内因性の免疫蛍光分析および外因性セントロメア、動原体タンパク質

サマリー

ここでは、ヒト細胞内の内因性および外因性のセントロメア-動糖体タンパク質を検出し、固定(パラホルムアルデヒド、アセトン、またはメタノール固定)の使用による間接免疫蛍光染色により、セントロメア-キネトコアでのこれらのタンパク質レベルを定量するプロトコールを報告します。

要約

「セントロメア」と「キネトコア」は、細胞分裂中に染色体が紡錘体と会合する部位を指します。細胞周期中のセントロメア-動原体タンパク質の直接可視化は、これらのタンパク質のメカニズムを調査するための基本的なツールであり続けています。蛍光顕微鏡の高度なイメージング法により、セントロメア-動原体成分の優れた分解能が得られ、セントロメアと動原体の特定の分子成分を直接観察できます。さらに、特異的抗体を用いた間接免疫蛍光染色(IIF)の方法も、これらの観察に不可欠です。しかし、IIFのプロトコルに関する多数の報告にもかかわらず、特定のセントロメア-キネトコールタンパク質の問題を詳細に議論したものはほとんどありませんでした。^1-4 ここでは、パラホルムアルデヒド固定とIIF染色を使用して、ヒト細胞内の内因性セントロメア-動原体タンパク質を染色するための最適化されたプロトコルを報告します。さらに、アセトンまたはメタノール固定を受けたヒト細胞内のFlagタグ付き外因性CENP-Aタンパク質を検出するためのプロトコルを報告しています。これらの方法は、内因性セントロメア-動原体タンパク質およびFlagタグ付きCENP-Aタンパク質(ヒト細胞を含む)の検出および定量に有用です。

概要

「セントロメア」は、古典的遺伝学の抑制減数分裂期組換えの領域として定義され、それ以降の有糸分裂の間に正確な染色体の分離において重要な役割を果たしている有糸分裂染色体の一次狭窄、として認識されました。 「動原体」は、電子顕微鏡によって明らかにされるように、動原体の表面に微小管に結合した多層構造として説明しました。 「動原体」は、後に、有糸分裂の染色体のセントロメアに局在高分子複合体として定義されていました。脊椎動物の中で動原体DNA配列の劇的な相違にもかかわらず、動原体の構造および組成は、高度に保存されています。スピンドル微小管と動原体の間の動的相互作用は、忠実な有糸分裂時の染色体の分離、および異数性およびそれによって癌にセン​​トロメア動原体機能のリードの欠陥のために必要とされます。

ほとんどの真核生物におけるセントロメア何も定義されたDNA配列を持っていませんが、171-bpのαサテライトDNAからなる反復アルフォイドDNAの大規模な配列（0.3-5 MB）で構成されています。出芽酵母を除いて、セントロメアのアイデンティティはないDNA配列ではなく、ヒストンH3バリアントCenH3（ヒトにおけるセントロメアプロテインA [CENP-A]）を含む特別なヌクレオソームの存在によって達成される^。5 CENP-Aヌクレオソームがに局在します171-bpのαサテライトDNAに対する哺乳動物動原体⁷と結合するのインナープレート。アクティブ動原体は、一緒に紡錘体チェックポイントを介して紡錘体とそれに続く周期の進行に染色体の付着を調節する構成的セントロメア関連するネットワーク（CCAN）の動員および動原体タンパク質を、指示するためにCENP-Aを含むヌクレオソームが必要です。

上記の証拠に照らして、CENP-Aはセントロメア⁸のエピジェネティックなマークであることが提案されています。しかしながら、CENP-Aが組み込まれたプロセスは、私NtoのセントロメアDNAと、この取り込みを担当する要因はまだ十分に特徴付けられていません。ショートセントロメア標的化ドメイン（CATD）は、CENP-Aの領域に折り畳むヒストンに常駐し、CATDとH3の対応する領域の交換が動原体への直接H3に十分なものである^。9いくつかの研究は、翻訳後のための機能的役割を示唆しました^CENP-12-16の変更（PTM）。しかし、動原体への動員においてCENP-AのこれらのPTMの分子メカニズムはまだ解明されていません。我々は以前CUL4A-RBX1-COPS8 E3リガーゼ活性が動原体にCENP-AのCENP-A K124のユビキチン化およびローカライズのために必要とされていることを報告した^。17

動原体タンパク質の発見および特徴付けは、染色体分離に関する新たな知見をもたらしている^。18 100以上の動原体の構成要素は様々なアプローチによって、脊椎動物細胞で同定されている^。19,20の下で動原体が集合し、機能はまた、細胞内の各セントロメア-動原体タンパク質の細胞機能の特性評価およびタンパク質間ネットワークから来ている^。19直接可視化し、蛍光顕微鏡での高度な画像処理方法が動原体動原体の構成要素の著しい分解能を提供し、許可する方法のスタンディングセントロメアと動原体の特定の分子成分の直接観察。また、特異的な抗体を用いた間接蛍光抗体法（IIF）染色は、これらの観​​測に不可欠です。しかし、IIFプロトコルに関する多くの報告にもかかわらず、特定のセントロメア-動原体タンパク質の詳細な問題に議論少数^。1-4はこのように、開発と特異的に各セントロメア動原体タンパク質を分析するIIF染色および定量IIFアッセイの方法を報告することは非常に重要です。 IIF染色では、一つの目的のタンパク質の損失を回避するために、染色プロトコルを進めるべきですかセルの残りの部分。しかし、固定は時折抗原部位を破壊し、異なる抗体-抗原の組み合わせは、他と非常によく1固定液で十分に機能しない、しかし^、21および固定剤の選択は、目的のタンパク質（複数可）に大きく依存します。したがって、異なる固定液法が動原体動原体タンパク質のIIF染色で重要です。

間接免疫蛍光（IIF）染色およびCENP-AおよびFLAGタグ外因性のCENP-A蛋白質、およびヒト細胞におけるこれらのタンパク質の定量を含む内因性のセントロメア-動原体タンパク質の局在化に対処するためのアッセイのここで最適化された方法が開発されています。これらの方法は、他の種におけるセントロメア、動原体タンパク質の分析に適用することができます。

プロトコル

1.細胞培養およびトランスフェクション

1. 6ウェルのポリスチレンプレートにカバーガラス（22ミリメートル×22 mm）を入れてください。以下の手順でカバーガラス上の有糸分裂細胞を維持するための水に任意でコートポリ-L-リジンとカバーガラス、w / vの0.1％、（マテリアル/機器のリストを参照してください）​​：
   注：最適な条件は、各細胞株および適用のために決定されなければなりません。
   1. ポリ-L-リジンで無菌的にコート培養表面は、0.1％のV、水中で（0.6ミリリットル/ウェルを6ウェルポリスチレンプレート）/ wです。培養表面の均一なコーティングを確実にするために、穏やかに揺らし。
   2. 5分後、吸引により液を除去し、完全に無菌の組織培養グレードの水で表面をすすぎます。
   3. 細胞および培地を導入する前に少なくとも2時間を乾燥させます。
2. 6ウェルのポリスチレンプレートに入れ、シードHeLa細胞¹⁷またはHeLa細胞のTet-オフカバーガラス上の細胞^17,22（X 22ミリメートル22ミリメートル）。その細胞密度はウェル当たり5.4×10 ⁵であることを確認してください。培養細胞10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを有する高グルコースDMEMです。
   注：最適な結果を得るためには、経験的に播種に使用するための細胞密度を決定します。
3. 18時間、5％CO ₂の雰囲気中、37℃で細胞をインキュベートします。
   テトラサイクリン/ドキシサイクリンなしのHeLa Tetをオフ細胞の場合には、外来遺伝子の転写が誘導物質（ すなわち 、テトラサイクリン/ドキシサイクリン）の非存在下で活性である、したがって培養細胞とpTRM4過剰発現ベクターで一過性にトランスフェクト（ 表2：注意）、その転写がTREプロモーターによって調節される（下記参照）。
4. 以下のように、トランスフェクト細胞を播種後18時間：
   1. （20μMアニール株式を、 表1）1.5μlのsiRNAオリゴを混合して溶液Aを作成し、および/ ​​または2.0μgのプラスミド（ 表2）50μlの低血清培地中で（材料/機器のリストを参照してください）、そして室温で5分間インキュベート。
      注：この分析では、CA-UTRのsiRNA（5の混合物'および3' UTRのsiRNA; 表1）は、プロトコル3および4で使用するために同時トランスフェクトした（説明を参照）。
   2. 私は血清培地を減少50μl中（マテリアル/機器のリストを参照してください）​​、そして室温で5分間インキュベート0.75μlのトランスフェクション試薬を混合して溶液Bを作成します。
      注：オプションのステップは、（材料/機器のリストを参照してください）​​1.0μlのトランスフェクション試薬IIを添加することです。
   3. 一緒に溶液A及びBを混合し、室温で15分間インキュベートします。
   4. PBSで一度培養した細胞を洗浄し、その後、6ウェルのポリスチレンプレートの各ウェルに500μlの減少血清培地を追加します。個々のウェルのそれぞれに溶液AおよびB（ すなわち 、RNAおよび/ ​​またはDNA -脂質複合体）を直接の混合物を追加します。
      注：最終濃度は3.3μgの/ mlの（プラスミド）です。 50 nMの（のsiRNA）。
   5. 4.5時間、5％CO ₂の雰囲気中、37℃で細胞をインキュベートします。高グルコースDMEMのウィットに培地を変更H、10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシン。
   6. トランスフェクション後48〜72時間、5％CO ₂の雰囲気中、37℃で細胞をインキュベートします。
      注：最適な結果を得るために、固定前に細胞成長のためのインキュベーション期間は、経験的に決定されなければならず、タンパク質の枯渇および/または発現は、ウェスタンブロット分析によって確認されなければならない（プロトコル6を参照）。
   7. 有糸分裂細胞分析に関心がある場合は、24時間固定する前に、培養細胞にパクリタキセル（10 nM）を追加し、または固定する前に、培養細胞を2.5時間にTN16（0.5μM）を追加します。

内因性セントロメア-動原体タンパク質を検出する2.細胞の固定と免疫染色（パラホルムアルデヒド固定）

1. 固定剤、緩衝液、および試薬の調製。
   1. 新たにPBS、pH7.4中の4％パラホルムアルデヒド溶液50mlを調製します。
      1. 換気フード内で撹拌プレート上ガラスビーカーに1×PBSの40ミリリットルを追加します。ヒートながらstirrin約60°Cにグラム。加熱されたPBSにパラホルムアルデヒド粉末2gを追加します。
      2. 粉末はすぐに溶解しないので、合計で1 NのNaOHを1ml添加​​することにより徐々にpHを上昇させます。
         注：解決策は、NaOHを添加した後にクリアされます。
      3. パラホルムアルデヒドは、クールで溶解し、溶液を濾過したら。
      4. pHが7.4から1 N HClでpH及び50ミリリットルの1×PBSでの溶液の量を調整します。
         注：液のアリコートを凍結させるか、または限り1として週2〜8℃で保存することができます。それが使用されるまで溶液を氷冷または4℃で保存すべきです。
   2. 10mMトリス - 塩酸、pHを7.5から成るバッファKB1、50mlのを準備します。 150mMのNaCl; 0.5％BSA。 0.5％トリトンX-100。
      注：BSAを新たに追加する必要があります。
      注：バッファKBシリーズは、以前の報告に記載されバッファKBに基づいています^1,2,4。
   3. 、10 mMトリス - 塩酸から成るバッファKB2、50mlのを準備pHが7.5; 150mMのNaCl;及び0.5％BSA。
      注：BSAを新たに追加する必要があります。
   4. DAPI（50 ngの/ ml）を含むバッファKB3の1ミリリットルを準備します。
   5. 1mg / mlのp-フェニレンジアミンで構成さ封入剤の100ミリリットルを用意。 10％PBS、90％グリセロール。
      1. 、1 N NaOHで9.8から1×PBSのpHを調整して溶液中でパラフェニレンジアミンを溶解させ、その後、グリセロールを追加します。
      2. -80℃で保存1mlアリコートを。光から保護します。
2. 細胞固定用の48〜72時間後、トランスフェクション（プロトコル1を参照）で吸引により培地を除去します。 PBSで細胞を1回すすいでください。細胞の表面を乱すことを避けるために培養ウェルの側にPBSを適用します。
   注：細胞固定のための最適な時点は経験的に決定されなければなりません。
3. 4℃で30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定してください。十分に残留し、4％パラホルムアルデヒドを除去するために、バッファKB2で細胞を2回洗浄します。
4. PermeabiRTで30分間緩衝KB1でサンプルを平安大町。バッファKB2で細胞を1回すすぎ、そして非特異的結合の追加のブロックサイトにRTで5分間のバッファKB2を追加します。
   注：Buffer KB1も阻止に大きく貢献しています。
5. ピンセットを用いて、6ウェルのポリスチレンプレートからカバーガラス（22ミリメートル×22 mm）を削除します。疎水性バリアペンを使用して、各カバーガラス試料周辺の疎水性バリアを形成するために、淡い緑色の正方形または円を描く、（マテリアル/機器のリストを参照してください）​​。触れたり、疎水性バリアペンで細胞に近づきすぎないようにしてください。新しい6ウェルポリスチレンプレートにカバーガラスを置きます。
6. 一次セントロメアする抗体または動原体タンパク質を希釈（1の希釈率：1から100：200;また、マテリアル/機器のリストを参照）、抗CENP-B抗体（1の希釈率：400）のいずれかまたは抗セントロメア抗体（ACA）（1の希釈率：2000）は、バッファKB2におけるセントロメアの位置マーカーとして。
   注：最適な結果を得るために、最終的なconcentraこの溶液中の一次抗体の化は、経験的に決定されなければなりません。
7. 細胞試料を浸漬する希釈した一次抗体のに十分な量（ 約 30μl）を適用します。 37℃で1時間細胞サンプルをインキュベートします。バッファKB2で細胞を3回洗浄します。
8. 各一次抗体に対する指定バッファーのKB2をUsing、フルオロフォア結合二次抗体（200：100 1から1の希釈率）を希釈します。
   注：最適な結果を得るために、この溶液中の二次抗体の最終濃度は、経験的に決定されなければなりません。
9. 細胞試料を浸漬する希釈した二次抗体のに十分な量（カバーガラス上で約 30μlと低下）を適用します。 37℃で1時間細胞サンプルをインキュベートします。 30分（5、6分の洗浄）の期間中にバッファKB2で細胞を5回洗浄します。
   注：最適な結果を得るために（ すなわち 、細胞の損失を最小限にするために）、最適な洗浄条件は、empiricaを決定しなければなりませんLLY。
10. 細胞試料を浸漬するDAPI（50 ngの/ ml）を含むバッファKB3の十分な量を適用します。室温で5分間、細胞試料をインキュベートします。バッファKB2で細胞を1-2回すすいでください。
11. マイクロスライド上に細胞試料が含まれているカバーガラスをマウントします。
    1. マイクロスライドの中央に取り付け培地のドロップを置きます。
    2. 細胞試料から液体を除去し、手やピンセットを用いて、マイクロスライドの中央にサンプルを置きます。気泡を避けてください。
    3. ペーパータオルで余分なマウンティング培地を除去します。

3.細胞固定およびC末端FlagタグCENP-A蛋白質（アセトン固定）の免疫染色

1. 準備
   1. 氷冷75％アセトンを準備します。
   2. 新たに0.5％スキムミルクおよび0.5％BSAを含むPBS（pH7.4）で50mlのを準備します。
   3. 新たに0.1％スキムミルクおよび0.1％BSAを含むPBS（pH7.4）で50mlのを準備します。
   4. （1mlのPBSを準備DAPI（50-100 ngの/ ml）を含むpH7.4の）。
   5. 2.1.5で説明したようにマウンティング培地の100ミリリットルを準備します。
2. 細胞固定用の48〜72時間後、トランスフェクション（プロトコル1を参照）で吸引により培地を除去します。 PBSで細胞を1回すすいでください。細胞の表面を乱すことを避けるために培養ウェルの側にPBSを適用します。
   注：細胞固定のための最適な時点は経験的に決定されなければなりません。
3. 氷冷75％アセトン中で細胞を固定し、-20℃で10分間細胞をインキュベートします。 RTで30〜60分間ヒュームフードでカバーガラス上の乾電池。
   注：最適な結果を得るために、固定および細胞乾燥に必要な時間の長さは、経験的に決定されなければなりません。
4. 疎水性バリアペンを使用して、各カバーガラス試料周辺の疎水性バリアを形成するために、淡い緑色の正方形または円を描く、（マテリアル/機器のリストを参照してください）​​。触れたり、疎水性バリアペンで細胞に近づきすぎないようにしてください。
5. ブロックnonspecIFIC 0.5％スキムミルク、室温で5分間、0.5％BSAを含むPBSを添加することによって、細胞上の結合部位。
6. （1,000希釈率1）および抗CENP-B抗体（1の希釈率：200）のいずれか、またはACA（1：2,000希釈率PBS 0.1％スキムミルクおよび0.1％BSAを含有する使用、抗Flag抗体を希釈）セントロメア位置マーカーとして。
   注：最適な結果を得るために、この溶液中の一次抗体の最終濃度は、経験的に決定されなければなりません。
7. 細胞試料を浸漬する希釈した一次抗体のに十分な量（ 約 30μl）を適用します。 37℃で1時間細胞サンプルをインキュベートします。 30分の期間中にブロッキングバッファーで細胞を5回洗浄します。
   注：細胞をPBSでリンスすることができます。最適な結果（ すなわち 、細胞の損失を避けるために）のために、最適な洗浄条件は、経験的に決定されなければなりません。
8. 向けフルオロフォア結合二次抗体（200：100 1：1の希釈比）希薄0.1％スキムミルクおよび0.1％BSAを含有するPBS中の各一次抗体。
   注：最適な結果を得るために、この溶液中の二次抗体の最終濃度は、経験的に決定されなければなりません。
9. 細胞試料を浸漬する希釈した二次抗体のに十分な量（ 約 30μl）を適用します。 37℃で1時間細胞サンプルをインキュベートします。 PBS、0.1％スキムミルクおよび0.1％BSAを含有する細胞を2回リンス。
   注：PBS単独はまた、細胞を洗浄するために使用することができます。
10. 細胞試料を浸漬するDAPI（50-100 ngの/ ml）を含むPBSの十分な量を適用します。室温で5分間、細胞試料をインキュベートします。 PBSで細胞を1-2回すすいでください。
11. 2.11に記載されているように、マイクロスライド上に細胞試料を含むカバーガラスをマウントします。

4.細胞の固定およびN末端FlagタグCENP-A蛋白質の免疫染色（メタノール固定）

1. 準備
   1. 氷冷メタノールを準備します。
   2. 4％ヤギ血清を含むTBS（pH7.4）に準備します。
   3. TBS DAPI（50-100 ngの/ ml）を含む液（pH7.4）の1ミリリットルを準備します。
   4. 2.1.5で説明したようにマウンティング培地の100ミリリットルを準備します。
2. 細胞固定用の48〜72時間後、トランスフェクション（プロトコル1を参照）で吸引により培地を除去します。 TBSで細胞を1回すすいでください。細胞の表面を乱すことを避けるために培養ウェルの側にTBSを適用します。
   注：細胞固定のための最適な時点は経験的に決定されなければなりません。
3. 氷冷メタノールで細胞を固定し、-20℃で6分間、細胞をインキュベートします。十分に残留メタノールを除去するために、TBSで細胞を2回洗浄します。
4. （マテリアル/機器のリストを参照してください）​​疎水性バリアペンを使用して、各カバーガラス試料の周りに疎水性の障壁を作成するために、淡い緑色の正方形または円を描きます。触れたり、疎水性バリアペンで細胞に近づきすぎないようにしてください。
5. セル上の非特異的結合部位をブロック4％ヤギ血清を含むTBSを添加することにより、LS。室温で10分間インキュベートします。
6. （1,000倍希釈）、および抗CENP-B抗体（希釈比1：200）のいずれか：4％ヤギ血清を含むTBS中で動原体位置マーカーとして（2,000希釈率1）またはACA抗Flag抗体を希釈。
   注：最適な結果を得るために、この溶液中の一次抗体の最終濃度は、経験的に決定されなければなりません。
7. 細胞試料を浸漬する希釈した一次抗体のに十分な量（ 約 30μl）を適用します。 37℃で1時間細胞サンプルをインキュベートします。 30分の期間中にブロッキングバッファーで細胞を5回洗浄します。最適な結果（ すなわち 、細胞の最小限の損失）については、最適な洗浄条件は、経験的に決定されなければなりません。
8. 4％ヤギ血清を含むTBS中で、各一次抗体に対するフルオロフォア結合二次抗体（200：100 1：1の希釈比）を希釈します。
   注：最適な結果を得るために、FINAこの溶液中の二次抗体のリットル濃度は、経験的に決定されなければなりません。
9. 細胞試料を浸漬する希釈した二次抗体のに十分な量（ 約 30μl）を適用します。 37℃で1時間細胞サンプルをインキュベートします。ブロッキング緩衝液で細胞を3回洗浄します。
10. 細胞試料を浸漬するDAPI（50-100 ngの/ ml）を含むTBSの十分な量を適用します。室温で5分間、細胞試料をインキュベートします。 TBSで細胞を1-2回すすいでください。
11. 2.11に記載されているように、マイクロスライド上に細胞試料が含まれているカバーガラスをマウントします。

5.免疫蛍光像観察、取得、定量、および分析

1. 63Xおよび100X油浸レンズ、外部コンパクト光源、およびデジタルCCDカメラを搭載した電動式蛍光顕微鏡で細胞試料を観察します。
2. ソフトウェアを使用して、デコンボリューションを含む画像取得処理を行います、またはソフトB1とB2（マテリアル/機器のリストを参照してください）​​。ソフトB1とB2で使用されるすべてのコマンドについては、ソフトウェアAで使用されるすべてのコマンドのために補足コードファイル（5.2.1）を参照してください、補足Codeファイルに（5.2.2）を参照してください。
3. 以下の軽微な変更でセントロメア動原体タンパク質（セントロメアでのCENP-Aの例えば 、残りの信号）の信号を定量化するために前述の方法^{23-25 ​​を}使用^します^。
   1. 次のようにセントロメア-動原体タンパク質の領域を選択し、背景のこと：
      1. 有糸分裂細胞：DAPIで染色した染色体と重なる（セントロメア動原体領域）を選択エリア。 （背景領域）と面積染色体外が同一で、単一細胞（ すなわち 、細胞質ゾル領域）の内側。
      2. 間期細胞：DAPIで染色したクロマチンと重なる（セントロメア動原体領域）を選択エリア。 （クロマチンの外側が、同一の単一細胞内で（バックグラウンド領域）と面積のすなわち、細胞質ゾル領域）。
         注：それぞれ、ソフトウェアAまたはソフトウェアB2と領域選択のためにも補足コードファイル（5.2.1.4.3）または（5.2.2.6.4）を参照してください。
   2. このタスクのソフトウェアAまたはBを使用することにより、動原体に残りの信号の割合を定量化するには、次の式を使用します。
      セントロメア動原体でのセントロメア動原体タンパク質の残りの信号
      
      bはバックグラウンドシグナル輝度であり; sは ACAまたはCENP-B染色によって確認される選択された領域の信号の明るさである場合、R _{サンプルは、siRNA（S）}処理細胞に対する基準ACAまたはCENP-Bの信号です。 そしてR _CTRLはリュックsiRNAをトランスフェクトされた細胞のための基準ACAまたはCENP-Bの信号です。
      注：以前の報告に記載されているように、この分析では、CENP-B信号は、CUL4Aための基準信号として使用し、RBX1ました。
   3. コピーした後、この計算のためのExcelファイルを使用し、上記の信号の定量ソフトウェアからの生データを貼り付けます。詳細については、（5.2.1.4）及び（5.2.2.6）：補足コードファイルをも参照してください。計算の一例は、 表3に示されています。
4. 各測定レベルのための染色および画像取得の変動を排除するために、少なくとも20の細胞を分析します。各セルを分析するために必要に応じて異なるセントロメア動原体タンパク質の間でこれらの値を比較するために、セントロメア-動原体信号を残りの「平均値」を使用します。

総タンパクの6.ウェスタンブロット分析

1. 緩衝変性に細胞を再懸濁（20mMのトリス-HCl、pH7.4の、50mMのNaCl、0.5％ノニデットP-40; 0.5％デオキシコレート、0.5％SDS、1mMのEDTA、および完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル） ²⁶件名超音波処理および凍結融解プロセス、および測定するためにサスペンションタンパク質濃度を次のように
   1. 超音波処理プロセスでは、48〜72時間後、トランスフェクションの6ウェルのポリスチレンプレートの2つのウェルから回収した細胞に緩衝液Aの50μlを添加する（プロトコル1を参照）。ディスラプターホーンとマイクロチップを搭載した超音波処理装置を操作して1サンプルあたり合計15秒間欠パルス持続時間（デューティサイクル50％）のために（材料/機器のリストを参照してください）​​。
   2. 凍結融解プロセスのために、液体窒素で細胞を凍結し、RTで細胞を解凍します。
   3. （マテリアル/機器のリストを参照してください）​​市販のタンパク質アッセイ試薬IまたはIIを使用してタンパク質濃度を測定します。
      注：溶解液は、試薬IまたはIIのいずれかでタンパク質濃度の測定で1:10の割合で希釈します。この希釈で、緩衝液A中にSDSが存在するが、この測定ではほとんどまたは全く干渉を示しています。
2. 2×または4×SDS-PAGEローディングバッファーで総タンパク質の20〜30μgのを含む溶解液を混ぜる^。27ボイルのサンプルについて5分間、その後電気泳動用SDSポリアクリルアミドゲルを変性12.0パーセント-15.0％でそれらをロードします。
3. 先に述べたウエスタンブロッティング法を用いてPVDF膜にSDS-PAGEによって分離されたタンパク質を転送します^{。17,24,27-31}
   1. 1×PBS中の5％無脂肪乳で膜上の非特異的結合部位をブロックし、その後、室温で1時間希釈した一次抗体の溶液で膜をインキュベートします。各一次抗体の詳細な情報（ 例えば、希釈率）のための材料/機器の一覧を参照してください。
   2. PBS-T緩衝液（1×PBS、0.1％のTween-20）で（振盪しながら各3〜5分間のインキュベーション）膜を3〜4回​​洗浄した後、近赤外（IR）の混合物中で膜をインキュベート蛍光色素結合二次抗体（1の希釈率：20,000）、DyLightコンジュゲート二次抗体（1の希釈率：20,000）、及び/又はホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）をPBS-Tで希釈した二次抗体（抱合; dilutiを1の比率で：10,000）を室温で1時間。各二次抗体の詳細な情報（ 例えば、希釈率）のための材料/機器の一覧を参照してください。
4. 膜を3回洗浄してから、赤外線イメージングシステムおよび/または免疫ブロット検出のための化学発光イメージャを有するタンパク質を分析するために、膜をスキャン（材料/機器のリストを参照してください）​​。
   1. 赤外線イメージングシステムを使用するため、補足Codeファイルに（6.4.1）を参照してください。
   2. 化学発光イメージャーを使用するため、補足Codeファイルに（6.4.2）を参照してください。超高感度強化化学発光（ECL）基板を使用して、このシステムの（マテリアル/機器のリストを参照してください）​​。

結果

内因性のCENP-Aの免疫蛍光分析は、CUL4A-E3リガーゼは、セントロメアにCENP-Aの局在に必要とされるという仮説を支持します
我々の最近の研究では、CUL4A-RBX1-COPS8 E3リガーゼ活性がCENP-Aおよび動原体へのCENP-Aの局在化に対するリジン124（K124）のユビキチン化のために必要とされることを示した^。17最初に、相間-動原体複合体（ICENが）によって単離しました抗CENP-A：ネイティブクロマチン免疫沈降^{、32-34、ICEN}タンパク質のいくつかはセントロメアにCENP-Aをローカライズする役割を果たしていると仮定されています。したがって、siRNAノックダウン実験は、その不在発現の動原体¹⁷にCENP-Aの非局在化を誘導したタンパク質をスクリーニングするために実施した（データは示していない）：非同期的に成長したHeLa細胞を、回カリン4A（CUL4A）siRNAまたはRBX1のsiRNAをトランスフェクトしました。最適なタン...

ディスカッション

近年では多くの研究が固定された細胞のための異なる定量的な顕微鏡アッセイを開発した^。42セントロメア動原体の生物学の進歩は、多くの場合、細胞内の空間的・時間的規制はの変更機能を反映するのタンパク質のセントロメア特異的または動原体特異的な機能を理解する必要があります細胞周期の間に、これらのタンパク質。そこで、ここではIIF染色、具体的に異なって処理されたサンプルで適用することができる内因性および外因性のCENP-A蛋白質の相対レベルを、分析するための定量的IIFアッセイの方法を開発しました。現在、我々はこの研究でプロトコル2を使用して、内因性CENP-I、CENP-H、KNL1、Hec1、およびSka1の成功IIF染色を達成した（新倉ら ²⁴と示されていないデータを参照してください;抗体の情報のための材料/機器のリスト） 。将来的には、1は、（異なるセントロメア動原体タンパク質のレベルを定量化するために、両方のendogを同じ方法を適用することができます特異的な抗体を選択）enousおよびFLAGタグ外因性タンパク質は、しかし、私たちのIIFの方法は、生細胞内または細胞全体のサイ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Lipofectamin 2000	Life Technologies/Invitrogen	11668	トランスフェクション試薬 I
リポフェクタミン RNAiMAX	Life Technologies/Invitrogen	13778	トランスフェクション試薬 II
Opti-MEM I	Life Technologies/Invitrogen	31985	還元血清培地、温度 37°C;Cウォーターバス使用前の
高グルコースDMEM(Dulbecco'修正されたイーグル」s medium)	Life Technologies/BioWhittaker	12-604	高グルコースDMEM、37°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前
シ胎児血清、認定、熱不活性化、米国原産	Life Technologies/Gibco	10082	FBS(ウシ胎児血清)
ポリ-L-リジン 溶液	SIGMA-SLDRICH	P 8920	ポリ-L-リジン、0.1% w/v、水中
UltraPure 蒸留水	Life Technologies/Invitrogen/Gibco	10977	滅菌組織培養グレード水
マイクロカバーガラス(22mm×22mm)	Surgipath	105	カバーガラス (22 mm x 22 mm)
6ウェル細胞培養クラスター	Fisher/Corning Incorporated	07-200-83	6ウェルポリスチレンプレート
ペニシリン、ストレプトマイシン;リキ	ッドフィッシャー/ギブコ	15-140	ペニシリン-ストレプトマイシン
PAP PEN	結合部位	AD100.1	疎水性バリアペン(免疫蛍光染色用撥水バリア用)
パクリタキセル(タキソール)	SIGMA-SLDRICH	T7402	有糸分裂細胞解析用タキソール
TN-16、微小管阻害剤(TN16)	Enzo Life Sciences	BML-T120	TN16 有糸分裂細胞解析用
BSA(ウシ血清アルブミン)	SIGMA-SLDRICH	A7906	ブロッキング試薬
Triton X-100	SIGMA-SLDRICH	T8787	透過性パラ
ホルムアルデヒド	SIGMA-SLDRICH	P6148	固定用
試薬 DAPI	SIGMA-SLDRICH	D9542	核染色用
p-フェニレンジアミン	SIGMA-SLDRICH	P6001	封入用液
VWR マイクロスライド つや消し	VWR International	48312-013	マイクロスライド
抗CENP-A抗体	Stressgen/Enzo Life Sciences	KAM-CC006	マウスモノクローナル抗体 希釈倍率 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
抗CENP-B抗体	Novus Biologicals	H00001059-B01P	マウスモノクローナル抗体 希釈倍率1:200 (IIF, メタノール/アセトン固定)-1:400 (IIF, パラホルムアルデヒド固定)
抗CENP-B抗体	abcam	ab25734	ウサギポリクローナル抗体; 希釈比 1:200 (IIF, メタノール/アセトン固定)-1:400 (IIF, パラホルムアルデヒド固定)
抗セントロメア抗体 (ACA)	Fitzgerald Industries International, Inc.	90C-CS1058	Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF)
Anti-CENP-H antibody	Bethyl Laboratories	BL1112 (A400-007A)	Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF)
Anti-CENP-H antibody	BD	612142	Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF)
Anti-CENP-I antibody	N/A, Dr. Katusmi Kitagawa	N/A, Dr. Katusmi Kitagawa	ウサギポリクローナル抗体;希釈比は1:1000(IIF)です。Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
抗KNL1抗体	Novus Biologicals	NBP1-89223	Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 antibody	Novus Biologicals / GeneTex	NB 100-338 / GTX70268	Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 antibody	GeneTex	GTX110735	Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)1:100 (IIF)
抗Ska1抗体	abcam	ab46826	ウサギポリクローナル抗体 希釈倍率 1:100 (IIF)
抗フラグ抗体	SIGMA-ALDRICH	F3165	マウスモノクローナル抗体 希釈倍率 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
抗フラグ抗体	SIGMA-ALDRICH	F7425	ウサギポリクローナル抗体 希釈倍率 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
抗CUL4A抗体	N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri	N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri	Rabbit polyclonal antibody;希釈比1:3000 (WB);Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)
Anti-RBX1 antibody	Cell Signaling	4397	Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB)
Anti-GAPDH antibody	Chemicon	MAB374	Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG Life	Technologies/Invitrogen	A11001	蛍光色素標識二次抗体 (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies	/Invitrogen	A11005	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies	/Invitrogen	A11008	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies	/Invitrogen	A11012	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
無脂肪粉乳 (カーネーション粉ミルクの代替品として承認	Fisher Scientific	NC9255871 (Reorder No. 190915;Lot# 90629)	脱脂乳
ライカ DM IRE2 電動蛍光顕微鏡	ライカ		電動蛍光顕微鏡
HCX PL APO 63x 油浸レンズ	ライ	カ LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS	63X 油浸レンズ
HCX PL APO 100x 油浸レンズ	ライカ	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE	100X 油浸レンズ
ライカ EL6000 コンパクト光源	ライカ		蛍光励起用外部コンパクト光源
ORCA-R2 デジタルCCDカメラ	浜松ホトニクス	C10600-10B	デジタルCCDカメラ
Openlabバージョン5.5.2科学イメージングソフトウェア	Perkin Elmer/Improvision		画像観察、取得、定量化、分析用
Velocity version 6.1.1 3D画像解析ソフトウェア	Perkin Elmer/Improvision		画像観察、取得、定量化、分析用
完全なEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ	11873580001/11836170001	プロテアーゼ阻害剤カクテル錠
PlusOne 2-D Quant Kit	Amersham Biosciences	80-6483-56	タンパク質濃度の測定用市販タンパク質アッセイ試薬I(2% SDSに対応)
バイオ・ラッド プロテインアッセイ	バイオ・ラッド	500-0006	市販のタンパク質濃度測定試薬 II (0.1% SDS 対応)
Immobilon-FL	EMD Millipore	IPFL00010	PVDF 膜
IRDye 800CW ヤギ抗マウス IgG	LI-COR Biosciences	926-32210	IR 蛍光色素標識二次抗体 (アフィニティー精製二次抗体); 希釈比1:20000 (IIF)
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32221	IR 蛍光色素標識二次抗体 (Affinity-purified secondary antibody); 希釈比 1:20000 (IIF)
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549	Fisher Scientific	PI35507	DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); 希釈比 1:20000(IIF)
ヤギ抗ウサギ DyLight 649	Fisher Scientific	PI35565	DyLight標識二次抗体IR 蛍光色素標識二次抗体 (Affinity-purified secondary antibody); 希釈比 1:20000 (IIF)
ヤギ抗マウス IgG-HRP	Santa Cruz	SC-2005	HRP 標識二次抗体DyLight標識二次抗体IR 蛍光色素標識二次抗体 (Affinity-purified secondary antibody抗体);希釈倍率 1:10000 (IIF)
ヤギ抗ウサギ IgG-HRP	Santa Cruz	SC-2004	HRP 標識二次抗体DyLight標識二次抗体IR 蛍光色素標識二次抗体 (Affinity-purified secondary antibody); 希釈倍率 1:10000 (IIF)
Openlab version 5.5.2.科学イメージングソフトウェア	Improvision/PerkinElmer		Software A
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)	PerkinElmer		Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)	PerkinElmer		Software B2
Branson SONIFIER 450			Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid,ねじ式9.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33995-325	超音波処理用ディスラプターホー
ソン超音波超音波発生器マイクロチップテーパー6.5 mm	VWRサイエンティフィックプロダクツ株式会社	33996-185	超音波処理用マイクロチップ
Odyssey CLx 赤外線イメージング システム	LI-COR Biosciences		イムノブロット検出用赤外線イメージングシステム
Image Studio 解析ソフトウェア Ver 4.0	LI-COR Biosciences		Software C
Molecular Imager Versadoc MP4000 システム	バイオ・ラッド		イムノブロット検出用化学発光イメージャー
Quantity One 1-D 解析ソフトウェア	バイオ・ラッド		ソフトウェア D
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo	34095	超高感度化学発光 (ECL) 基板