、多くの技術的課題があります。

この作品は、同心の円形ハイドロゲル パターンと柔軟な PDMS 膜を用いた自律的勾配の静的ひずみマイクロ流体チップを取得する単純なアプローチを紹介します。異なり、既存のアプローチのほとんどは、当社のプラットフォームは黄色い部屋の外を作製できるし、孵化の間に外部機器なしの携帯カプセルのヒドロゲルを同心円のグラデーションの系統を自己生成所有しているポータブルと使い捨ての小型デバイスです。ハイドロゲル形状の組み合わせによって影響を受けた 3T3 繊維芽細胞の挙動と 3 日間のグラデーションひずみチップで 3 D の ECM 模倣環境内セルの配置の観察の間に様々 な引張ストレッチ指導の手がかりを示した。

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プロトコル

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1. GelMA合成

  1. ゼラチン粉末10 gを秤量し、100 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を入れたガラスフラスコに加えます。マグネティックスターバーをフラスコに入れ、フラスコを攪拌ホットプレートに置きます。
  2. フラスコをアルミホイルで覆い、水分の蒸発を防ぎます。ホットプレートの温度を50〜60°Cに設定し、スターラーを100rpmで1時間設定して、ゼラチン粉末をよく溶解します。
  3. ゼラチンが溶解した後、ピペットを使用して8mLの無水メタクリル酸を非常にゆっくりと(1秒に1滴)加えます。60°Cで3時間反応させます。
  4. 予熱したDPBS(40°C)をフラスコに最終容量500 mLまで加え、この混合物を15分間よく含ませて反応を停止させます。
  5. その間、透析膜(カットオフ分子量14kDa)を25cmの長さのチューブに数本カットします。それらを脱イオン(DI)水に15分間浸し、透析チューブの一方の端を閉じるための結び目を作ります。
  6. 適量(30〜60mL)のポリマー溶液を透析チューブにロードし、もう一方の端を閉じます。それらをDI水を入れた5-Lプラスチックビーカーに1週間置きます。DI水を1日2回更新し、透析プロセス中は溶液を40〜50°Cに維持します。
  7. チューブから溶液を500mLのガラス瓶に集めます。500 mLのフィルターカップ(細孔径0.22 μm)に~450 - 500 mLの溶液を注ぎ、フィルターカップに真空を当てて溶液をフィルター膜に通して滅菌します。
  8. 滅菌したポリマーを数本の50mL滅菌チューブに移し、-80°Cの冷凍庫で3〜5日間保存します。
  9. 凍結乾燥機を使用して-80°Cポリマーを1週間凍結乾燥し、GelMAを形成します。GelMAは-80°Cの冷凍庫で保存してください。

2. 3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート(TMSPMA)修飾

  1. 市販のスライドガラスを2つの小片(25 mm x 37.5 mm)に切断し、0.5 M NaOH溶液に4時間浸漬し、スライドを大量のDI水で洗浄します。
  2. スライドを95%エタノールの入ったガラス容器内のラックに置き、超音波装置を使用して43kHzで15分間洗浄します。
  3. スライドガラスを99.5%エタノール中の5%TMSPMAに1時間浸します。
  4. スライドを95%エタノールで洗浄し、スライドを風乾し、TMSPMAコーティングを80°Cのオーブンで2時間アニールします。

3. チップ製造

  1. 厚さ 2 mm のポリメタクリレート (PMMA) プレート 1 枚と 0.3 mm のポリメチルメタクリレート (PMMA) プレートを 1 枚取り、PMMA 表面の片側に両面テープを貼り、片側のライナーをはがします。厚さ2mmのPMMAプレート2枚と、両面テープを巻かずに1mm厚のプレート1枚を残します。
  2. 両面テープを使わずに厚さ2mmのPMMAプレートを42mm×30mmにレーザーカットして底板を製作します。厚さ2mmのPMMAプレートを両面テープでカットし、外形寸法42mm×30mm、内寸37.5mm×25mmの境界枠を作ります。
  3. 厚さ0.3mmのPMMAプレートを両面テープでレーザーカットし、円の反対側に幅2mm、長さ8mmの流路が2つある12mmの中央円にレーザーカットします(図1a)。
  4. PDMSカバーを鋳造するためのPMMAモールドを準備するには、ステップ3.2-3.3のPMMAコンポーネントの3つ（図1b）)を両面テープで組み立てます。
  5. 厚さ2 mmのPMMAプレートと両面テープをレーザーカットして、8.5 mm x 8.5 mmの中空長方形を3 x 3配列にした5 cm x 5 cmのピースにレーザーカットします。さらに5 cm x 5 cmのピースを、4 mmの中空円を3 x 3配列でカットします。厚さ1mmのPMMAプレートを両面テープなしでレーザーカットし、5cm×5cmのPMMAボトムプレートにレーザーカットします。
  6. ステップ 3.5 (図 1c) の 3 つの部品を両面テープを使用して組み立て、PDMS プラグを鋳造するための PMMA 型を準備します。
  7. PDMSエラストマー30gとPDMS硬化剤3gを適切に混合して、PDMSカバーとPDMSプラグを準備し、真空チャンバー内で1時間脱気します。
  8. 1.8〜2.0 gの混合物をPDMSカバー用のPMMA型に鋳造し、適切な量を使用してPDMSプラグ用のPMMA型の各キャビティを充填します。未硬化のPDMS混合物10 gをブランクの10 cmプラスチックプレートにキャストします。これらの金型を真空チャンバーに入れて30分間脱気します。
  9. PDMSを80°Cで2時間硬化させます。金型上で硬化したPDMSを冷却した後、PDMSカバーとPDMSプラグをPMMA金型から取り外します。
  10. PDMSカバーの流路の端に直径約3mmの2つの穴を開けます。
  11. 10cmのプラスチックプレートから成形したPDMSシートを1cm×1cmの立方体に多数カットし、各PDMSキューブに3mmの穴を開けます。未硬化の1 cm x 1 cmのPDMSキューブを2つPDMSカバーの開口部に接着し(中程度のリザーバーとして機能し、グラジエント円形ヒドロゲルパターンの硬化プロセスを支援するため)、80°Cで1時間硬化させます。
  12. 酸素プラズママシン(30 W RF電力(ハイモード)および600 mTorr圧縮空気)または高周波電子コロナ発生器(115 V、50/60 Hz、0.35 A)の下でPDMSカバーと2つのPDMSリザーバーをTMSPMAコーティングスライドに接着し、90秒間のO2プラズマ処理を行います。
  13. PDMSカバーのプラズマ処理表面とTMSPMAスライドを接触させ、Si-O-Si結合の形成を通じて永久結合するためにそれらを密接に押し付けます><。 注:チップを80°Cのオーブンに1時間置くと、接着強度がさらに向上します。
  14. 冷却後、チップを95%エタノールに15分間浸し、風乾します。その後、チップをUV照射で1時間滅菌し、アルミホイルで包んだ箱に入れて層流フードに保管します。

4. 細胞含んだハイドロゲルの静的勾配ひずみ

  1. 25 mm x 37.5 mm のサイズのフォトマスクを、透明フィルムに Figure 2b のレイアウトを印刷してカットします。Figure 2b の印刷サイズを、Figure 2a の寸法に合わせて調整してください。
  2. 10% FBS、1% Pen-Strep、および250 mLのDPBSを含む100 mLのDMEM培地を37°Cの水浴で調製し、細胞培養培地として使用します。
  3. 凍結乾燥したGelMA25 mgを、1.5 mLの黒色微量遠心チューブで予熱した(37°C)細胞培養培地0.3 mLに秤量します。微量遠心チューブを実験室のスターラー/ホットプレートに置き、GelMAが培地に溶解するまで待ちます。
  4. 50 mgの光開始剤を1 mLのDPBSに秤量し、微量遠心チューブに入れ、80°Cのオーブンで15分間、または光開始剤が溶解するまで
    5. 置きます。
  5. ステップ4.4の10%光開始剤を25μL取り、ステップ4.3の微量遠心チューブに加えます。よく混ぜるために数回ピペットで動かします。
  6. 自動セルカウンターを使用して、3 x 106 NIH 3T3細胞をカウントします。懸濁液を200 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を175 μLの細胞培養培地に再懸濁します。
  7. ステップ4.6の細胞溶液をステップ4.5の微量遠心チューブに添加して、5% GelMA、0.5%光開始剤、および~6 x 106 3T3細胞/mLのプレポリマー細胞溶液を得ます。混合後、100 μLの細胞プレポリマーを100 μLのマイクロシリンジにロードします。
  8. フォトマスクの一部を滅菌したグラジエント株チップの底面スライドに手動で位置合わせし(図3aを参照)、その間に少量のDI水を使用して位置を固定するだけです。プレポリマーセル溶液を充填した100μLマイクロシリンジをチップの入口に接続します。
  9. マイクロシリンジを使用して50μLのプレポリマー細胞溶液を流路に置き(図3b図3bを参照)、次にPDMSプラグを使用して出口を差し込む。さらに40 μLの溶液を注入して、円形PDMSメンブレンに凸状の膨らみを作ります。
  10. ステップ4.9のフォトマスク(下)、マイクロシリンジ(入口)、PDMSプラグ(出口)を備えたチップをUVランプ(365 nm、9 mW / cm2)の下に移動させ、30〜45秒間露光して、流体チャンバー内の同心円状のハイドロゲルを架橋します。
  11. PDMSプラグとマイクロシリンジを取り外して、液圧を解放します(図3c)を参照)。予熱したDPBSを充填した1 mLシリンジを使用して、入口から出口までフラッシングして架橋されていない樹脂を3回洗い流します。
  12. 流路に約100μLの細胞培養液を入れます。
  13. チップを滅菌した培養皿に入れ、37°Cの5%CO2雰囲気で1週間培養します。毎日ミディアムをリフレッシュしてください。
  14. インキュベーションの4時間後の0日目に3つのチップを対照群として、3日目に3つのチップを実験セットとして、20倍の対物レンズを備えた顕微鏡を使用して撮影します。ソフトウェア(ImageJなど)を使用して、1行目から12行目までの各ハイドロゲルの線幅を測定し、圧縮ひずみを計算します(図4)
    注:伸び率は、40μLと0μLの線幅差の値を40μLの線幅で割ることによって計算されます。

5. アライメント解析のための細胞染色

  1. シリンジを使用して、細胞を含んだハイドロゲルを固定するために、RTでDPBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)をフローチップに15分間注入します
    注:注意。PFAは有毒であり、取り扱いには注意が必要です。
  2. 溶液をDPBS中の0.5%細胞膜透過溶液と10分間交換して、RTで細胞膜を透過化します。
  3. PBSは、5〜10分の間隔でサンプルを3回洗浄します(ステップ5.1のように、負荷をかけたシリンジを使用)。
  4. 1% BSA溶液をRTで45〜60分間流路にロードします(インレットポートからロードされたシリンジを使用)。
  5. Alexa Fluor 488 phalloidinと共にバイアルにメタノール1.5 mLを添加し、最終濃度6.6 μMのストック溶液を得ます。
  6. ステップ 5.5 で 5 μL の Alexa Fluor 488 ファロイジンを 5 μL 取り出し、200 μL の DPBS で 0.1% BSA で希釈して、最終濃度 0.165 μM の Alexa Fluor 488 ファロイジンを導き出します。
  7. マイクロピペットを使用して200μLの混合物溶液を流路に加え、チップを37°Cで45〜60分間インキュベートしてアクチン染色します。PBSはサンプルを(上記のように)3回洗浄します。
  8. PBSで1 μg/mL DAPIを調製し、チップに流し、細胞核を37°Cで5分間染色します。
  9. DPBSを流路にピペットで注入して染色液を洗い流し、液路チャンバーにPBS溶液を補充して蛍光顕微鏡で画像を撮影します。
  10. 倒立蛍光顕微鏡とCCD検出器、Alexa Fluor 488 phalloidin(アクチン)およびDAPI(核)のex/emのフィルターセットをそれぞれ488/520 nmおよび358/461 nmで使用して、ハイドロゲル中の3T3細胞の蛍光画像を撮影します。

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結果

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完成したグラデーションひずみ刺激チップの各円形のハイドロゲルの機械的変化を比較するためは 0 μ L (図 4 a) の注入量と 40 μ L (図 4 b) では、同じチップの 2 つの各円形のハイドロゲルの線幅をそれぞれ測定しました。各サークルでパーセントの伸びを 0 μ L 注入チップ (図 4 c) に対応するハイドロゲルの線幅で 40 μ L 注入チップの伸びを割ることによって求めた。ヒドロゲルは縦収縮ひずみは横方向の伸張ひずみ量に相当するので非圧縮性材料であります。したがって、40 μ L 注入量とチップのパーセントの伸びを示す 15 65% 伸長圧縮ひずみに変換することができます (補足のファイル 1を参照してください)。

それ...

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ディスカッション

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本稿でハイドロゲル図形指導及び引張ストレッチ後細胞の配向挙動を比較する単純なアプローチについて報告する.柔軟な PDMS 膜は、同心の円形ヒドロゲルの高さ別の生成のためのドームの曲率を作成します。圧力を解放した後 PDMS 膜は自動的にセンターで最大と外側の境界で最小勾配ひずみ/伸長を形成するマイクロ パターンのヒドロゲルに力を適用します。グラデーションの歪みの形成は柔軟な PDMS 膜と流体チップの処理によって設計されに出席する必要がありますいくつかの重要なパラメーターがあります: (i) 正確に制御、PDMS の厚さの膜はグラデーションのひずみ値を調整することが重要です。膜が厚すぎる場合、セル プレポリマーの最大注入量もは PDMS 膜架橋結合セルを含んだヒドロゲルのグラデーションの高さの適切な凸の曲線を生成することができません。対照的に、薄すぎる PDMS 膜は、ヒドロゲルに十分な力を適用できません。PDMS カバー金型で加硫 PDMS の重量はチップあたり約 1.6 2.0 g であることを確認してください。(ii) 汚染の防止は、流体チップで細胞を含んだゲルの架橋処理中に非常に重要です。インキュベーターで培養、徹底的に流体管内...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロジェクトで、大学院学生研究留学プログラム (NSC-101-2917-I-007-010); をサポートされていた生体医用工学プログラム (NSC-101-2221-E-007-032-MY3);国立ナノテクノロジー プログラム (NSC-101-2120-M-007-001-) は、中華民国、台湾の国立科学評議会。著者は、ハイドロゲルとセル封止技術を共有するため教授アリ Khademhosseini、Unal-Gulden Camci、タントラ文献に見ポールとハーバード大学医学部で Ronglih 遼を感謝したいです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL 黒色微量遠心チューブArgos Technologies 03-391-161これは、アルミホイルで覆われた1.5mLチューブのニュートラルカラーと交換できます
10x DPBSSigma-Aldrich56064C
Alexa Fluor 488 phalloidin インビトロジェンA12379 
BSASigmaA1595
CalceinMolecular ProbeC1430生細胞
CCD。イメージングPixelfly qe
細胞膜透過液Sigma-AldrichX1000.5% Triton X-100 浸透細胞膜
DAPISigma-AldrichD8417細胞核染色
透析膜Sigma-AldrichD9527分子量カットオフ = 14,000
DMEMGibco11995-065
両面テープ3M8003
FBSHycloneSH30071.03
ゼラチンSigma-AldrichG2500ゲル強度 300、タイプ A、豚の皮から
高周波電子コロナ発生器電気技術製品モデル BD-20
メタクリル無水物Sigma-Aldrich276685
マイクロシリンジハミルトン8050150 μL 
顕微鏡リンパスIX712つのフィルターセットが含まれています:LF405/LP-B-000とLF488/LP-C-000 Semrock
酸素プラズママシンから ハリックプラズマPDC-001
パラホルムアルデヒドSigma-AldrichP6148細胞固定用
PDMSウコーニングシルガード184PDMSチップキャスト成形製造用
混合物 ペン-連鎖球菌Gibco10378-016ペニシリン/ストレプトマイシン
光開始剤CIBAイルガキュア2959
ウ化プロピジウムシグマアルドリッチP4170死細胞の標識用
滅菌ろ過カップミリポアSCGPT05RE
TMSPMAシグマアルドリッチ440159ドロゲル固定化
超音波装置デルタ用D150H150W、43kHz
UVライトダイハンWUV-L10
凍結乾燥機FIRSTEK150311025
NIH3T3(線維芽細胞)食品産業研究開発機構(FIRDI)08C0011
MOXI Z Mini 自動セルカウンターORFLOMXZ001
PCOの標識用用 オ ダヨヒ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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