軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

サマリー

光学顕微鏡技術と生化学的アッセイを組み合わせることで、ネトリン依存性軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの関与を解明します。この技術の組み合わせにより、軸索の分岐と細胞形状の変化を制御する分子メカニズムの同定が可能になります。

要約

神経発達中、成長する軸索は軸索枝を精緻化することにより、複数のシナプスパートナーに広がります。軸索の分岐は、ネトリン-1のような細胞外誘導の手がかりによって促進され、軸索原形質膜の表面積が劇的に増加します。ネトリン-1依存性軸索の分岐には、原形質膜の膨張の時間的および空間的制御が含まれている可能性が高く、その成分はエキソサイトーシス小胞融合を通じて供給されます。これらの融合事象は、VAMP2(小胞関連膜タンパク質2)などのv-SNAREと、原形質膜t-SNAREであるシンタキシン-1およびSNAP25(シナプトソーム関連タンパク質25)を含むSNARE複合体の形成に先行します。本明細書で詳述されているのは、軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの役割を調べるために使用される多面的なアプローチである。この組み合わせたアプローチの強みは、個々のニューロンにおける単一の小胞融合イベントのダイナミクスから、培養ニューロン集団におけるSNARE複合体の形成や軸索の分岐まで、さまざまな空間的および時間的分解能でデータを取得できることです。このプロトコルは、pH感受性GFP(VAMP2-pHlourin)でタグ付けされたVAMP2を発現する皮質ニューロンの内因性SNARE複合体および全反射蛍光(TIRF)顕微鏡法のアッセイレベルに対する確立された生化学的アプローチを利用して、個々のニューロンのエキソサイト活性におけるネトリン-1依存性の変化を特定します。ネトリン-1依存的な分岐のタイミングを解明するために、単一ニューロンの時間単位にわたるタイムラプス微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡法が利用されます。固定細胞免疫蛍光法と、SNARE機構を切断し、エキソサイトーシスをブロックするボツリヌス神経毒との組み合わせは、ネトリン-1依存性軸索分岐がSNAREを介したエキソサイトーシス活性を必要とすることを示しています。

概要

最近の推定では、人間の脳には10¹¹のニューロンと10¹⁴のシナプ^{ス結合が含まれている}ことが示唆されており、生体内での軸索分岐の重要性が強調されています。ネトリン-1などの細胞外軸索誘導手がかりは、軸索を適切なシナプスパートナーに導き、軸索の分岐を刺激し、それによってシナプス容量を増加させます^2-5。ネトリン-1依存性軸索分枝化には、かなりの原形質^膜拡張6が関与し、SNARE複合体依存性エキソサイトー^シス小胞融合7を介した追加の膜成分の送達が必要であると仮定しました。

ネトリン-1依存性軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの役割の調査は、いくつかの要因によって複雑化しています。まず、皮質ニューロンの不均一性は、有意な影響を特定するために必要なサンプルサイズを増加させ、イメージングのようなシングルセル技術を複雑にします。第二に、生化学的手法は集団レベルで発生する変化の観察を可能にしますが、軸索分岐の時間枠で軸索への原形質膜の拡大を局在化するために必要な時間的および空間的解像度を欠いています。最後に、軸索の枝は数時間で形成されますが、軸索の伸展に寄与する細胞の変化は数分以内に始まり、数秒のオーダーで発生する可能性があるため、実験的検討の時間的範囲が広がります。

私たちは、これらの多様な時間的および空間的なスケールのエキソサイトーシスと軸索分岐に対処するためのマルチテクニックアプローチを概説し、したがって基本的な細胞メカニズムの理解を深めます。これらのアプローチを利用することで、軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの重要な役割を裏付ける証拠が得られます。

プロトコル

研究倫理の声明 ：本明細書に詳述動物に関わる全ての実験は、動物管理上および実験動物の管理と使用のためのNIHの基準にルールやUNC委員会の規制の対象となっています。

1.準備と解離皮質ニューロンのメッキ

1. 頸椎脱臼に続いてCO ₂吸入によって時限妊娠雌を安楽死させます。各半球から胎生15.5（E15.5）マウスと顕微解剖皮質の頭蓋骨から全脳を削除してください。マウス胎児皮質の顕微解剖に関する詳細な手順についてはViesselmann ら ^8を参照^してください。
2. 滅菌1.6ミリリットルマイクロチューブに解剖培地1mlには4つ以上の皮質を置きません。 10倍のトリプシンの120μlを添加して、チューブを3反転 - 混合するために5回。
3. 血球計数器を用いて、細胞を細胞培養皿に播種するために数えます。注：1皮質半球が提供するAPPRoximately300万細胞。
   1. SDS耐性SNARE複雑な生化学アッセイのために、35mmディッシュあたり600万細胞をプレーし、条件ごとに2つの皿を利用しています。注：これは、複数の条件を比較する場合、6ウェルプレートを使用することによって簡略化されます。
   2. 分岐アッセイのために、硝酸のプレートニューロン150,000の密度で軸索分岐プレートのDICイメージングのために、35mmディッシュ当たり250,000細胞の密度で、円形のカバースリップを洗浄しました。これらの密度が過密状態を回避し、分析を簡素化します。
4. 生細胞TIRF顕微鏡検査のために、室温でヌクレオ溶液中にトランスフェクションあたり200万ニューロンを再懸濁します。
   1. メーカープロトコル⁹に記載^のヌクレオとVAMP2-pHlourin発現プラスミドおよびエレクトロポレーションの10μgのを含むマイクロチューブに100μlの細胞懸濁液を追加します。
   2. トランスフェクションは、すぐにトリプシン焼入れメディアの500μlのを追加した後、書斎でキュベットやプレートの細胞からサスペンションを削除35ミリメートルPDLでコーティングされたガラスボトムディッシュ40万セルのsity。
5. プレート無血清培地2ml中のすべての皮質ニューロン。

2. SNARE複合体形成アッセイ

注：SDS耐性SNARE複合体を処理し、元々以下に詳述する変更を加えて^10に記載のように分析しました。ここで使用されるものに検証代替抗体について、材料のセクションを参照してください。

1. E15.5皮質ニューロンを溶解の前に1時間250 ngの/ mlのネトリン-1または偽制御を用いたin vitro（DIV）で 2日間を刺激します。
2. 処理サンプルを、37℃に4℃に冷却し、遠心分離し、設定した水浴温度、100℃に加熱ブロックの前に。
3. インキュベーターから細胞皿を削除し、氷上に置きます。
   1. 吸引細胞からの培地、〜2ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1のためのやさしく2回交換してください - 洗浄あたり2分。
   2. このアッセイのためには、condにつき2つのウェルを使用ition。
   3. 条件の最初のウェルから吸引し、PBSおよび250μlの均質化緩衝液と交換してください。氷上で5分間のままにして、[セルリフターを使用して、氷上で細胞を均質化。
   4. 同じ条件の次のウェルからPBSを吸引し、ウェルに最近均質化し、混合物を追加します。これは、タンパク質濃度を増加させます。すべての条件のために繰り返します。
   5. 完了時に、ピペットは氷上で予め冷却した1.6 mlのマイクロチューブに溶液を均質化し、1％トリトンX-100の最終濃度に達するように、20％トリトンX-100を加えます。気泡を最小限に抑えながら、1,000μlのピペットで10回混合粉砕します。
4. タンパク質を可溶化するために2分間氷上でチューブをインキュベートします。非可溶化物質をペレット化するためのインキュベーション、4℃で6010 RCFで10分間遠心分離に続いて。氷の上に新しいチルド1.6ミリリットルチューブに溶解物上清を移動します。
5. Bradfordアッセイ^11を使用して^、タンパク質濃度分析を行い、FINAにサンプルを希釈します1％トリトンX-100およびB-メルカプトエタノール（BME）を補充した5×試料緩衝液を補充した均質化緩衝液を残りとmlの5ミリグラム/ - 3のLタンパク質濃度。
6. 2チューブに均等に各実験サンプルを分割します。 30分（SNAREモノマー）を100℃で1 30分間37℃でサンプル（SNARE複合体）、および他のインキュベート。溶液中でサンプルを維持するために断続的にチューブを反転。
7. SDS-PAGEを介して分離する準備ができるまで-20℃でサンプルを凍結します。 100℃で5分間煮沸し、以前のサンプルリボイル、標準的な技術を用いて、電気泳動を介してサンプルを実行する前に、ただし室温で37°Cのサンプルを解凍。
8. サンプル（30 - サンプルあたり40μgのタンパク質）の複製を実行し、8％、15％ゲルの両方で。 15％がSNAREタンパク質モノマー（SNAP-25〜25kDa、VAMP2〜18kDa、シンタキシン-1〜35kDa）を定量化するために使用されるのに対し、8％は、複合体の理想的な分離を提供します。染料ラインがSTAC経由になるまで70 Vで電源を維持します王ゲルと90Vに電圧を増加させます。色素がオフに実行されるまでゲルを実行します。
9. モノマーを維持するために、45分間70 Vで、20％のメタノール（MeOH）で追加されたとコールド転送バッファを使用して氷の上に0.2μmのニトロセルロース膜にタンパク質を移します。
10. 室温でO / N（O / Nが最良の結果を提供します）に2時間覆われた皿の中で乾燥した膜。
11. RTで1時間、10％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックSNARE複合膜。
12. ロータリーシェーカー上で4℃で1,000プローブO / N：1の希釈で（特定のSNARE複合体の構成要素を認識する）一次抗体を準備します。
    1. トリス緩衝生理食塩水+ 0.1％のTween-20（TBS-T）で5分間3回ずつでブロットを洗浄します。
13. RTで覆われて1時間、のためのTBS-Tとプローブ20,000 1％のBSA：1の希釈で蛍光二次抗体溶液を準備します。 1時間後に繰り返し、ステップ2.12.1。
14. 蛍光スキャニングマシン上の画像ブロットは、ソフトウェアスイートを搭載し、SNAREタンパク質の共同の両方を定量化矩形のROIを描画するための製造元の指示を使用して（それぞれ25キロダルトン、18キロダルトン、SNAP-25、VAMP2のための35キロダルトンでの免疫反応性バンドとシンタキシン-1、）mplex（40kDaの上記免疫反応性バンド）とモノマーバンド。

TIRF顕微鏡を介した3イメージングエキソサイトーシスのイベント

注：このプロトコルは、温度、湿度、CO _2を維持するための環境室を含む特殊な顕微鏡装置、落射蛍光照明を装備した倒立TIRF顕微鏡、高倍率/高開口数（NA）TIRF対物、自動化されたXYZステージを必要とし、敏感な電荷結合素子（CCD）検出器。このプロトコルは、100×1.49NA TIRF目的ソリッドステート491 nmのレーザー、電子増倍CCD（EM-CCD）を搭載した完全自動化倒立顕微鏡を使用しています。すべての装置は、撮像及びレーザ制御ソフトウェアにより制御されます。開始前にENVIR上の撮影プロトコルのパワーonmental室、ステージ、ランプ、コンピュータ、およびカメラ。

1. イメージングソフトウェア内で目的を選択します。目的が配置されると、襟周り客観ヒーターを固定します。
2. その目的は、ステージスロットにステージインキュベーターを固定する前に完全に低下させることを確認します。流出を防ぐために均等にステージインキュベーターインレットに蒸留水を注ぎます。
3. インキュベーションシステムの電源をオンにします。 CO ₂タンクにバルブを開き、圧力を製造者の指示に従ってシステムに適していることを確認します。チャンバーを5％CO _2、37℃に到達するためにいくつかの時間を許可します。イメージング皿を追加する前に、客観的に水の凝縮を避けるために、インキュベーターで、空の皿を置きます。
4. レーザ光源の電源をオンにします。
5. オープンステージインキュベーターやレンズにイマージョンオイルを追加します。インキュベーターでサンプルを置き、安定性の腕や皿の重量で安定化させます。油はサンプルの底部に接触するまで目的を上げます。 Switc透過光照明に時間と接眼レンズを介して神経細胞の焦点面を見つけます。
6. レーザーソフトウェアを起動し、レーザ制御ソフトウェアに接続します。広視野と目的が使用されているselectする照明を設定します（100×1.49 NA TIRFが推奨されます）。試料の屈折率（〜1.38細胞）を設定します。 491 nmレーザーのための「TTL」をオフにして、レーザ強度​​を調整します。 40％ - 20の間の値までそれを持ち帰るその後100にスライダーを調整します。 「TTL」を再確認してください。
7. 透過光照明で再びサンプルに焦点を当てています。イメージングソフトウェアに移動し、491 nmのレーザー照射とオープンシャッターを選択します。ファイン天井にレーザーの焦点を調整し、除去冷却器を備えた閉じた視野絞りの中心にポイントを中央に配置します。光学ベンチ上で逆さまに凝縮器を置き、ない傷レンズのように。
8. コンデンサーを交換し、110 nmのTIRFソフトウェアと設定浸透深さ（PD）にアクセスしてください。 TIRFイルミネーションに広視野照明からの切り替えイメージングのためネーションモード。
9. 落射蛍光光源と広視野落射蛍光を使用して、接眼レンズを通して発現細胞VAMP2-phluorinを探します。
   1. 光退色を低減するために、最小限の露光時間及びレーザ強度​​を使用して、ノイズ比とダイナミックレンジに信号を最大化するために、撮像パラメータ（露光時間、ゲインおよびレーザパワー）を調整し、光毒性（例：50の間に露出 - 30から15と100ミリ秒、 30％、最大レーザー出力での利得）。
   2. セル当たりの連続オートフォーカスを設定します。 5分ごとに0.5秒を発生買収で設定タイムラプス画像を取得。ネトリン-1の場合は層流フード内で細胞の皿に500 ngの/ mlのネトリン1を追加し、イメージングの前に1時間インキュベーターに皿を返し、条件を刺激しました。
10. 、ImageJので開い画像スタック> [開く]> [ファイル名（ 図をウィンドウにファイルをドラッグするか、ファイルに行くことによって、セル領域および時間当たりに標準化エキソサイトーシス事象の頻度を定量化するために、0; 2A挿入図1）。
    1. 平均強度：小胞融合事​​象を表すものではありません安定した蛍光シグナルを削除するには、イメージ>スタック> Z-プロジェクト>投影タイプを使用してスタック全体の平均zの投影を作成します。画像1>これはプロセス>イメージ電卓を使用して、微速度撮影で各画像から画像を意味減算：あなたのスタック操作：画像2新しく作成された平均zの投影を引きます。これは、エキソサイトーシス事象（ - 3図2A挿入図2）を強調しています。
    2. 目でエキソサイトーシス融合イベントをカウントします。エキソサイトーシスイベントはVAMP2-phluorinが原形質膜（ 図2A挿入図6）内に拡散するように急速に拡散する回折限界の蛍光シグナルの出現として定義されます。
    3. 全細胞は、しきい値が（ - 8図2A挿入図7）をハイライト表示されるまでスライダーを調整>しきい値>調整>画像を使用して最初の画像を強調表示するしきい値コマンドを使用します。
    4. アナの下でlyze、SetMeasurementsを選択し、エリアと表示ラベルを確認してください。 （ - 8図2A挿入図7）を測定するために杖トレースツールとプレス'M'を使用して閾値処理の細胞領域を選択します。
    5. 両方のエキソサイトーシス融合事象カウント転送、スプレッドシートのセルの面積の測定、および経過撮像時間はエキソサイトーシスイベント/ ² /時間の数（ 図2A挿入図9）を算出します。

4.微分干渉コントラスト（DIC）軸索分岐のタイムラプス顕微鏡

注：DICイメージングへの一般的なアプローチのための完全なプロトコルとデモは¹²利用可能です。このプロトコルは、DICを利用しながら、他の透過光顕微鏡法は、（例：位相コントラスト）を同じ目的のために使用することができます。

1. 2 DIV、多湿のenvを維持するために、予め温めておいた環境室でトランスフェクトしていないニューロンを含む場所のガラスボトムイメージング皿で5％CO _2、37℃でironment。 60Xプラン・アポクロマート、1.4 NA DIC対物レンズと最高の画質と解像度のための高NA凝縮器を備えた顕微鏡を利用しています。
2. 透過光照明を用いた接眼レンズを介して神経細胞を見つけるために、焦点面を調整します。
3. イメージングソフトウェア上のマルチ領域取得機能を使用して、少なくとも6個の細胞のXYZの場所を見つけて、保存します。最良の結果を得るための視野内の関心のフィットのニューロンようにステージを配置します。
   1. 「多領域取得を開始」の250ng / mlのネトリン1を押して刺激します。順次、必​​要に応じて取得し、リフォーカスを一時停止し、24時間、それぞれの位置で20秒ごとに画像を取得します。
4. 多次元データ>開いているファイル名を確認します>アプリケーションを使用して、イメージングソフトウェアで画像を確認します。イメージングセッションの間に形成安定した軸索の枝（長さ20μm）を特定します。 stableaxonのbrancを測定するために、ライン描画ツールを使用します先端に軸索の塩基からhが20μmの長の資格を満たしていることを確認します。
   1. 膜突起が発生期の枝の長さは20ミクロンに達したときに枝が後だけでなく、ネトリン刺激後のフレーム番号を形成する領域で開始すると、スプレッドシートでは、ネトリン刺激後のフレーム番号を記録します。
   2. 枝あたりの形成時間を計算するために20秒によって突起部と分岐形成との間のフレーム数を掛けます。

5.毒素操作および固定細胞の免疫蛍光

1. 2 DIVで、切断するSNAREタンパク質SNAP25、250 ngの/ mlのネトリン-1および/ ​​または10 nMのボツリヌス毒素（BONTA）と実験条件でニューロンを治療し、効果的にSNARE媒介エキソサイトーシス^13、プラス250 ngの/ mlのnetrin-を阻害します1。制御条件として、未処理のニューロンの1組にしておきます。
   注意：準備と使用しているときBONTAが目や呼吸保護具を使用する必要がありますソリューション。できるだけ早くバイオハザード材料、オートクレーブなど、すべての汚染物質を維持します。
2. 3 DIV（24時間後の治療）培地を吸引し、直ちにPHEMの修正（詳細は表1を参照）の少なくとも1ミリリットルと交換し、37℃に温めました。室温で暗所で20分間インキュベートします。
3. （4℃でパラフィルムや店舗での将来の使用のシール用）をPBSで3回洗浄します。
4. 場所の暗い加湿染色チャンバ内のカバースリップと（10％トリトンX-100ストックから作られる）、PBS中の新たに希釈し、0.2％トリトンX-100で10分間、細胞膜を透過性。
5. 透過性溶液を除去し、PBSで1×50μlのですすいでください。で30分間ブロック〜PBS（BSA-PBS）中の10％ウシ血清アルブミンの50μlあるいは10％を室温でPBS中にロバ血清を煮。
6. 再び1×PBSですすいでください。 RTで1時間、1％BSA-PBSで：（ニューロンの身元を確認するために千βIIIチューブリン、1）一次抗体50μlの中でカバースリップをインキュベート、 暗闇で。
7. PBS中で3×5分の洗浄を行います。チューブリン（1：400）のためのスペクトル的に別個の二次抗体50μlのカバースリップをインキュベートし、蛍光ファロイジン（励起によって異なります：100 1で488ファロイジン：400、647ファロイジン1時）1時間1％BSA-PBSで。
8. 1×PBSで洗浄3×5分とメディアのマウントにスライド上にカバースリップをマウントします。
9. 明確なマニキュアでカバーガラスとシールの縁からメディアをマウント真空過剰。
10. 40X 1.4NAの対物レンズ、落射蛍光機能とEM-CCDと倒立顕微鏡に広視野落射蛍光画像を収集します。
    1. 手動でのImageJを使用して分岐分析します。ウィンドウにファイルをドラッグするか、> [開く]> [ファイル名（ 図4A挿入図1）をファイルに行くことによってImageJので開く画像スタック。
    2. ライン>セグメント化ラインを使用すると、ソーマ（ - 3、図4Aの挿入図2）から延びる最も長い神経突起のように定義された軸索を、トレースします。
    3. 分析>ツール> ROI Managerを使用して、関心領域としてトレース軸索を保存します。長さの神経突起≥20μmのように定義された各軸索の枝を、トレースして保存します。分析（ - 4図4Aの挿入図3）中の（直接軸索から発芽増殖物）のみの一次枝が含まれます。
    4. 押して「m」は、目的の保存された領域を測定し、マイクロメートルの長さを計算するためにスプレッドシートに画素の長さを転送します。
    5. 100μmの長さ当たりの軸索分岐の数を取得するために、100で割ったμm単位の軸索の長さで、長さが≥20μmの軸索分岐の数を割ります。

結果

神経細胞の集団におけるSDS耐性SNARE複合体の量を測定するためにインビトロ生化学的手法に活用。 図1は、SNAP-25、syntaxin1AとVAMP2についてプローブSDS耐性SNARE複合体アッセイの完了後、得られたウエスタンブロットを示しています。

基底細胞膜にTIRF顕微鏡法は、単一のセル内の個々のエキソサイトーシス融合事象の高解像度の画像を提供する。 図2Aは、VAMP2-phluorin媒介エキソサイトーシスイベントを識別するための画像解析手法を示します。小胞の融合が起こるように挿入図は、単一のエキソサイトーシスイベントを示し、VAMP2-phluorinは、原形質膜中に拡散するように。 図2Bは、皮質ニューロンの時間（秒）に発生したエキソサイトーシスイベントの例を示しています。ズームインセットはソー...

ディスカッション

軸索の分岐は基本的な神経発達プロセスであり、哺乳類の神経系の広大な神経接続を支えています。局所的な原形質膜拡張に関与するメカニズムを理解することは、正常な神経発達と病理学的神経発達の両方を理解するために不可欠です。集団レベルと単一細胞レベルの両方の方法論を組み込んだ多面的なアプローチを使用すると、集団レベルの分析を損なうことなく再現性が向上し、空間的および時間的分解能が向上します。単一細胞レベルでは、固定細胞アプローチと生細胞アプローチの両方を利用してネトリン依存性軸索分岐を調べることで、複数の実験にわたって大きなサンプルサイズを収集できること、DICイメージングによる時間分解能、TIRF顕微鏡を使用したエキソサイトーシス融合の時空間分解能という3倍の利点が得られます。

SDS耐性SNARE複合体アッセイは、培養中の皮質ニューロンの不均一性を説明するSNARE活性の測定を可能にします。SNARE複合体は非常に安定しています。一方、他のほとんどのタンパク質複合体は、SDSの添加によって解離します。SNARE複合体はSDS耐性がありますが、耐熱性はありません。この特性により、SNAR...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェル組織培養処理プレート	オリンパスプラスチック	25-105
ガラスカバースリップ	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-81	12CIR-1.5; 硝酸を24時間処理し、脱イオン水で2回すすぎ、使用前に乾燥させる必要があります。1 mg/mLのポリ-d-リジンでコーティングし、細胞をプレーティングする前にすすぐ必要があります。
Amaxaヌクレオフェクション溶液	ロンザ	VPG-1001	100 ml/トランスフェクション
アマクサヌクレオフェクター/エレクトロポレーター	ロンザ		プログラム O-005
35 mm ガラス底 ライブセルイメージングディッシュ	マテックコーポレーション	p356-1.5-14-C	1mg/ml ポリ-d-リジンでコーティングし、細胞をめっきする前にすすぐ必要があります
オリンパス IX81-ZDC2 倒立顕微鏡	オリンパス
ラムダ LS キセノンランプ	サッターインスツルメンツ カンパニー
環境ステージ トップインキュベーター	東海ヒット
100x 1.49 NA TIRF 対物レンズ	オリンパス
アンドール iXon EM-CCD	アンドール
オデッセイ リコー 赤外線イメージングシステム	LI-COR	オデッセイ CL-X	スキャニングブロットに使用
画像スタジオソフトウェアスイート	LI-COR		Odyssey Infraredシステムでのスキャンに使用されます。
オリンパス	モレキュラー デバイス、LLC	バージョン7.7.6.0	DICタイムラプスの全てのイメージングと解析に使用されるソフトウェア
CELL TIRF制御ソフトウェア	リンパス		TIRFイメージング用レーザー制御に使用されるソフトウェア
フィジー(画像J)	NIH	ImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA対物レンズ	オリンパス
40x 1.4 NA プラン アポクロマート対物	オリンパス
ニューロバサル培地	GIBCO	21103-049	無血清およびトリプシン消光培地の両方のためのベース溶液
サプリメント B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml 無血清培地およびトリプシンクエンチング培地
L-グルタミン		35050-061	1 ml/50 ml 無血清培地
ウシ血清アルブミン	バイオベーシックインボルテーテッド	9048-46-8	10%溶液、1x PBS含有、ブロッキングカバースリップ用、TBS-T含有5%溶液、ニトロセルロース膜のブロッキング用。
10x  トリプシン	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-Cl
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
ウシ胎児血清	Corning/CELLGRO	35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	フィッシャー科学	BP358-10
EGTA	フィッシャー科学	CAS67-42-5
MgCl2	>フィッシャー科学	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	フィッシャー科学	BP152-5
N-没食子酸プロピル	MP Biomedicals 102747
グリセロール測光グレード	Acros Organics	18469-5000
グリセロール(非光学グレード)	フィッシャー科学	CAS56-81-5
B-メルカプトエトナール	フィッシャー科学	BP176-100
SDS	フィッシャー科学	BP166-500
蒸留水	GIBCO	152340-147
Poly-D-Lysine	Sigma	p-7886	水に 1 mg/mL
ボツリヌス菌 A 毒素 BoNTA	リスト 生物学研究所	128-A
ウサギ ポリクローナル抗ヒト VAMP2	細胞シグナル伝達	11829
マウス モノクローナル抗ラット Syntaxin1A	Santa Cruz Biotechnology	sc-12736
ヤギのポリクローナル反人間SNAP-25	サンタクルス	バイオテクノロジーsc-7538
マウスモノクローナル抗ヒト&β;III-チューブリン	コーヴァンス	MMS-435P
Alexa Fluor 568 および Alexa Fluor 488 ファロイジン、または Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-色素二次抗体	LI-COR	P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022	800 ロバ アンチマウス, 680 ロバ アンチ ウサギ, 680 ロバ アンチ ヤギ
0.2 μm孔径ニトロセルロース膜	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
メタノール	Fisher 科学	S25426A
ブロムフェノールブルー	シグマ	B5525-5G
ショ糖	Fisher 科学	S6-212
パラホルムアルデヒド	フィッシャー 科学	O-4042-500
Triton-X100	フィッシャー科学	BP151-500
TEMED	フィッシャー科学	BP150-20
40% ビスアクリルミド	フィッシャー科学	BP1408-1
名前	企業名	カタログ番号	strongコメント
>Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone	Sigma Aldrich	S0664
マウスモノクローナルシナプトレビン2(VAMP2)	シナプスシステム	104-211
モノクローナルSNAP25	シナプスシステム	111-011