単離、特徴付けおよび歯肉免疫細胞ネットワークの機能検討

サマリー

我々は、分離、表現型の特徴およびマウス歯肉からの免疫細胞の機能解析のための手法を確立しました。

要約

組織内の免疫細胞ネットワークは、局所免疫を媒介し、組織の恒常性を維持する上で重要な役割を果たしていますが、口腔粘膜や歯肉に常在する免疫細胞集団についてはほとんど知られていません。私たちは、常に微生物にさらされている領域であり、一般的な炎症性疾患である歯周炎に対して脆弱な部位であるマウスの歯肉組織から免疫細胞を分離し、研究するための技術を確立しました。私たちのプロトコルは、定常状態であっても、歯肉に常在する免疫細胞集団の詳細な表現型の特徴付けを可能にします。また、私たちの手順では、ex vivoでのサイトカイン分泌の評価などの機能研究に使用するのに十分な生存率を持つ細胞が得られます。歯肉免疫細胞ネットワークの表現型と機能的特性のこの組み合わせは、経口免疫と歯周恒常性に関与するメカニズムの調査に役立つはずですが、局所免疫病理に関与するメカニズムの理解も前進します。

概要

歯肉組織は、ヒトおよびマウスの歯列を囲み、常に^歯 1の複雑なバイオフィルムにさらされています。歯肉障壁をポリシング免疫細胞ネットワークは、組織の完全性を維持するローカル共生微生物に恒常性を確保し、同時に、病原性のチャレンジ²に対して有効な免疫を提供するために不可欠です。恒常性を達成するために、免疫系を注意深くまだ少し詳細は歯肉の免疫細胞集団および組織免疫^2の維持における役割の知られている高度に特化した免疫細胞ネットワークを作成歯肉環境に合わせて調整されます。

免疫恒常性が歯肉に破壊される場合には、いずれかの増加ホスト感受性および/ ​​またはdysbiotic微生物群集、炎症状態の存在を通して、歯周炎は^、3〜4を発生します。歯周炎は、歯の喪失につながる、一般的な炎症性疾患でありますupporting構造。その重篤な形態では、一般集団⁵の約10％に見られます。歯周炎感受性および進行に関与する重要な要因を解剖すると⁶困難であることが判明しました。しかし、動物モデルは、歯周炎の開始および進行⁷のメカニズムを理解する上で極めて有用でした。モデルは、免疫ホメオスタシスおよび歯周炎の駆動開発を​​維持するために不可欠な重要な細胞集団および分子メディエーターを定義するために使用することができます。このような洞察は、免疫恒常性の歯肉固有の制御の我々の理解を変換し、疾患の病因の我々の現在の理解を促進します。

プロトコル

このプロトコルに記載されている全ての実験手順は、必要なガイドラインに従い、施設内動物管理使用委員会、NIDCR / NIHによって承認されました。

1.事前に準備

1. 完全培地を調製する：RPMIは2mM L-グルタミン、100単位/ mlのペニシリン、100μgの/ mlストレプトマイシン、10％FBSを補充しました。
2. 7.5μgのDNA分解酵素を添加したRPMI培地50ミリリットル（、新鮮なメイク常に氷上に保つ）：DNアーゼメディアを準備します。
3. DNアーゼメディアプラス3.2ミリグラム/コラゲナーゼIV型のミリリットルの5ミリリットル（、新鮮なメイク常に氷上に保つ）：コラゲナーゼ-DNアーゼメディアを準備します。
4. 前クールFACS緩衝液：PBSで希釈した0.5％FBS。
5. 4℃に予冷遠心分離機。
6. 37°Cまでのウォームシェーカーインキュベーター。

歯肉ブロックから2単離、解剖、および細胞単離

1. ARACガイドラインに従って、適切なチャンバ内の_{CO 2に}それらを暴露することによって、マウスを安楽死させます。
<李>は、心臓や内臓を露出するために胸部と腹腔を開きます。灌流するために、下大静脈内の切開を行い、27 G針で3ミリリットル注射器を用いて左心室を経てPBSの3ミリリットルを灌流。
2. 上を向いて胃とパッド上でマウスの体と頭を固定化します。
3. 下にある組織と筋肉を露出させ、下顎と首の領域を覆う皮膚を分離し、はさみで首に向かって唇の各交連をカット。下顎を発見するために下唇を解剖。
4. 下顎の両側を分離し、口腔にアクセスするためのそれぞれの側を固定する下側切歯間で切断。
5. 離れて鼻腔から口蓋を視覚化し、解剖。
6. 10ブレードを使用して領域を解剖し、周囲の歯肉（ 図1）で上顎と下顎臼歯の領域を含みます。縦切開はちょうど第一大臼歯と後部第三大臼歯にとの水平切開部に前方ください歯肉の境界線（組織周囲の歯のホワイトカラー）。
7. 5ミリリットルコラゲナーゼ/ DNアーゼ（氷上で保持）で50ミリリットルコニカルチューブに上顎と下顎のブロックを配置します。
8. 37℃で1時間振とうインキュベーター中でインキュベートし、インキュベーションの最後の5分間に0.5 M EDTA50μlのを追加します。
9. 組織と50ミリリットルチューブに冷たいアーゼメディアの5ミリリットルを加え、穏やかに混合することが渦巻きます。
10. シャーレ上の組織の4ブロックを転送し、DNアーゼメディア500μlのでカバー。手術用メスの刃を使用して、組織の各ブロックから歯肉を削除し、歯肉と歯間の領域に刃を向けます。
11. セルストレーナー（70μmの大きさ）を介して新しい50mlチューブに、ペトリ皿だけでなく、解剖時に使用される前のDNアーゼメディアから組織やメディアを転送します。使用される機器のすべてとフィルタDNアーゼメディア（3-5 ml）で洗浄します。
12. 無菌の3ミリリットルシリンジのプランジャーを使用して、ストレーナに対して組織をマッシュ、冷たいDNアーゼメディア（30〜35 ml）でフィルタリングします。
13. 冷たいDNアーゼメディアを持つセルストレーナーを洗浄します。
14. 4°C、6分間、314×gで遠心分離します。
15. 上清を捨て、完全培地1ml中に再懸濁します。
16. 自動細胞計数器を用いて、（予想量が> 80％の生存率で1.2×10 ^6細胞に8×10 ⁵の範囲とすべきである）細胞を数えます。

歯肉細胞の3刺激およびFACS染色

1. ブレフェルジンAの1μL/ mlの存在下でPMA（50ng / ml）およびイオノマイシン（2.5μgの/ ml）で単一細胞懸濁液を刺激
2. 37℃で3.5時間、5％CO ₂インキュベートします。
3. スピンダウンし、4℃でPBSと遠心機で洗います。 6分間314×gで。
4. 製造業者の説明書に従って生存能力染色を用いて細胞を染色します。
5. 細胞外マーカー（CD45、TCRγδ、TCRβ、CD4、CD8、TCRγδまたはアリ用ステイン製造者の指示に従って、選択したibodies）。
6. 4°C、5分間、314×gでの冷FACS緩衝液および遠心分離で細胞を洗浄。
7. 静かに細胞ペレットを破壊するためにボルテックス。
8. 室温で20分間、2％パラホルムアルデヒドで細胞を固定してください。
9. 冷たいFACS緩衝液、4°C、細胞内サイトカインのための5分および染色のための314×gで遠心分離で細胞を洗浄。
   1. 4°C、5分間、314×gでFACS緩衝液および遠心機で希釈し、冷0.5％サポニンの溶液でFACSチューブを埋めます。
   2. FACSチューブに0.5％サポニン溶液の300μl加え、4℃で暗所で15分間インキュベートし、その後、4℃、5分間、314×gで遠心します。
   3. 製造者の指示に従って、細胞内のマーカー（IL-17AおよびIFNγまたは選択のサイトカイン）のための細胞を染色。 4°C、5分間、314×gで0.5％サポニン溶液と遠心で細胞を洗浄。
   4. FACSで再び洗浄バッファと4℃、5分間、314×gで遠心。
   5. FACS緩衝液300μlの中で細胞を再懸濁します。
10. フローサイトメーター上の結果を分析します。

4.フローサイトメトリー分析

1. 細胞を可視化するデブリを排除するために、前方（FSC）および側方散乱（SCC）及びゲートに分析されます。
2. 高さ（FSC-H）パラメータ対前方散乱面積（FSC-A）を持つ単一のセルを選択します。
3. さらなる分析（ 図2A および 2C）は造血マーカーCD45の⁺ライブ（生存能力染色によって示されるように）正あるゲート細胞。
4. 図 2と図 3に示すように、特定のマーカーの解析を続けます。

結果

プロトコルの適用を説明するために、我々は（ ^{- / - 、} 図2A - C LFA対WT）とし、歯周炎のないマウスの歯肉における免疫細胞のネットワークを調べる代表的な結果を示しています。代表的FACSプロットは、歯肉（ 図2A、2C）でのライブCD45 ⁺造血細胞を示します。このプロトコルで免疫細胞の単離および処理は 、ex vivoで刺激し、サイトカイン分泌パターンの特徴付けを行うために十分な細胞が得られます。ここでは、定常状態（WT）の総CD45 ⁺細胞でIL-17およびIFN-γ染色を示し、マウスでは（ 図2B - D）（によるLFA欠乏に）歯周炎を呈します。これらのデータは、組織の定常状態（WT）の間とローカル歯（ ^{- / -} LFA）との関...

ディスカッション

現在の技術では、成功した表現型の特徴付けのためだけでなく、ex vivoでの機能研究のためだけではなく、適切な（シングルマウスからの）免疫細胞の多数をもたらします。別のグループは、以前に分離し、マウスの歯肉の免疫細胞を特徴付けるためのプロトコルを公開し、動物モデル⁹における歯周炎の研究で、フローサイトメトリー多色を使用しての値を導入していました。このプロトコルでキー変更のトラブルシューティング、かなり後には歯肉襟エリアと歯間歯肉（ 図1）の両方が含まれるために、組織の全体ブロックの解剖を含めることでした。単独で、歯肉切開して、多くの場合、全層フラップが達成されないと歯肉の一部は、特に歯間地域でミスしました。このアプローチを使用して、収集した免疫細胞の数が大幅に増加しています。また、この手法は、歯肉組織の最適な分離のために、両方の上顎anから可能にD下顎。

このプロトコルの重要なステップは、歯肉領域の保守的な解剖と解剖の効率的なレートが含まれます。具体的には、組織のブロックは、最小限の歯の周りの組織（歯肉）とな...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ファインハサミ	ファインサイエンスツール	14058-11
ハンドル#3	サイエンスツール	10003-12
ブレード#10	サイエンスツール	10010-00
スプリンター鉗子	Integra Miltex	6-304
通常の斜角付き針	BDメディカル	305109	27 G、長さ12.7 mm
Monoject シリンジ	Covidien	8881513934	ルアーロックチップ、3 ml
PBS、pH 7.4	ライフテクノロジー	10010-049	カルシウムおよびマグネシウムなし
RPMI 1640	ロンザ	12-167F	L-グルタミンなし
DNase I 牛膵臓	Sigma-Aldrich	DN25-1G
コラゲナーゼIV型	Gibco(ライフテクノロジーズ製)	17104-019
ウシ胎児血清	ジェミニバイオ製品	100-106
タマイシン50 mg / ml	品質生物学的	120-098-661EA
ペン連鎖球菌	Gibco(ライフテクノロジーズ製)	15140-122
L-グルタミン	ギブコ(ライフテクノロジーズ製)	25030-081
0.5 M EDTA pH 8.0	品質	351-027-721EA
50 ml チューブ	Corning	352070	ポリプロピレン、滅菌
70 μM細胞ストレーナー	コーニング	352350
シャーレ	コーニング	351029	滅菌
5 ml FACS チューブ	コーニング	352052	滅菌
BD GolgiPlug	BD バイオサイエンス	555029	ブレフェルジン A 溶液
ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)	シグマ-アルドリッチ	P8139
イオノマイシン カルシウム塩が含まれています	Sigma-Aldrich	13909
Saponin from quillaja bark	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Life Technologies	L34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450	eBioscience	48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APCeFluor 780	eBioscience	47-5961-82
アンチマウスガンマデルタ TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
アンチマウスIL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
アンチマウスIFN-&γ;PE	eBioscience	11-5931-82
アンチマウス NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
アンチマウス CD90.2 APC eFluor 780	eBioscience	47-0902-82
アンチマウス CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
アンチマウス CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
アンチマウス CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
抗マウス CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
抗マウス TCR ベータ FITC	eBioscience	11-5961-82
抗マウス Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
抗マウス Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104