方法論記事

のトランスクリプトームプロファイリング生体内で産ウシ着床前の胚

DOI：

10.3791/53754

⸱

2017年1月30日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry, 3Laboratory of Functional Genomics of Early Embryonic Development, Université Laval

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マイクロアレイ技術は、ゲノム全体に基づいて転写産物の定量的測定と遺伝子発現プロファイリングを可能にします。したがって、このプロトコルでは、7日目のウシ胚を使用した2色のカスタムメイドウシアレイで最適化された技術的手順を提供し、少量の全RNAを使用することの実現可能性を実証します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

初期の胚喪失は、牛の不妊症の大きな原因です。さらに、ウシは、それらの類似した発生過程のために、ヒトの着床前胚発生を研究するための興味深いモデルになります。遺伝的要因が初期胚発生に影響を与えることは知られていますが、そのような要因の発見は深刻な課題でした。マイクロアレイ技術により、ゲノム全体にわたる転写産物レベルの定量的測定と遺伝子発現プロファイリングが可能になります。マイクロアレイ実験を計画する際に下さなければならない主な決定事項の1つは、1色アプローチと2色アプローチのどちらを使用するかです。2色設計により、技術的な複製が増加し、ばらつきが最小限に抑えられ、感度と精度が向上するだけでなく、ループ設計が可能になり、共通の参照サンプルが定義されます。マイクロアレイは強力な生物学的ツールですが、その力を弱める可能性のある落とし穴があります。したがって、この技術論文では、RNA抽出、増幅、標識、標識された増幅RNAのアレイへのハイブリダイゼーション、アレイスキャン、および2色分析戦略を使用したデータ解析のための最適化されたプロトコルを示します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高生産乳牛における初期胚損失は、酪農業1、2における主な課題の一つです。牛は、それらの同様の発達過程3、4に対するヒト着床前胚発生を研究するための興味深いモデルとなっています。しかしながら、多くの研究は、ウシ初期胚発生に関与する遺伝子についてのより良い理解が必要です。

1995年5に開発された最初のマイクロアレイ技術から二十年後に、より洗練されたプローブの製造技術の開発は、異なるマイクロアレイプラットフォーム6内との間に印刷エラーとアレイチップのばらつきが減少しました。改善されたマイクロアレイ技術は、初期胚Qに、臨床研究7で、より最近では、この技術の普及応用をもたらしましたualityアセスメント8。

マイクロアレイ技術のために必要な大量の材料は、マイクロアレイ技術は、最初に、このような初期胚発生などの研究分野の番号を入力することができなかった主な理由です。より最近では、RNA増幅法は、直線的にサブナノグラム出発RNA材料9からマイクログラムレベルまでRNAを増幅するために改良されてきました。市場で入手可能ないくつかの市販のRNA増幅キットがあります。しかし、より人気のよく発達したキットが11の方法を駆動リボ単一プライマー等温増幅10およびT7プロモーターに関連しています。最も人気のあるアンチセンスRNA増幅は、5 '末端12にT7プロモーターに連結するオリゴdTプライマーを用いてインビトロ転写を使用します。この技術は、線形増幅F後代表アンチセンス転写物の大部分を維持することができまたはアレイハイブリダイゼーション13。この方法は、ウシの胚8から抽出した全RNAのピコグラムレベルを増幅するように適合されています。

ユニバーサルリンケージシステム（ULS）は、DNAを直接組み込むか、グアニン14のN7位の配位結合を形成することにより、白金リンク蛍光色素シアニン547またはシアニン647のいずれかでRNAを増幅した標識法です。この方法は、アミノアリルに比べて変更することなく、より安定した増幅されたaRNAを生成するために、胚の研究に適合させた酵素法15によって生成されたaRNAを変更しました。単一の色素と2つの色素の両方の標識方法は、マイクロアレイにユニバーサルリンケージシステムを使用して適応されています。大規模なマイクロアレイの比較研究は、6 1次元と2色配列のプラットフォーム間でのデータ品質の良好な相関があるということでした。

最近では、両方のT7プロモータードライブnは、アンチセンスRNA増幅およびULS標識方法は、マイクロアレイハイブリダイゼーション8、16のためのaRNA材料標識高品質の十分な量を生成するために、より信頼性の高いプロトコルを提供するために開発されてきました。そこで、本研究では、一例として、7日目ウシ胚を用いた2色マイクロアレイに関わるデータ解析にRNA抽出からの重要なステップのいくつかを実証するためのプロトコルを提供します。

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プロトコル

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この研究の動物の一部は、アルバータ州の動物実験委員会の大学によって承認され、すべての動物実験手順（プロトコル＃AUP00000131）と代謝研究アルバータ大学の単位、エドモントン、カナダ、で行われ、そして動物は応じての世話をしました。アニマルケアのガイドライン（1993年）のカナダ人評議会へ。

1.胚の生産、全RNAおよびDNアーゼ治療の単離

  1. 動物実験プロトコルおよび胚の収集のために私たちの以前の出版物17、18に参照してください。
  2. プールし、液体窒素中で各乳牛から同様の段階の胚を凍結した後、RNA抽出まで-80℃に保つスナップ。
  3. （キットの情報は材質一覧で利用可能です）ピコ規模なサンプルからRNAを抽出することが可能になり、カラムベースのRNA抽出キットを経由して全RNAを抽出します。
    注：推奨キットが含まれています：コンディショニング・バッファ、抽出BUFをFER、70％エタノール、洗浄バッファー1、洗浄バッファー2、溶出バッファー、収集管とマイクロ遠心チューブを有するRNA精製カラム。
  4. 10μLのExtraction Bufferは、胚を含むチューブに追加し、42℃で30分間インキュベートします。 2分間800×gで遠心分離管をマイクロ遠心チューブに細胞抽出物を収集します。
  5. 精製カラムのフィルター膜上に250μLコンディショニング・バッファをピペット。室温で5分間コンディショニングバッファを有するRNA精製カラムをインキュベートします。 1分間16,000×gでコレクションチューブに精製カラムを遠心します。
  6. ピペットRNA抽出緩衝液および胚の混合物中に70％のエタノールの10μL。ピペッティングによりよく混ぜます。プレコンディショニング精製カラムにピペット混合物。
  7. 100×gで2分間、RNA、遠心分離精製カラムを結合して、すぐに通る流れを除去するために30秒間16,000×gで遠心分離することによって従ってください。
  8. ピペット10081; 8000×gで1分間の精製カラムと遠心への洗浄緩衝液1のL。
    注：DNアーゼ処理は、RNA単離の後、逆転写又は増幅を行う場合にお勧めします。
  9. 右のステップ1.8の後、ゲノムDNAを消化。
    注：推奨のDNaseキットは素材リストで利用可能です。推奨されるキットが含まれています：DNアーゼIストック溶液およびバッファを。
  10. 35μLバッファーで5μLのDNase Iストック溶液を混合することにより、DNアーゼインキュベーション混合物を準備します。静かに転倒混和。
  11. 精製カラムの膜に直接40μLのDNaseインキュベーション混合物をピペット。室温で15分間インキュベートします。
  12. 精製カラム膜へのピペット40μL洗浄緩衝液1、次いで15秒間8000×gで遠心します。
  13. 8,000×gで1分間の精製カラムと遠心にピペットで100μLの洗浄緩衝液2。
  14. 精製カラムと遠心機の中に別の100μLの洗浄緩衝液2をピペット16,000×gで2分間。
  15. 新しい0.5 mlのマイクロ遠心チューブに精製カラムを転送します。直接精製カラムのメンブレン上に溶出バッファーのピペット11μL。溶出緩衝液を分配しながら、膜への溶出バッファーの最大吸収を確実にするために、穏やかに膜の表面にピペットの先端をタッチします。
  16. 室温で1分間カラムをインキュベートします。カラムに溶出バッファーを配布するために千×gで1分間カラムを遠心してから、RNAを溶出するために16,000×gで1分間スピン。
  17. RNAの質と量19を評価するための製造元の指示に従ってバイオアナライザー機器を使用してください。
  18. 使用するまで-80℃でRNAサンプルを保管してください。

2.マイクロアレイ解析のためのRNA増幅とラベリング

注：RNA増幅とラベリング手順で作業初めてのユーザーのために、RNA ALOにスパイクの5 ngのを使用RNA増幅およびハイブリダイゼーションの品質管理測定を監視するために、実際のaRNAサンプルを用いてngの。スパイク中のRNAミックスが所定の割合で10 in vitroで合成し、ポリアデニル化転写物を含んでいます。手順が適切に実行すると、標識された転写物は、具体的にのみ配列中の相補的なコントロールプローブにハイブリダイズしたデータは、最小限の自己または交差ハイブリダイゼーションと品質管理保証を追跡するためにスキャンすることができます。アレイおよびデータ分析をスキャンした後スパイクインコントロール強度と正規化手順についての詳細の説明は、以前の出版物20、21を参照してくださいです。以下の手順は、通常のマイクロアレイユーザに与えられます。

  1. 11μL - 10の全体積で100 pgの高品質なRNAサンプル（RNA完全性番号（RIN）の値は、少なくとも> 7.0）を準備します。
  2. 増幅キットはにできることでRNAサンプルを増幅（100頁わずかとして）ピコスケールのサンプルで動作します。
    注：推奨増幅キット情報は、マテリアルリストで利用可能で、任意の変更を加えることなく、製造元の指示に従います。
  3. 増幅されたaRNAのサイズ範囲のプロファイルを評価するために、蛍光ベースの定量を使用してください。
  4. 増幅されたaRNAの濃度を測定する（260および280 nmの吸光度に基づいて）分光光度計の測定器を使用してください。
  5. 標識のための準備ができるまで-80℃で増幅されたaRNAを保管してください。
  6. ULS aRNAのラベリングキットのユーザーガイドに記載の蛍光標識のために増幅されたRNA2μgのを使用してください。
    注：シアニン547及びシアニン647色素は光劣化及びシアニン647色素に敏感であるので、容易にオゾンによって分解され、標識操作は、光の最小量のオゾンのない環境下で行われます。
  7. オゾンのレベルは0.001 ppm以下になるまで、オゾンボックス（ 図1A）をオンにします。
  8. はシアニン547またはシアニン647、ラベリングバッファーの2μLの2μLを追加することによって、オゾンボックス（ 図1B）内の反応セットアップを行い、その後、セーフライトの下でRNaseフリー水で20μLの最終容量に調整します。光源に暗室フィルタを追加します。
  9. 穏やかに混合し、15分間85℃でサーモサイクラーにチューブをインキュベートします。少なくとも1分間、氷の上に置いてサンプル。 CY-色素標識増幅されたRNAをクリーンアップするために、（1.9から1.11へ）DNase処理に関連する手順を除いて、RNA抽出キットを進める前に、チューブの内容を収集するためにスピンダウン。
  10. 測定および標識された増幅されたRNAの濃度を測定し、使用前に3日間、-80℃の最大で標識したaRNAを維持するために、分光光度計の測定器を使用してください。

3.マイクロアレイハイブリダイゼーションおよび洗浄

注：次の重要なステップは、二色マイクロアレイベースの遺伝子発現解析プロトコル（バージョンに応じて適応されます6.5、2010年5月）。

  1. 各シアニン547-から825 ngの同量のを追加し、シアニン647標識したaRNA及び25Xフラグメンテーションと10倍のブロッキングバッファーと混合します。
  2. 15分間60℃で混合物を加熱し、1分間氷上で冷却します。
  3. 2×ハイブリダイゼーション緩衝液の同量を加え、よく混ぜます。
  4. 13,000 rpmで遠心分離し、次いで混合物は、ハイブリダイゼーションのための準備ができています。
  5. アレイスライド上に混合物から100μLをロードし、ハイブリダイゼーションチャンバ内のスライドをシール。
  6. オーブンで10 rpmで回転させ、65℃で17時間ハイブリダイゼーションオーブンに組み立て室をロードします。
  7. 安定化に浸漬し、30秒のための溶液を乾燥することによりオゾン保護処理とプロトコルに従って配列を洗ってください。
  8. 無塵粒子を溶液からアレイを削除し、アレイ表面が乾燥していることを確認してください

4.スキャンマイクロアレイスライド

  1. 暗い場所で配列を維持し、scannをオンにしますえー（15分の待ち時間）を使用する準備ができるまで。
  2. スキャナーに、左側の列のバーコードをロードし、スキャンを開始します。ソフトウェアのユーザーガイドに従ってスポット分析を行うと（GPR）ファイル形式としてデータを保存します。

5.統計解析

  1. FlexArrayソフトウェアをダウンロードhttp://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php「輸入生データ」をクリックし、FlexArrayにGPRファイルをロードします。
  2. 必要に応じて指示に従うことによって正規化および統計分析を実行します。注：それは以前に22に記載されたように、本研究ではポジティブスポット選択のためのしきい値を計算します。
  3. すべてのハイブリダイズしたスポットやバックグラウンド信号を表示するFlexArrayのプロットビューアから手動ドロップダウンを選択します。注：マイクロアレイへのハイブリダイゼーション後のコントロールにスパイクの同様の絵は、以前の研究8で見ることができます。
  4. 選択しますFlexArrayからのアレイの正規化プロセスの間に変位することにより、以下の配列内の黄土正規化は、それに応じてマニュアルをドロップダウン。
  5. エクスポート、他の用途のためのExcelファイルにFlexArrayからすべての正規化されたデータ。

6.バイオインフォマティクス解析

ウシ胚特異的転写産物からのプローブ配列の元の注釈は（BESTv1）マイクロアレイは8以前に記載されています。本研究では、20403ユニークな遺伝子シンボル（GS）は、（得られたFile1のサプリメント EmbryoGENEラボラトリー情報管理システム（LIMS）ELMA（http://elma.embryo-gene.ca）を介して）。 6765ユニークな遺伝子（のリストはFile2の補足 ）（マイクロアレイ正規化処理後に選択し、すべての正の信号に対応したステップ50.5）ウシの7日目の胚の遺伝子発現プロファイルから。陽性シグナル閾値はA値の信号強度から透過刊行16に基づいて計算しました。

  1. 分類システム23、24 PANTHER（進化的関係を通じてタンパク質解析）との機能解析を実行するには、以下のリンク（http://www.pantherdb.org/about.jsp）を開きます。
  2. 統計的な過剰発現試験を用いて、胚発生の間に特定の生物学的プロセスを特定し、参照リスト25のようにボスの牡牛座 （データベース内のすべての遺伝子）のデフォルト設定を使用するように6765胚特異的GSのリストをアップロードします。
    注：これは統計的に過剰または過少発現二項検定を使用しているGOタームから進化の関連プロセスの識別を可能にします。
  3. ソフトウェアのデフォルトとして<0.05でP値のしきい値を設定します。データがダウンロードされ、博覧会することができますさらなる選択16用のExcelファイルにRTED。

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結果

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7日目のウシ胚からの総RNAを、増幅のaRNAの代表的な結果を図3に示し、 表1に要約します。

RNAの完全性およびプロファイルは、RNA抽出後に評価することができます。 RNAの品質評価は、バイオアナライザー装置（ 図3A）によって行うことができ、7.0より高いRIN値を有するサンプルのみを増幅した（ 表1）に使用する修飾されています。

増幅されたRNAの質と量は、増幅後に評価されるべきです。増幅されたRNAプロファイルと適切なサイズ範囲の類似性は、品質管理（ 図3B）のための主要な要因です。 2ラウンドの増幅後、増幅されたR...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

7日目のウシの胚を用いてマイクロアレイ解析を行うための第一の問題は、遺伝子発現を研究するため、高品質のRNAの十分な量を取得していません。伝統的なフェノール/クロロホルムRNA抽出およびエタノール沈殿法は、低収量およびRNA増幅反応を阻害する可能性の残りのフェノールが得られ、7日目の胚にはお勧めできません。代わりに、標準的な列ベースの方法は、全RNAを単離し、その後、濃度を増加させるために、最小溶出緩衝液を用いてRNAを溶出する方がよいです。胚当たりの全RNAの780頁の平均値は、同一の方法論26、現在使用されるのと同じRNA抽出キット27、28を用いて他のレポートに匹敵する現在の研究で得られました。 RNA抽出のためには、徹底的に混合して使用する前に、沈殿物を溶解または再溶解抽出バッファーの前に抽出緩衝液バイアルを暖めることをお勧めします使用しています。また、インキュベーション時間は、抽出工程中のRNA収量のためにも重要です。 42℃で完全な30分未満のインキュベーショ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

研究は、アルバータ州畜産食肉局、アルバータ州イノベーション - BioSolutions、アルバータ州牛乳、およびアルバータ州農林業省の家畜研究支部によって支援されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PicoPure RNA Isolation KitApplied BiosystemsKIT0204
RNase-Free DNase Set (50)Qiagen79254
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1513
Arcturus RiboAmp HS PLUS KitApplied BiosystemsKIT0505
2100 Bioanalyzer InstrumentsAgilent TechnologiesG2940CA
RNAスクリーンテープAgilent Technologies5067-5576
ULS蛍光ラベリングキットKreatech DiagnosticsEA-021
カスタム遺伝子発現マイクロアレイAgilent TechnologiesG2514F
Agilent Gene Expression 洗浄バッファー 1Agilent TechnologiesPart #5188-5325
Agilent Gene Expression 洗浄バッファー2Agilent TechnologiesPart #5188-5326
2x Hi-RPMハイブリダイゼーションバッファAgilent Technologies Part #5190-0403
25x Fragment bufferAgilent TechnologiesPart #5185-5974
10x GE ブロッキング剤Agilent TechnologiesPart #5188-5281
安定化および乾燥ソリューションAgilent Technologies Part #5185-5979
Agilent SureHyb techonolgyAgilent TechnologiesG2524-60012ガスケットスライド20枚入りパック、4マイクロアレイ/スライド
2色RNAスパイクインキットAgilent Technologies Cat# 5188-5279
GenePix 4000BアレイスキャナーMolecular DevicesGENEPIX 4000B-U
オゾンフリーボックスBioTrayOFB_100x200
GALファイルAgilent Technologies-

参考文献

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