このプロトコルは、Drosophila melanogasterの産卵嗜好を単一動物の解像度でテストするためのハイスループットアッセイを説明しています。 このアッセイは、シンプルな意思決定プロセスを制御する遺伝子と回路コンポーネントを特定するための、シンプルで効率的、かつスケーラブルなプラットフォームを提供します。
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方法論記事
個々の産卵環境を調べるために、ハイスループットアッセイ
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
最近、 ショウジョウバエの産卵選好は、単純な意思決定プロセスの神経基盤を研究するために、遺伝的に扱いやすいモデルとして登場しました。その卵を堆積するサイトを選択する際、女性のハエは、そのオプションの相対的な魅力をランク付けし、選択することが可能である」以上の2品を。」一つは、彼らが集団ベースとセットアップが面倒であるため、この単純な意思決定プロセスの基礎となる回路の基礎を検索するために体系的な遺伝子スクリーニングアプローチを取りたい場合は、ほとんどの産卵選好アッセイは実用的ではありません。単一の雌の産卵選好の勉強のスループットを向上させるために、我々は、最大30個々のハエの各缶を同時にアッセイ産卵選好だけでなく、それぞれの女性が高い産卵率が保証するプロトコルカスタムチャンバーを開発しました（自分の好みが容易に識別可能な、より説得力があるように）。我々のアプローチは、実行するのは簡単ですそして、非常に一貫性のある結果を生成します。さらに、これらのチャンバは、ビデオは、産卵動物を記録し、光遺伝学研究のための光を提供することを可能にするために、異なるアタッチメントを装備することができます。この記事では、これらのチャンバでアッセイするハエを製造するためのこれらのチャンバと手続きを製造するための青写真を提供します。
概要
Drosophila melanogasterは、行動の神経基盤を研究するための強力な遺伝モデル生物です。 ニューロンを的を絞った方法で操作する遺伝ツールの急速な発展と、洗練された行動分析ツールの出現により、いくつかの先天的および学習的な行動の感覚運動変換プロセスの根底にある回路メカニズムを解剖する能力が大幅に向上しました1-3。
ショウジョウバエの産卵は、単純な意思決定プロセスの神経基盤を研究するのに適したモデルです。 特に、ショウジョウバエの女性は、特定のオプション4-8に卵を預けることに「コミット」する前に、オプションを比較してランク付けする能力を持っていることが示されています。 例えば、プレーンな(ショ糖を含まない)基質のみ、またはショ糖含有基質のみを与えられた場合、雌はどちらの産卵オプションも容易に受け入れます。 しかし、両方の選択肢が提示された場合、女性はいくつかの状況でショ糖基質を頑固に拒絶します7,9,10。 しかし、女性が「2つの商品のうち大きい方を選ぶ」ことを可能にする神経メカニズムについては、比較的ほとんど知られていません。 主な障害は、この問題を研究するために体系的な遺伝的スクリーニングアプローチを使用できるような、産卵の好みをアッセイする効率的な方法の欠如でした。
このレポートでは、雌の産卵嗜好を単一動物の分解能でアッセイし、以前の方法よりもスループットと一貫性が大幅に向上した私たちが開発したプロトコルについて説明します。 具体的には、私たちが設計したチャンバーを構築するための設計図、雌が多くの卵を産むための準備のためのプロトコル、チャンバーを使用するためのプロトコルを提供します。
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プロトコル
アッセイする1.準備ハエ
- 培養は25℃、湿度65％に設定したインキュベーターで、標準的な糖蜜/コーンミールメディアに飛びます。バイアルを混雑さないように注意してください。例えば、狭い食品バイアルに8人の女性と6人の男性を置きます。
注：ここで使用される「狭い食物バイアルは「2.3センチ内径を有します。我々は、典型的には、各バイアルに、フライ食品の約10mlを分注しました。我々が使用したフライ食品のレシピはここで説明されている：http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html。 - 2 - 図1Eに示すように、3日間の雌の羽化後、新鮮な酵母ペーストでバイアルを準備します。 0.5％プロピオン酸10mlでアクティブな酵母の6グラムを混合することにより、新鮮な酵母ペーストを作ります。食品バイアルの側壁に酵母ペーストを適用するためにへらを使用します。バイアルに25人の男性 - 20と一緒に35 eclosedメス - 30を収集します。
- 一般的に、女性が収集されているのと同じバイアルから男性を集めます（時間と労力を節約するように）。男性の生殖能力が懸念される場合は、代わりにWTの男性を使用しています。また、酵母ペーストは、したがって、毎日新鮮な準備をし、卵の産生を刺激するために重要です。
- ハエは温度に敏感でない限り、25℃、湿度65％で集め、女性/男性を維持します。
- 〜4の後 - 5日、雌は産卵実験の準備ができているかどうかを確認するために、バイアルをご確認ください。食品媒体の表面を積極的に食品中に掘り進む幼虫から濡れているとき、彼らは準備ができている（ - F図1E参照）。
注意：食品の表面が濡れて幼虫をクロールなると女性は、通常、産卵はご遠慮いただいております。このステップでは、女性は、それらが所望のテクスチャを有する基板が発生したときに多くの卵を産む準備ができているだろうことを保証する（ 例えば 、〜1％アガロース）。
2.商工会議所の建設、アセンブリ、アッセイのセットアップ
- （マシンショップではアクリル産卵室を構築Fiを提供していますグレの1A - D）。異なる部分の設計図を補足図1に示された- 。3高解像度の写真もここで見つけることができます（http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf）。
- 図1Cに示すように、チャンバのロード（上）片にプラスチックシートを挿入します。負荷が個々の産卵アリーナに飛ぶながらこれは底面として機能します。
- CO 2パッドの上にメスを麻酔し、各産卵場にそれらを個別にロードします。ハエはCO 2から回復すると、新しい環境に順応になることのために〜30分を許可します。
- アガロース基板を準備します。
- 便宜のために、55℃の水浴中で融解し、1％アガロースの既成のボトルを保持します。
- 50mlコニカルチューブにストックスクロース溶液（2 M）の所望の量を追加し、アガロースの適切な量と混合します。例えば、150mMのスクロース基板、PLAを調製しますチューブにCE 2 Mショ糖溶液の750μLをした後、10ミリリットルマークにアガロースでチューブを埋めます。
- 同じ方法で、プレーン基板を準備する代わりにショ糖溶液に蒸留水を追加します。
注意：このプロトコルにおけるアガロースの最終濃度が1％よりわずかに小さいです。 1.1％と2の基板が同じアガロース濃度であること - 〜0.9の範囲内になるように制御されるように我々の経験では、アガロースの正確な濃度は、限り問題ではありません。
- 図1Dに見られるように、各トラフに基板（下）チャンバーのピースとピペットアガロース基板を1000μLを取ります。
- アガロース〜30分間固化することができます。
- アガロース基質とハエの準備が整ったら、産卵室のすべての3つのピースを組み立て、その後、プラスチックシートを取り出します。
- フライインキュベーターにチャンバーを配置します。
注：産卵実験の長さは、EXPEに応じて変えることができますrimentalニーズ。 （ - 16時間14）私たちは、一般的に実験O / Nを実行します。また、産卵選好上の概日タイミングの有意な影響は認められませんでした。 - チャンバー内にCO 2を注入することによって、女性を麻酔。チャンバーを分解し、フライ遺体安置所（ すなわち 、いくつかのコーン油で満たされた空のコーヒー缶）に麻酔をかけたハエを破棄します。記録管理のための結果の写真を撮る（ 図2を参照）。
- 手動で卵の数を数え、分析のための選好指数を算出します。優先度を算出する（N - N B）/（N + N b）はN aとN bはそれぞれ、サイトに対サイトBの卵の数を表します。
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結果
基板（下）ピース、分周器（中央）ピースロード（上）作品、および2スライドドア（ - D図1A）：産卵室はいくつかの部分で構成されています。これらの作品は、産卵の実験の前に独立して設定ハエや基板に使用されている。 図1Fは、女性のハエが産卵のために準備ができているときバイアルがどのように見えるかを示しています。ハエがプレーン基板およびスクロース含有基材との間の選択を与えられているときは、図2に示すように、雌は堅牢に産卵のために、プレーン基板好ましいです。
図1.産卵チェンと産卵プロトコル。チャンバーを-laying（A）完全に組み立てられた卵。
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ディスカッション
ここで説明するチャンバーとプロトコルは、以前の産卵アッセイにいくつかの改良を持っています。まず、彼らは大幅に単一の動物の嗜好をアッセイのスループットを向上させます。各チャンバは、30単一の雌をアッセイすることができる、それがセットアップに時間未満かかります。第二に、彼らは以前の方法に比べて産卵選好の一貫性を高めます。アリーナの寸法の標準化は、基板間の産卵基質の大きさ、および距離は、それが簡単に異なる実験日の間、別の研究グループからの結果を比較することができます。第三に、室は1つが（ 補足 図4）を追求したい追加的な分析に対応するために、添付ファイルを取り付けることができます。例えば、行動分析のために、ビデオカメラは、ハエ7,11-13を記録するために、チャンバの頂部に取り付けることができます。最も重要なのは、このアプローチはスケーラブルです。これらのチャンバは、比較的INEXあります機械工場の助けを借りて製造するのに物思いにふけます。また、それは、典型的には、5室（150シングルメス）産卵アッセイの価値を設定するために、当業者に未満2時間かかります...
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
私たちは、デューク物理学ショップ、特にPhil Lewisに感謝します。これは、私たちが動作装置とアタッチメントを構築し、図面を作成するのを助けてくれました。 この研究は、国立衛生研究所(NIH)が賞番号R01GM100027で資金提供しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ウルトラピュアアガロース | Invitrogen | 16500-500 | |
| ショ糖 | Sigma | S0389 | |
| ウォーターバス | フィッシャー | 15-462-6Q | |
| LifeCam シネマ ウェブカメラ | マイクロソフト | H5D-00013 | |
| 赤色 LEDs | クリー | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| 産卵室 | カスタムビルド | ||
| カメラ ホルダー | カスタム ビルド | ||
| LED ホルダー | カスタムビルド | ||
| フライ バイアル (ナロー) | ジェネ | シー32-116BC |
参考文献
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436(2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910(2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335(2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432(2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
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